肉桂醛調(diào)節(jié)Shh/Gli1 信號通路對幽門螺旋桿菌胃炎大鼠胃黏膜損傷的影響

黃 方 黃莉璇 吳 彬 李名福 盧長江

幽門螺旋桿菌（Helicobacter pylori，Hp）是一種革蘭氏陰性菌，Hp 感染是胃炎的主要原因[1］。Hp 定植在胃黏膜中誘導(dǎo)顯著的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致慢性感染和胃黏膜組織的持續(xù)損傷[2］。目前，包括甲硝唑、四環(huán)素和其他藥物在內(nèi)的三聯(lián)和四聯(lián)療法對90% 以上的患者有效[3-4］。然而，這種抗生素藥物聯(lián)合治療Hp 感染可能會引起嚴(yán)重的副作用，如腹瀉和惡心，并且Hp 經(jīng)常對藥物產(chǎn)生耐受性[5］。因此，亟待需要治療Hp 誘發(fā)胃炎的新藥物。肉桂醛是肉桂精油的主要成分，具有顯著的抗炎特性[6］。據(jù)報道，肉桂醛對Hp 誘導(dǎo)的胃部炎癥具有抑制作用[7］，但具體機(jī)制尚不完全明確。研究顯示，抑制音猬因子（sonic hedgehog，Shh）/Gli 家族鋅指蛋白1（ Gli family zinc finger protein 1，Gli1）通路可減輕慢性萎縮性胃炎大鼠胃黏膜損傷[8］。本研究主要探究肉桂醛對Hp 誘導(dǎo)的胃炎大鼠胃黏膜損傷的影響及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物及細(xì)胞來源 6 周齡，體質(zhì)量為200～210 g的140 只SPF 級雄性SD 大鼠，購自上海泰楚生物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號為SCXK（滬）2023-0001。所有動物實(shí)驗(yàn)程序均獲得本院實(shí)驗(yàn)動物管理委員會的批準(zhǔn)。人胃黏膜細(xì)胞GES-1 購自通派（上海）生物科技有限公司。

1.2 主要試劑 肉桂醛購自上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司；Hp 菌株購自美國ATCC 公司；替普瑞酮購自衛(wèi)材（中國）藥業(yè)有限公司；Shh 激活劑 Purmorphamine（PUR）購自上海源葉生物科技有限公司；大鼠Hp IgG酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（貨號E-EL-R0487）購自上海恪敏生物科技有限公司；大鼠白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA 試劑盒購自上海臻科生物科技有限公司；兔源一抗Shh、Gli1、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）及辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的羊抗兔二抗均購自英國Abcam 公司。

1.3 方法

1.3.1 動物分組、模型構(gòu)建及給藥 將從140 只大鼠中按照隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)選取18 只為對照組（n=18），剩余大鼠為造模組（n=122）。造模組大鼠采用灌胃1 mL Hp（用生理鹽水將Hp 調(diào)節(jié)至1.5×108CFU/mL）構(gòu)建胃炎大鼠模型，每隔1 d 灌胃1 次，持續(xù)8 周[9］。建模末次處理24 h 后，若大鼠的胃黏膜組織出現(xiàn)病理損傷且血清含有Hp IgG 抗體，則表明造模成功[血清Hp IgG 抗體檢測：使用毛細(xì)管從大鼠眼眶靜脈叢采血，離心（3 000 r/min，10 min）分離血清，使用大鼠Hp IgG ELISA 試劑盒檢測血清Hp IgG 抗體水平］；對照組大鼠以灌胃等量生理鹽水代替Hp，其他同造模過程。造模過程中造模組有3 只大鼠死亡，10 只大鼠造模失敗，共109 只大鼠造模成功，模型成功率為89.34%。取108只造模成功的大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、肉桂醛低劑量組、肉桂醛中劑量組、肉桂醛高劑量組、替普瑞酮組、肉桂醛高劑量+PUR 組，每組18 只。開始給藥處理，肉桂醛低劑量組、肉桂醛中劑量組、肉桂醛高劑量組[10］、替普瑞酮組[11］大鼠分別需灌胃12.5 mg/kg肉桂醛、25 mg/kg 肉桂醛、50 mg/kg 肉桂醛、0.13 g/kg替普瑞酮，且均需腹腔注射等體積的生理鹽水；肉桂醛高劑量+PUR 組[12］大鼠需灌胃50 mg/kg 肉桂醛且還需腹腔注射6.67 mg/kg PUR；對照組、模型組大鼠均需灌胃且腹腔注射等體積的生理鹽水。每天給藥1 次，持續(xù)2 周。

1.3.2 標(biāo)本收集 末次處理24 h 后，每組選取全部大鼠，2% 戊巴比妥鈉麻醉并處死大鼠，沿胃大彎剪開胃組織，將大鼠的胃黏膜組織均分為3 部分，每部分包含6 只大鼠的胃黏膜組織，一部分固定于4%多聚甲醛中用于HE 染色，一部分固定于電鏡固定液用于透射電鏡觀察，最后一部分凍存于-80℃冰箱用于ELISA、Western blot 實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 HE 染色檢測大鼠胃黏膜組織病理變化 將固定于4%多聚甲醛中胃黏膜組織進(jìn)行脫水、透明、石蠟包埋后，切成5 μm 厚的胃黏膜組織石蠟切片。進(jìn)行HE 染色以檢測胃黏膜組織的病理損傷。用光學(xué)顯微鏡觀察結(jié)果。

1.3.4 透射電鏡觀察大鼠胃黏膜細(xì)胞形態(tài) 將用電鏡固定液固定4 h 的胃黏膜組織用磷酸鹽緩沖液洗滌3 次后，加入1% 鋨酸固定2 h，酒精脫水，丙酮和812包埋劑進(jìn)行滲透處理，60℃烤箱聚合48 h，超薄切片機(jī)切成80 nm 超薄切片，對切片進(jìn)行鈾鉛雙染色，室溫干燥后，利用透射電鏡觀察大鼠胃黏膜細(xì)胞形態(tài)。

1.3.5 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 將GES-1 細(xì)胞置于RPMI1640 培養(yǎng)基中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的GES-1 細(xì)胞，分為vitro-對照組、vitro-模型組、vitro-肉桂醛低劑量組、vitro-肉桂醛中劑量組、vitro-肉桂醛高劑量組、vitro-替普瑞酮組、vitro-肉桂醛高劑量+PUR 組。除vitro-對照組外，其他組GES-1 細(xì)胞均需被Hp 感染，具體感染過程：將Hp 用RPMI1640 培養(yǎng)基稀釋成混懸液，濃度為1.0×107CFU/mL，以100∶1 的感染倍數(shù)感染GES-1 細(xì)胞24 h[13］。感染結(jié)束后，進(jìn)行給藥處理，vitro-肉桂醛低劑量組、vitro-肉桂醛中劑量組、vitro-肉桂醛高劑量組[14］、vitro-替普瑞酮組[15］GES-1 細(xì)胞分別用5 μmol/L 肉桂醛、10 μmol/L 肉桂醛、20 μmol/L 肉桂醛、1 μmol/L 替普瑞酮處理24 h；vitro-肉桂醛高劑量+PUR組[16］GES-1 細(xì)胞用20 μmol/L 肉桂醛和1 μmol/L PUR共同處理24 h；vitro-對照組、vitro-模型組GES-1 細(xì)胞不做任何處理。處理結(jié)束后收集各組細(xì)胞或細(xì)胞上清用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.6 細(xì)胞計數(shù)試劑盒-8（cell counting kit-8，CCK-8）法檢測GES-1 細(xì)胞增殖抑制率 調(diào)整GES-1 細(xì)胞的濃度為1×104/mL，取100 μL 細(xì)胞懸液接種于96 孔板中，按照1.3.5 分組進(jìn)行對應(yīng)處理后，每孔加入10 μL CCK-8 試劑孵育2 h。利用酶標(biāo)儀于450 nm 波長處測定每孔的吸光度（OD 值）。并計算細(xì)胞生長抑制率，細(xì)胞生長抑制率（%）=1-（OD 藥物處理組/OD 對照組）×100%。

1.3.7 ELISA 法檢測大鼠胃黏膜組織及GES-1 細(xì)胞上清中IL-1β、TNF-α 水平 嚴(yán)格按照ELISA 試劑盒說明書檢測0.1 g 大鼠胃黏膜組織及500 μL GES-1 細(xì)胞上清中IL-1β、TNF-α 水平。

1.3.8 Western blot 檢測大鼠胃黏膜組織及GES-1 細(xì)胞中Shh、Gli1 蛋白表達(dá) 使用RIPA 裂解緩沖液提取0.1 g 大鼠胃黏膜組織勻漿及500 μL GES-1 細(xì)胞總蛋白質(zhì)。2，2-聯(lián)喹啉-4，4-二甲酸二鈉法檢測蛋白濃度后，取50 μg 蛋白質(zhì)進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，在4°C 下將膜與一抗Shh（1∶3 000）、Gli1（1∶2 000）、GAPDH（1∶5 000）孵育過夜，再與二抗（1∶4 000）共同孵育1 h。加入ECL 試劑可視化蛋白，通過Image J 軟件評估目的蛋白條帶灰度值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 使用SPSS 29.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，符合正態(tài)分布且方差齊性的數(shù)據(jù)以±s表示，使用單因素方差分析進(jìn)行組間比較，進(jìn)一步兩兩間的比較采用SNK-q檢驗(yàn)。P＜ 0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肉桂醛對各組大鼠胃黏膜組織病理變化的影響對照組大鼠胃黏膜組織結(jié)構(gòu)及形態(tài)正常；模型組大鼠胃黏膜變薄，黏膜糜爛且血管明顯，有大量炎性細(xì)胞浸潤；與模型組比較，肉桂醛低劑量組、肉桂醛中劑量組、肉桂醛高劑量組、替普瑞酮組大鼠胃黏膜組織病理損傷有所改善；與肉桂醛高劑量組比較，肉桂醛高劑量+PUR 組大鼠胃黏膜組織病理損傷加劇。見圖1。

圖1 各組大鼠胃黏膜組織病理變化HE染色結(jié)果

2.2 肉桂醛對各組大鼠胃黏膜細(xì)胞形態(tài)的影響 對照組大鼠胃黏膜表面上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)及形態(tài)正常；模型組大鼠胃黏膜表面上皮細(xì)胞固縮，細(xì)胞膜破損，細(xì)胞器腫脹且空泡化；與模型組比較，肉桂醛低劑量組、肉桂醛中劑量組、肉桂醛高劑量組、替普瑞酮組大鼠胃黏膜表面上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)及形態(tài)有所改善；與肉桂醛高劑量組比較，肉桂醛高劑量+PUR 組大鼠胃黏膜表面上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)及形態(tài)破環(huán)嚴(yán)重。見圖2。

圖2 透射電鏡觀察各組大鼠胃黏膜細(xì)胞形態(tài)

2.3 肉桂醛對各組大鼠胃黏膜組織中IL-1β、TNF-α水平的影響 與對照組比較，模型組大鼠胃黏膜組織中IL-1β、TNF-α 水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，肉桂醛低劑量組、肉桂醛中劑量組、肉桂醛高劑量組、替普瑞酮組大鼠胃黏膜組織中IL-1β、TNF-α 水平降低（P＜0.05）；與肉桂醛高劑量組比較，肉桂醛高劑量+PUR 組大鼠胃黏膜組織中IL-1β、TNF-α 水平升高（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠胃黏膜組織中IL-1β、TNF-α水平變化比較（-x±s，n=6）

2.4 肉桂醛對各組大鼠胃黏膜組織中Shh/Gli1信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與對照組比較，模型組大鼠胃黏膜組織中Shh、Gli1 蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）；與模型組比較，肉桂醛低劑量組、肉桂醛中劑量組、肉桂醛高劑量組、替普瑞酮組大鼠胃黏膜組織中Shh、Gli1 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）；與肉桂醛高劑量組比較，肉桂醛高劑量+PUR 組大鼠胃黏膜組織中Shh、Gli1 蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）。見圖3、表2。

表2 各組大鼠胃黏膜組織中Shh、Gli1蛋白表達(dá)變化比較（-x±s，n=6）

圖3 大鼠胃黏膜組織中Shh、Gli1蛋白表達(dá)

2.5 肉桂醛對各組GES-1 細(xì)胞增殖抑制率的影響與vitro-對照組比較，vitro-模型組GES-1 細(xì)胞增殖抑制率升高（P＜0.05）；與vitro-模型組比較，vitro-肉桂醛低劑量組、vitro-肉桂醛中劑量組、vitro-肉桂醛高劑量組、vitro-替普瑞酮組GES-1 細(xì)胞增殖抑制率降低（P＜0.05）；與vitro-肉桂醛高劑量組比較，vitro-肉桂醛高劑量+PUR 組GES-1 細(xì)胞增殖抑制率升高（P＜0.05）。見表3。

表3 各組GES-1細(xì)胞增殖抑制率變化比較（-x±s，n=6）

2.6 肉桂醛對各組GES-1 細(xì)胞上清中IL-1β、TNF-α水平的影響 與vitro-對照組比較，vitro-模型組GES-1 細(xì)胞上清中IL-1β、TNF-α 水平升高（P＜0.05）；與vitro-模型組比較，vitro-肉桂醛低劑量組、vitro-肉桂醛中劑量組、vitro-肉桂醛高劑量組、vitro-替普瑞酮組GES-1 細(xì)胞上清中IL-1β、TNF-α 水平降低（P＜0.05）；與vitro-肉桂醛高劑量組比較，vitro-肉桂醛高劑量+PUR 組GES-1 細(xì)胞上清中IL-1β、TNF-α 水平升高（P＜0.05）。見表4。

2.7 肉桂醛對各組GES-1細(xì)胞中Shh/Gli1信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與vitro-對照組比較，vitro-模型組GES-1 細(xì)胞中Shh、Gli1 蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）；與vitro-模型組比較，vitro-肉桂醛低劑量組、vitro-肉桂醛中劑量組、vitro-肉桂醛高劑量組、vitro-替普瑞酮組GES-1 細(xì)胞中Shh、Gli1 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）；與vitro-肉桂醛高劑量組比較，vitro-肉桂醛高劑量+PUR 組GES-1 細(xì)胞中Shh、Gli1 蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）。見圖4、表5。

表5 各組GES-1細(xì)胞中Shh、Gli1蛋白表達(dá)變化比較（-x±s，n=6）

圖4 各組GES-1細(xì)胞中Shh、Gli1蛋白表達(dá)

3 討論

在Hp 感染期間，宿主產(chǎn)生過度的免疫反應(yīng)可導(dǎo)致胃黏膜損傷的慢性炎癥。Hp 感染引起的炎癥是慢性胃炎、胃潰瘍和胃癌進(jìn)展的關(guān)鍵因素[17］。最近的一項(xiàng)研究顯示，Hp 刺激炎性細(xì)胞因子（尤其是IL-1β 和TNF-α）過量生成，進(jìn)而誘發(fā)慢性胃部炎癥[18］。此外，Hp 感染可通過提高促炎細(xì)胞因子水平來促進(jìn)胃黏膜損傷[19-20］。IL-1β、TNF-α 是常見的促炎細(xì)胞因子，具有加重機(jī)體炎癥反應(yīng)的作用[21］。本研究通過灌胃Hp的方式構(gòu)建胃炎大鼠模型，結(jié)果顯示，在體內(nèi)動物水平上，與對照組比較，模型組大鼠胃黏膜組織中IL-1β、TNF-α 水平升高，胃黏膜表面上皮細(xì)胞固縮，細(xì)胞膜破損，細(xì)胞器腫脹且空泡化，胃黏膜組織病理損傷嚴(yán)重，體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，vitro-模型組GES-1 細(xì)胞活力低于vitro-對照組，細(xì)胞上清中IL-1β、TNF-α 水平高于vitro-對照組，表明Hp 可通過誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)、抑制細(xì)胞活力來造成胃黏膜損傷。

肉桂醛是一種傳統(tǒng)中藥，具有殺菌、抗腫瘤、免疫和抗炎活性[22］。據(jù)報道，肉桂醛可通過抑制炎癥來緩解大鼠高脂肪飲食引起的動脈粥樣硬化[23］；肉桂醛可增強(qiáng)IL-1β 刺激的人軟骨細(xì)胞C28/I2 細(xì)胞活力，抑制炎癥反應(yīng)[24］。以上研究表明肉桂醛具有抗炎的作用。本研究顯示，在體內(nèi)動物水平上，肉桂醛可呈劑量依賴性地抑制Hp 誘導(dǎo)的胃炎大鼠炎癥反應(yīng)和胃黏膜損傷；在體外細(xì)胞水平上，肉桂醛可呈劑量依賴性地增強(qiáng)Hp誘導(dǎo)的GES-1 細(xì)胞活力，抑制炎癥反應(yīng)。此外，替普瑞酮是臨床上常用于治療胃炎的藥物[25］，本研究選取該藥物為陽性藥物，結(jié)果顯示，替普瑞酮與高劑量肉桂醛對Hp 誘導(dǎo)的胃炎大鼠或GES-1 細(xì)胞各指標(biāo)的影響差異無統(tǒng)計學(xué)意義，提示肉桂醛可能成為改善Hp 誘導(dǎo)的胃炎胃黏膜損傷的潛在有效藥物。

Shh/Gli1 通路在調(diào)控炎癥性疾病中發(fā)揮著重要作用[26］。據(jù)報道，Shh 通過活化Gli1 來上調(diào)慢性阻塞性肺病小鼠肺組織中IL-1β 和TNF-α 水平，進(jìn)而加重炎癥反應(yīng)[27］；抑制Shh/Gli1 通路可對TNF-α 介導(dǎo)的Ha-CaT 角質(zhì)形成細(xì)胞發(fā)揮抗炎活性[28］。本研究顯示Shh、Gli1 蛋白在Hp 誘導(dǎo)的胃炎大鼠或GES-1 細(xì)胞中均呈高表達(dá)，而經(jīng)肉桂醛干預(yù)后，Hp 誘導(dǎo)的胃炎大鼠或GES-1 細(xì)胞中Shh、Gli1 蛋白表達(dá)降低，且呈劑量依賴性。推測肉桂醛可能通過抑制Shh/Gli1 通路減輕Hp誘導(dǎo)的胃炎大鼠胃黏膜損傷。為了驗(yàn)證該推測，本研究在高劑量肉桂醛作用的基礎(chǔ)上再給予Shh 激活劑PUR 來干預(yù)Hp 誘導(dǎo)的胃炎大鼠或GES-1 細(xì)胞，結(jié)果顯示，PUR 減弱了高劑量肉桂醛對Hp 誘導(dǎo)的胃炎大鼠炎癥反應(yīng)以及胃黏膜病理損傷的改善作用，也減弱了高劑量肉桂醛對Hp 誘導(dǎo)的GES-1 細(xì)胞活力的增強(qiáng)以及炎癥反應(yīng)的抑制作用。證實(shí)了猜想的正確性。

綜上所述，肉桂醛可能通過抑制Shh/Gli1 通路減輕Hp 誘導(dǎo)的胃炎大鼠胃黏膜損傷。肉桂醛減輕Hp誘導(dǎo)的胃炎大鼠胃黏膜損傷涉及的機(jī)制較為復(fù)雜，具體通過Shh/Gli1 通路下游的何種因子來發(fā)揮作用有待進(jìn)一步探究。