草菇子實(shí)體多肽對(duì)小鼠急性酒精肝的預(yù)防作用及腸道菌群的影響

張芳藝，林海潞，陳莉莉，羅小芳，褚路路，江玉姬,2,3，陳炳智,2,3,

（1.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002；2.福建農(nóng)林大學(xué)菌物研究中心，福建 福州 350002；3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部亞熱帶特色果蔬菌加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（部省共建），福建 福州 350002）

酒精性肝?。╝lcoholic liver disease，ALD）是由于大量飲酒導(dǎo)致的中毒性肝損傷，其表現(xiàn)多樣，初期通常表現(xiàn)為脂肪肝，進(jìn)而可發(fā)展成酒精性肝炎、酒精性肝纖維化和酒精性肝硬化[1-3]。嚴(yán)重酗酒時(shí)可誘發(fā)廣泛肝細(xì)胞壞死甚至肝功能衰竭[4]。全球肝病病因?qū)W研究顯示，世界范圍內(nèi)有超過(guò)1.5億 人的肝病是飲酒所導(dǎo)致，ALD的發(fā)病率在不斷增加[5-6]。在中國(guó)，酒精引起的肝病也在逐年增加，是僅次于肝炎的第二大肝病，嚴(yán)重威脅到了人們的健康[7]。酒精是全球引發(fā)肝癌的主要因素，且隨著酒精消費(fèi)的增加，預(yù)計(jì)未來(lái)肝癌患者數(shù)量也會(huì)隨之增加。

肝臟是人體最大的腺體，是解毒和代謝的重要器官[8]，擁有體內(nèi)最大的網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞吞噬系統(tǒng)，可吞噬血液中各種病原菌及其他顆粒物質(zhì)，具有免疫防御和免疫調(diào)節(jié)功能[9]。若出現(xiàn)代謝紊亂，會(huì)造成脂肪肝、酒精肝等多種肝疾病，同時(shí)會(huì)造成免疫系統(tǒng)和腸道菌群失調(diào)，影響肝細(xì)胞代謝和脂質(zhì)氧化系統(tǒng)[10]。研究表明，乙醇在攝入機(jī)體后經(jīng)過(guò)肝臟代謝生成乙醛，再被乙醛脫氫酶氧化生成乙酸，最后氧化成水和二氧化碳。但乙醛轉(zhuǎn)化成乙酸的速度很慢，導(dǎo)致乙醛在體內(nèi)堆積，從而破壞氧化還原平衡狀態(tài)，造成肝臟氧化應(yīng)激損傷[11-12]?，F(xiàn)今市售保肝藥物，如糖皮質(zhì)類固醇、多烯磷脂酰膽堿和水飛薊素等，絕大多數(shù)對(duì)人體有毒副作用[13-14]。因此，從藥食同源植物中尋找有效預(yù)防酒精性肝損傷的功效成分，并將其開(kāi)發(fā)為抗酒精性肝損傷的保健食品，是有效預(yù)防酒精性肝損傷的重要途徑[15]。

腸道菌群是人體腸道的正常微生物，與人類共生[16]。近年來(lái)，腸道健康受到越來(lái)越多的關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，腸道菌群在酒精性肝損傷、肝硬化和肝細(xì)胞壞死等疾病的發(fā)生過(guò)程中起重要作用[17-18]。機(jī)體長(zhǎng)期攝入酒精后，酒精及其代謝物會(huì)使腸道菌群紊亂、通透性增加，造成腸道屏障功能障礙，影響機(jī)體的正常功能，加重ALD[19]。目前，利用腸道菌群DNA序列分析腸道菌群與酒精性肝損傷的關(guān)系已成為日益受到關(guān)注的研究方向。

草菇（Volvariella volvacea(Bull.) Singer）又名蘭花菇[20]，隸屬光柄菇科（Pluteaceae）、小苞腳菇屬（Volvariella），被譽(yù)為“素中之葷”[21]。草菇含有多肽、三萜、黃酮、甾醇類物質(zhì)等多種活性物質(zhì)[22]。生物活性肽是一種具強(qiáng)抗氧化性的多肽，可以抑制大分子的氧化應(yīng)激反應(yīng)[23]。研究表明，生物活性肽可以改善肝臟功能和乙醇代謝，具有抗炎護(hù)肝作用[24]。本實(shí)驗(yàn)以分子質(zhì)量為1～3 kDa的草菇子實(shí)體多肽（Volvariella volvaceafruit body polypeptides，VVFP）為研究材料，建立小鼠急性ALD模型，通過(guò)血清和肝臟多項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)，結(jié)合肝組織病理切片分析，探究VVFP對(duì)急性ALD的預(yù)防作用；同時(shí)利用16S rDNA基因高通量測(cè)序分析各樣品中微生物菌群的生物多樣性以及門和屬水平的相對(duì)豐度，探究VVFP對(duì)ALD模型小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響，從而為揭示VVFP對(duì)小鼠肝臟的保護(hù)作用機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

ICR雄性小鼠（SPF級(jí)），3～4 周齡，體質(zhì)量（25±2）g，動(dòng)物生產(chǎn)許可證：SCXK（京）2019-0008，由吳氏小鼠動(dòng)物有限責(zé)任公司提供。

動(dòng)物飼料（含有玉米、豆粕、小麥麩、小麥次粉、魚(yú)粉、大豆油、石粉、碳酸氫鈣、鹽、氮化膽堿、賴氨酸、多種維生素、多種礦物元素）由閩侯縣吳氏實(shí)驗(yàn)動(dòng)物貿(mào)易有限責(zé)任公司提供。

無(wú)水乙醇、冰乙酸、福爾馬林（均為分析純）國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；聯(lián)苯雙酯滴丸 浙江醫(yī)藥有限公司；56°紅星二鍋頭 北京紅星股份有限公司；甘油三酯（triglyceride，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-6、乙醇脫氫酶（alcohol dehydrogenase，ADH）、丙二醛（malondialdehyde，M D A）、總超氧化物歧化酶（total superoxide dismutase，T-SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-PX）測(cè)定試劑盒 南京建成生物工程研究所；E.Z.N.A.Stool DNA Kit試劑盒 美國(guó)Omega BioTek公司；NovaSeq 6000SP Reagent Kit、TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit 美國(guó)Illumina公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Hannuo-192組織研磨儀 上海漢諾儀器有限公司；LGJ-12真空冷凍干燥機(jī) 北京松源華興科技發(fā)展有限公司；UV-5100B紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司；SpectraMaxi3X多功能酶標(biāo)儀 美國(guó)Molecular Devices公司；L-550臺(tái)式離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司；BA210T顯微鏡 麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司；S1000聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國(guó)Bio-Rad公司；NovaSeq 6000高通量測(cè)序儀 美國(guó)Illumina公司；PacBio RS II分子測(cè)序儀 美國(guó)Pacific Biosciences公司。

1.3 方法

1.3.1 VVFP的制備

參照張芳藝等[25]的研究，草菇干品采用堿提酸沉的方法提取草菇蛋白，用堿性蛋白酶酶解草菇蛋白得到VVFP。經(jīng)檢測(cè)VVFP的8 種必需氨基酸（essential amino acid，EAA）含量占總氨基酸含量的41.71%，VVFP的EAA與非必須氨基酸的百分比為71.56%，符合聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織（Food and Agriculture Organization of the United Nations，F(xiàn)AO）/世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）對(duì)優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)的要求。采用透析法進(jìn)行分離純化，獲得分子質(zhì)量為1～3 kDa的VVFP。冷凍干燥制得VVFP粉，置于干燥皿中保存，以進(jìn)行小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 小鼠分組

將72 只健康雄性小鼠隨機(jī)分成6 組，分別命名為空白組（CK）、模型組（MK）、陽(yáng)性對(duì)照組（P）、VVFP低劑量組（L-VVFP）、VVFP中劑量組（M-VVFP）、VVFP高劑量組（H-VVFP），每組12 只。

1.3.3 急性酒精肝損傷小鼠模型的建立

小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，開(kāi)始灌胃處理，多肽組按不同劑量灌胃等體積多肽溶液（100、200、400 mg/kgmb），陽(yáng)性對(duì)照組將聯(lián)苯雙酯滴丸溶于蒸餾水灌胃（200 mg/kgmb），其余各組灌胃等體積的蒸餾水（10 mL/kgmb）。每5 d稱質(zhì)量，每只小鼠根據(jù)體質(zhì)量調(diào)整劑量，連續(xù)灌胃30 d。末次給藥處理后，間隔5 h，除了空白組外，都給予灌胃12 mL/kgmb紅星二鍋頭，建立急性ALD模型。建模時(shí)間為12 h，禁食不禁水，眼球取血，離心取上清液，再頸椎脫臼處死后解剖，迅速取出肝臟、盲腸置于液氮內(nèi)，并存放在－80 ℃冰箱，用于后續(xù)指標(biāo)測(cè)定。

1.3.4 血清肝功能和血清炎癥因子指標(biāo)檢測(cè)

小鼠血清中肝功能指標(biāo)（TG、TC、ALT和AST）和血清炎癥因子（TNF-α和IL-6）的測(cè)定分別按照對(duì)應(yīng)試劑盒說(shuō)明方法進(jìn)行。

1.3.5 肝功能過(guò)氧化指標(biāo)檢測(cè)

快速稱取0.1 g肝臟，按1∶9體積比添加0.9%生理鹽水，并在冰水浴中將其完全研磨，勻漿結(jié)束后離心吸取上清液（4 ℃、5000 r/min，10 min）。根據(jù)試劑盒說(shuō)明測(cè)定小鼠肝臟中ADH、MDA、T-SOD和GSH-PX的水平。

1.3.6 肝組織病理切片染色分析

將肝臟組織用10%福爾馬林溶液固定24 h以上，置于脫水盒中，用70%～100%乙醇溶液進(jìn)行脫水處理，然后用二甲苯洗脫、石蠟包埋、切片。最后，用蘇木精和伊紅染色肝組織切片、封片，進(jìn)行顯微結(jié)構(gòu)觀察。

1.3.7 16S rDNA測(cè)序鑒定小鼠腸道菌群及功能分析

盲腸委托北京奧維森有限公司進(jìn)行16S rDNA測(cè)序，使用Qiime和SPSS Statistics 25.0軟件對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，使用Mothur軟件計(jì)算α多樣性，使用R語(yǔ)言軟件繪制物種累積圖和α多樣性指數(shù)箱形圖。對(duì)不同組的腸道菌群進(jìn)行門和屬水平分析，通過(guò)LEfSe（linear discriminant analysis effect size）分析，找出具有顯著差異的物種。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

2 結(jié)果與分析

2.1 VVFP對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響

由表1可知，實(shí)驗(yàn)期間空白組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組以及不同劑量VVFP組的小鼠體質(zhì)量均無(wú)顯著差異（P＞0.05）。實(shí)驗(yàn)中小鼠毛色光亮，大小便正常，未出現(xiàn)食欲不振、消瘦等癥狀，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)所用的聯(lián)苯雙酯滴丸和VVFP對(duì)小鼠無(wú)毒害作用。

表1 VVFP對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響Table 1 Effect of VVFP on body mass of mice g

2.2 VVFP對(duì)肝損傷小鼠血清TG、TC濃度及ALT、AST活性的影響

小鼠血清TG、TC含量及ALT、AST活性都是反映肝損傷情況的重要指標(biāo)，當(dāng)肝細(xì)胞損傷時(shí)，這些指標(biāo)在血清中的含量會(huì)異常升高。如圖1所示，與空白組相比，模型組小鼠血清的TG、TC濃度及ALT、AST活性均極顯著升高（P＜0.01），說(shuō)明建模成功。灌胃大量酒精后，小鼠體內(nèi)的代謝平衡被破壞，上述物質(zhì)大量進(jìn)入血液中使得血液中的含量升高。與模型組相比，陽(yáng)性對(duì)照組以及不同劑量VVFP組小鼠血清的TG、TC濃度及ALT、AST活性均極顯著降低（P＜0.01），說(shuō)明VVFP可以緩解酒精引起的代謝平衡。

圖1 VVFP對(duì)肝損傷小鼠血清TG、TC含量及ALT、AST活性的影響Fig.1 Effect of VVFP on serum TG,TC,ALT and AST levels in mice with liver injury

2.3 VVFP對(duì)肝損傷小鼠炎癥因子TNF-α和IL-6的影響

通過(guò)測(cè)定血清中炎癥因子的水平可確認(rèn)VVFP是否具有保肝作用。如圖2所示，與空白組相比，模型組的小鼠血清炎癥因子TNF-α和IL-6水平均極顯著升高（P＜0.01），說(shuō)明酒精肝損傷會(huì)引發(fā)小鼠肝臟炎癥反應(yīng)。與模型組相比，陽(yáng)性對(duì)照組以及不同劑量VVFP組小鼠血清炎癥因子TNF-α和IL-6水平均極顯著降低（P＜0.01），說(shuō)明VVFP可以改善肝細(xì)胞的損傷程度。

圖2 VVFP對(duì)肝損傷小鼠炎癥因子TNF-α和IL-6的影響Fig.2 Effect of VVFP on TNF-α and IL-6 levels in mice with liver injury

2.4 VVFP對(duì)肝損傷小鼠肝臟ADH、MDA、T-SOD及GSH-PX水平的影響

如圖3所示，與空白組相比，模型組小鼠肝臟組織的ADH、T-SOD活力及GSH-PX含量極顯著降低（P＜0.01），MDA含量極顯著升高（P＜0.01）。與模型組相比，VVFP處理組肝臟組織的ADH、T-SOD活力及GSH-PX含量均顯著升高，說(shuō)明VVFP可以通過(guò)提高ADH、T-SOD活力及GSH-PX含量修復(fù)受損的肝臟。與模型組相比，VVFP處理組的肝臟組織的MDA含量極顯著降低，說(shuō)明VVFP可以緩解脂質(zhì)過(guò)氧化。以上結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明VVFP可以減輕酒精引起的肝損傷。

圖3 VVFP對(duì)肝損傷小鼠肝臟ADH、MDA、T-SOD及GSH-PX水平的影響Fig.3 Effect of VVFP on liver ADH,MDA,GSH-PX and T-SOD levels in mice with liver injury

2.5 VVFP對(duì)小鼠肝組織病理切片的影響

對(duì)小鼠肝組織病理切片和蘇木精-伊紅染色觀察，結(jié)果如圖4所示?？瞻捉M小鼠肝小葉及細(xì)胞核結(jié)構(gòu)清晰，肝竇無(wú)明顯充血，無(wú)顯著病變狀況（圖4A）；模型組小鼠肝小葉及細(xì)胞核結(jié)構(gòu)被破壞，排列紊亂，出現(xiàn)水腫現(xiàn)象（圖4B），這與Parikh等[26]描述的肝損傷時(shí)出現(xiàn)的癥狀相似，具有典型的病理特征，表明急性ALD建模成功。給藥后，與模型組相比，多肽低劑量組（圖4D）和高劑量組（圖4F）在不同程度上有所改善，肝小葉及細(xì)胞核結(jié)構(gòu)較清晰、腫脹范圍減小，肝細(xì)胞排列紊亂現(xiàn)象減輕；陽(yáng)性對(duì)照組（圖4C）和多肽中劑量組（圖4E）肝細(xì)胞形態(tài)趨于正常，排列整齊，呈放射狀分布，細(xì)胞損傷狀況明顯改善。肝組織病理學(xué)分析結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)VVFP對(duì)ALD小鼠肝臟細(xì)胞損傷有明顯的改善作用。

圖4 VVFP對(duì)小鼠肝組織病理切片的影響（×100）Fig.4 Effect of VVFP on histopathological sections of liver tissues in mice (× 100)

2.6 小鼠腸道菌群有效數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

對(duì)小鼠盲腸內(nèi)容物腸道菌群測(cè)序進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，有效數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表2所示。樣本的平均有效數(shù)據(jù)率為98.44%，說(shuō)明腸道菌群測(cè)序的數(shù)據(jù)可靠，滿足后續(xù)分析要求。

2.7 小鼠腸道菌群α多樣性分析

α多樣性是通過(guò)單樣品的多樣性分析反映物種的豐度及多樣性。為了探究VVFP對(duì)ALD小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)和組成的差異，通過(guò)Chao1、Observed_species、Shannon以及Simpson 4 個(gè)指標(biāo)分析6 組之間的物種多樣性差異。

由圖5可知，模型組的Chao1和Observed_species指數(shù)均高于其他組，說(shuō)明小鼠在短時(shí)間內(nèi)大量飲酒會(huì)造成腸道菌群紊亂。在中劑量VVFP的干預(yù)下，ALD小鼠盲腸菌群豐度降低，更接近于正常水平，改善了ALD小鼠的腸道紊亂；模型組的Shannon指數(shù)均低于其他組，說(shuō)明模型組的物種均勻度較低，在中劑量VVFP的干預(yù)下，ALD小鼠盲腸菌群的均勻度提高。由上述結(jié)果可知，VVFP的干預(yù)能夠改善因酒精影響而發(fā)生變化的腸道菌群多樣性。

圖5 腸道菌群α多樣性指數(shù)箱形圖Fig.5 α-Diversity indexes of intestinal microbiota

2.8 小鼠腸道菌群物種組成分析

如圖6所示，按門水平分類，小鼠腸道菌群主要由擬桿菌門（Bacteroidota）、厚壁菌門（Firmicutes）和脫硫弧菌門（Desulfobacterota）組成?？瞻捉M的腸道菌群中擬桿菌門占50.83%，厚壁菌門占34.19%，脫硫弧菌門占7.34%；模型組腸道菌群中擬桿菌門占71.98%，厚壁菌門占21.24%，脫硫弧菌門占2.56%。與空白組相比，模型組的擬桿菌門菌群豐度上升，厚壁菌門和脫硫弧菌門的菌群豐度下降，說(shuō)明小鼠經(jīng)過(guò)酒精灌胃后，造成了腸道紊亂，與正常小鼠的差異較大。與模型組相比，陽(yáng)性對(duì)照組與中劑量組的擬桿菌門菌群豐度下降，分別達(dá)到51.54%和57.26%；厚壁菌門的菌群豐度上升，分別為38.63%和31.73%，均接近正常的小鼠，說(shuō)明中劑量的VVFP可以達(dá)到聯(lián)苯雙酯滴丸的干預(yù)效果，有效緩解ALD導(dǎo)致的腸道菌群紊亂。

圖6 門水平上微生物菌群的變化Fig.6 Changes in intestinal microbiota composition at the phylum level

小鼠腸道菌群在屬水平上主要由鏈霉菌屬（Streptomyces）、乳酸桿菌屬（Lactobacillus）和弧菌屬（Vibrio）組成（圖7）?？瞻捉M、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組、低劑量組、中劑量組和高劑量組鏈霉菌屬占比分別為26.88%、40.81%、20.54%、23.90%、27.69%和23.46%；乳酸桿菌屬占比分別為22.39%、12.60%、28.02%、14.33%、14.50%和15.55%；弧菌屬占比分別為15.29%、13.14%、20.28%、21.93%、16.75%和12.89%；與空白組相比，模型組鏈霉菌屬菌群豐度上升，乳酸桿菌屬和弧菌屬菌群豐度下降，說(shuō)明模型組小鼠的腸道菌群失調(diào)。經(jīng)過(guò)中劑量VVFP的干預(yù)后，與模型組相比，鏈霉菌屬的菌群豐度下降，與空白組接近；乳酸桿菌屬和弧菌屬的菌群豐度在一定程度上有所上升，說(shuō)明VVFP對(duì)患有急性ALD小鼠的腸道菌群有一定的調(diào)節(jié)功效。

圖7 屬水平上微生物菌群的變化Fig.7 Changes in intestinal microbiota composition at the genus level

2.9 小鼠腸道菌群LEfSe分析

LEfSe分析是一種通過(guò)多個(gè)分組之間的比較，從而找到組間在豐度上有顯著差異物種的方式，圖8展示了LDA score大于設(shè)定值3的差異菌屬，空白組中，有20 個(gè)差異菌種對(duì)菌群結(jié)構(gòu)影響較大，主要是脫硫弧菌屬（Desulfovibrio）、脫疏弧菌科（Desulfovibrionaceae）、脫氧球菌綱（Desulfovibrionia）、脫硫弧菌目（Desulfovibrionales）和脫硫桿菌門（Desulfobacterota）等；模型組中主要是木桿菌科（Muribaculaceae）、擬桿菌門（Bacteroidota）和擬桿菌綱（Bacteroidia）等5 個(gè)差異菌種對(duì)菌群結(jié)構(gòu)影響較大；在陽(yáng)性對(duì)照組中，理研菌科（Rikenellaceae）對(duì)菌群結(jié)構(gòu)影響最大，其次還有另枝菌屬（Alistipes）等11 個(gè)差異菌種具有影響；顫螺旋菌科（Oscillospiraceae）和普雷沃氏菌屬（Prevotellaceae_NK3B31_group）是低劑量組中的重要菌種；中劑量組中變形菌綱（Gammaproteobacteria）是最顯著的差異菌種，其次是腸桿菌科（Enterobacteriaceae）、大腸桿菌種（Escherichia_coli）和埃希氏菌-志賀氏菌屬（E._Shigella）等21 個(gè)差異菌種；高劑量組中主要有擬桿菌屬（Bacteroides）和類桿菌科（Bacteroidaceae）等11 個(gè)差異菌種對(duì)菌群結(jié)構(gòu)影響較大?？梢钥闯?，在中劑量VVFP的干預(yù)下，小鼠腸道菌群的差異性相比于模型組明顯增加，基本恢復(fù)至空白組水平，表明VVFP在一定程度上可以修復(fù)酒精對(duì)腸道的損傷。

圖8 不同處理組菌群差異LEfSe分析柱狀圖Fig.8 LEfSe analysis of differential intestinal microbiota among different treatment groups

3 討論

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)ALD發(fā)病機(jī)制的研究已取得較大進(jìn)步，脂質(zhì)代謝異常、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等被公認(rèn)為ALD的重要影響因素[27]。ALD在代謝過(guò)程中引起的直接或間接的氧化應(yīng)激、脂質(zhì)過(guò)氧化作用以及多種因素（如腸道菌群失調(diào)）相互作用導(dǎo)致的腸道通透性增加[28-29]，對(duì)腸道黏膜造成損傷，影響腸道菌群數(shù)量，引起細(xì)菌和細(xì)菌內(nèi)毒素的位移（經(jīng)過(guò)腸道組織到達(dá)肝臟），最終導(dǎo)致肝臟炎癥。雖然通過(guò)服用藥物可以起到治療效果，但其毒副作用較大。大量的研究表明，食用菌肽具有豐富的藥理價(jià)值，對(duì)肝損傷有很好的保護(hù)和緩解功效，但對(duì)于VVFP的研究仍存在較多的空白。本研究以56°紅星二鍋頭灌胃小鼠建立急性ALD模型，探究VVFP對(duì)ALD的預(yù)防作用。結(jié)果顯示，模型組、陽(yáng)性對(duì)照組以及不同劑量VVFP組小鼠與空白組小鼠體質(zhì)量均無(wú)顯著性差異，說(shuō)明VVFP無(wú)毒副作用。

肝臟是人體中唯一一個(gè)沒(méi)有痛感神經(jīng)的器官，極易受有毒化學(xué)物質(zhì)損傷，造成肝臟代謝功能紊亂[2]。在酒精代謝刺激下，肝臟出現(xiàn)氧化應(yīng)激反應(yīng)，肝細(xì)胞受損。ALT、AST水平是反映肝細(xì)胞損傷最直接和最敏感的指標(biāo)，Dong Qingqing等[30]發(fā)現(xiàn)在健康肝臟中ALT、AST很高，而血液中含量很低，一旦肝臟細(xì)胞受損，大量ALT和AST會(huì)釋放到血清中使血清中含量升高，ALT與AST的水平在一定范圍內(nèi)反映機(jī)體肝細(xì)胞的損傷程度。Reddy等[31]通過(guò)研究指出，當(dāng)肝臟脂肪代謝出現(xiàn)能力出現(xiàn)障礙時(shí)，血清中TC和TG兩種代謝物含量會(huì)升高。湛莉等[32]認(rèn)為，當(dāng)肝臟受損時(shí)，會(huì)分泌大量的炎性細(xì)胞因子，尤其是TNF-α、IL-6，二者水平能反映肝細(xì)胞炎癥程度。本研究結(jié)果顯示，VVPF能極顯著降低血清中TG、TC、ALT和AST水平（P＜0.01），并能降低TNF-α、IL-6炎癥因子水平，說(shuō)明VVFP可以減緩酒精引起的代謝紊亂。

在大量酒精的干預(yù)下，肝臟中脂肪酸的合成和代謝失去穩(wěn)態(tài)平衡[33]。ADH、MDA、T-SOD和GSH-PX水平能夠較好地反映肝臟氧化程度[34]。韓光順等[35]探究茴香提取液對(duì)小鼠酒精性肝損傷的保護(hù)作用時(shí)發(fā)現(xiàn)，ADH活力能靈敏地提示肝細(xì)胞的損傷及損傷的程度；MDA含量可反映出機(jī)體脂質(zhì)氧化水平，間接表明肝細(xì)胞的損傷程度[36]；Forrester等[37]研究發(fā)現(xiàn)T-SOD能夠清除過(guò)氧化產(chǎn)生的自由基從而調(diào)節(jié)代謝平衡；GSH-PX作為體內(nèi)重要的抗氧化劑，可以清除活性氧[38]。本研究結(jié)果顯示，與模型組相比，VVFP能夠極顯著降低MDA含量（P＜0.01），明顯提高肝臟中ADH、T-SOD和GSH-PX水平，證實(shí)VVFP可以減輕酒精引起的肝損傷，提高人體防御系統(tǒng)的抗氧化活性，從而防止慢性酒精中毒對(duì)肝臟的損害。肝組織病理切片也進(jìn)一步證實(shí)了VVFP的保肝活性。

基于16S rDNA高通量測(cè)序分析VVFP對(duì)ALD小鼠腸道菌群的影響。在VVFP的干預(yù)下，門水平上擬桿菌門菌群豐度下降，厚壁菌門的菌群豐度上升，這與韓琳[39]的研究結(jié)果一致。Li Koukou等[40]通過(guò)高通量測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，靈芝多糖S3降低了擬桿菌門的相對(duì)豐度，提升了厚壁菌門的相對(duì)豐度，顯著減輕了小鼠胰腺炎癥狀；在屬水平，VVFP降低了鏈霉菌屬的菌群豐度，增加了乳酸桿菌屬和弧菌屬的菌群豐度。乳酸桿菌是人體腸道內(nèi)重要的益生菌，不僅可以分解代謝腸道內(nèi)的益生元，還能維持免疫平衡，增強(qiáng)腸道屏障。范穎等[41]研究了大蒜多糖對(duì)ALD小鼠腸道菌群失調(diào)的影響，結(jié)果表明大蒜多糖組的多樣性指數(shù)和均勻度指數(shù)最高，優(yōu)桿菌屬和乳酸桿菌屬細(xì)菌增多。上述結(jié)果表明，VVFP能夠改善ALD小鼠腸道菌群。

綜上所述，VVFP能極顯著降低血清中TG、TC、ALT、AST和肝臟中MDA水平，并且降低TNF-α與IL-6炎癥因子水平，同時(shí)明顯提高肝臟中ADH、T-SOD和GSHPX水平。此外，VVFP可通過(guò)調(diào)節(jié)擬桿菌門、厚壁菌門、鏈霉菌屬乳酸桿菌屬和弧菌屬的豐度減輕小鼠肝臟的損傷程度。本研究結(jié)果可為多肽在功能食品領(lǐng)域的應(yīng)用提供藥效基礎(chǔ)。