低鹽雪菜中呈味核苷酸關(guān)聯(lián)物的檢測(cè)及貯藏過程中的變化

徐 祥，谷貴章，尚佳宇，張進(jìn)杰, ，林邦楚，謝紅豐，徐大倫

（1.寧波大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，浙江 寧波 315211；2.湖州市食品藥品檢驗(yàn)研究院，浙江 湖州 313000；3.浙江羽箖科技股份有限公司，浙江 寧波 315021；4.寧波新紫云堂水產(chǎn)食品有限公司，浙江 寧波 315141）

雪菜，又名雪里蕻（Brassicajunceavar.crispifolia），屬十字花科，在我國(guó)江浙一帶栽培較多。據(jù)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究，腌制后的雪菜具有抗氧化、健胃消食等功能[1-2]，在腌制時(shí)，雪菜中硫代葡萄糖苷的水解產(chǎn)物如異硫氰酸酯能夠調(diào)節(jié)酶的活性、提高機(jī)體免疫力并預(yù)防某些癌癥[3-4]。隨著社會(huì)進(jìn)步和人民生活水平的不斷提高，傳統(tǒng)高鹽腌制雪菜已不能滿足當(dāng)下人們對(duì)感官和營(yíng)養(yǎng)保健并舉的需求，低鹽化雪菜腌制成為現(xiàn)代蔬菜腌制加工研究的熱點(diǎn)。雪菜的低鹽腌制是利用食鹽的高滲透壓作用、乳酸菌的發(fā)酵作用、蛋白質(zhì)的水解作用以及一系列復(fù)雜的生物化學(xué)變化，賦予雪菜獨(dú)特的色、香、味[5-6]。然而即使采用現(xiàn)代化的雪菜栽培管理技術(shù)、優(yōu)化發(fā)酵條件，低鹽化雪菜在后續(xù)的加工、貯藏及運(yùn)輸過程中仍然存在菜莖色澤衰變、風(fēng)味變差等問題，造成雪菜品質(zhì)下降。目前我國(guó)對(duì)于雪菜的低鹽腌制尚沒有統(tǒng)一執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)[7]。若僅僅降低用鹽量，會(huì)導(dǎo)致低滲透壓的發(fā)酵環(huán)境中有害微生物的生長(zhǎng)，這或?qū)⒅苯訉?dǎo)致低鹽雪菜的腐敗[8]。低鹽環(huán)境下添加優(yōu)質(zhì)乳酸菌可有效緩解此問題。高世陽等[9]研究發(fā)現(xiàn)，低pH值可有效抑制有害微生物的污染，接種乳酸菌可使低鹽榨菜發(fā)酵環(huán)境的pH值迅速降至4以下，從而保證腌制過程的正常進(jìn)行。

在雪菜低鹽腌制過程中，隨著腌制時(shí)間的延長(zhǎng)，大量微生物在不斷發(fā)生演替變化[10-11]。乳酸菌等微生物在生長(zhǎng)代謝過程中會(huì)產(chǎn)生豐富的三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）和核糖核酸（RNA）[12-13]；由于微生物的活動(dòng)或環(huán)境條件的作用，ATP和RNA會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)化或代謝產(chǎn)生二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）、腺苷酸（adenosine monophosphate，AMP）、肌苷酸（inosine monophosphate，IMP）、次黃嘌呤核苷（hypoxanthine riboside，HxR）、次黃嘌呤（hypoxanthine，Hx）、腺苷（adenosine，AdR）、腺嘌呤（adenine，Ad）、黃嘌呤（xanthine，Xt）、鳥苷酸（guanosine monophosphate，GMP）、胞苷酸（cytidine monophosphate，CMP）和尿苷酸（uridine monophosphate，UMP）等多種核苷酸相關(guān)產(chǎn)物[14-16]。有研究表明，AMP、IMP、GMP、CMP和UMP等是典型的呈鮮味核苷酸[17-20]。鮮味是低鹽雪菜滋味的重要組成部分，對(duì)低鹽雪菜的品質(zhì)有著重要影響。

陳大鵬等[21]以總酸、氨基酸態(tài)氮以及揮發(fā)性成分等為指標(biāo)，比較自然發(fā)酵和人工接種發(fā)酵泡菜的品質(zhì)差異。徐娟娣等[22]研究了雪里蕻在低鹽腌制過程中總酸、有機(jī)酸和游離氨基酸等指標(biāo)的動(dòng)態(tài)變化。肖雋霏等[23]以游離氨基酸、有機(jī)酸及核苷酸為指標(biāo)，研究分析了4 種酸菜中的呈味成分。趙大云等[24]以氨基酸、有機(jī)酸和揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)等為指標(biāo)，對(duì)腌制雪菜的風(fēng)味進(jìn)行探究，但未涉及到呈味核苷酸關(guān)聯(lián)物的研究。目前對(duì)于低鹽雪菜呈味成分的相關(guān)研究主要集中在有機(jī)酸、游離氨基酸和揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)等方面，對(duì)于低鹽雪菜中呈味核苷酸關(guān)聯(lián)物的深入研究比較少。

因此，本研究以低鹽腌制成熟的雪菜為對(duì)象，建立檢測(cè)呈味核苷酸關(guān)聯(lián)物的高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）方法，對(duì)滅菌和未滅菌處理的低鹽雪菜在常溫（25±5）℃和冷藏（4±1）℃貯藏期間呈味核苷酸關(guān)聯(lián)物的含量變化進(jìn)行分析，以期為高品質(zhì)雪菜的合理貯運(yùn)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮雪菜 寧波新紫云堂水產(chǎn)食品有限公司。

標(biāo)準(zhǔn)品：ATP、ADP、AMP、IMP、HxR、Hx、AdR、Ad、Xt、GMP、CMP和UMP 美國(guó)Sigma公司；甲醇（色譜純）德國(guó)Merck公司；磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、氫氧化鉀、磷酸（均為優(yōu)級(jí)純）、高氯酸（分析純）國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ME204E電子天平 瑞士梅特勒-托利多公司；XHF-D內(nèi)切式勻漿機(jī) 寧波新芝生物科技公司；Centrifuge 5418高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；1260 HPLC儀 美國(guó)Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 低鹽雪菜的制作

選擇色澤濃綠、葉片肥嫩、無病蟲害、菜棵整齊的新鮮雪菜。將雪菜拍去泥土，剔除老葉、黃葉，削去老根，洗凈再置于日光下晾曬2 d至梗軟。將整理好的雪菜按菜根部朝下，葉子朝上排于大陶缸中，排一層菜，撒一層鹽并噴淋適量發(fā)酵菌種液（噴灑菌種為企業(yè)培育篩選的乳酸菌ZY35號(hào)菌種），每100 kg雪菜撒5 kg鹽。撒鹽接菌種后，將菜壓實(shí)，封蓋隔氧，置于寧波新紫云堂水產(chǎn)食品有限公司低鹽雪菜腌制車間（（15±5）℃陰涼干燥環(huán)境）中約30 d成熟。

1.3.2 低鹽雪菜的滅菌、貯藏及取樣

低鹽腌制成熟的雪菜置于金屬掛晾架單層單棵排布，送滅菌室進(jìn)行蒸汽浸入式超高溫殺菌，殺菌工藝為110 ℃持續(xù)2 min，達(dá)到商業(yè)無菌狀態(tài)后用PET食品包裝袋按約300 g/袋的規(guī)格進(jìn)行分裝，抽真空封口；未滅菌樣品直接采用PET食品包裝袋按以上規(guī)格分裝封口。

基于雪菜貯運(yùn)和銷售環(huán)境溫度（超市和菜市場(chǎng)的常溫銷售，冷藏倉(cāng)儲(chǔ)和家用冰箱冷藏等）設(shè)置4 組樣品，滅菌（25±5）℃貯藏（M-25組）：取滅菌的低鹽雪菜20 袋置于常溫（25±5）℃條件下貯藏，每隔3 d隨機(jī)取3 袋雪菜樣品進(jìn)行取樣分析；未滅菌（25±5）℃貯藏（J-25組）：未滅菌的低鹽雪菜樣品進(jìn)行同上條件處理，作為對(duì)照。滅菌（4±1）℃貯藏（M-4組）：取滅菌的低鹽雪菜20 袋置于冰箱中于（4±1）℃條件下貯藏，每隔10 d隨機(jī)取3 袋雪菜樣品進(jìn)行取樣分析；未滅菌（4±1）℃貯藏（J-4組）：未滅菌的低鹽雪菜樣品進(jìn)行同上條件處理，作為對(duì)照。低鹽雪菜在不同條件下貯藏的天數(shù)由其動(dòng)態(tài)感官評(píng)分決定，80 分及以上為優(yōu)質(zhì)品質(zhì)，低于60 分即為感官上不可接受。

1.3.3 感官評(píng)價(jià)

邀請(qǐng)10 名寧波當(dāng)?shù)赜惺秤醚┎肆?xí)慣的感官評(píng)定人員（男性、女性各5 名，年齡20～30 歲），通過感官評(píng)價(jià)培訓(xùn)組成感官評(píng)定小組。參考袁先鈴等[25]的方法并略作修改，在雪菜貯藏過程中定期取樣的同時(shí)另取25 g樣品，以色澤、酸味、苦味、脆度和氣味為感官指標(biāo)進(jìn)行感官評(píng)定，按照感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)表（表1）對(duì)不同貯藏期的低鹽雪菜進(jìn)行打分，各項(xiàng)指標(biāo)滿分均為20 分，感官評(píng)價(jià)總分為100 分，取10 位評(píng)審員評(píng)分的平均分作為雪菜樣品的最終感官評(píng)分。低鹽雪菜總分不低于80 分為優(yōu)質(zhì)品質(zhì)，低于60 分為感官品質(zhì)不合格。

表1 低鹽雪菜感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Criteria for sensory evaluation of low-salt pickled potherb mustard

1.3.4 低鹽雪菜中呈味核苷酸關(guān)聯(lián)物HPLC方法的建立及測(cè)定

參考邱偉強(qiáng)等[26]的方法并略作修改，準(zhǔn)確稱取11 種標(biāo)準(zhǔn)品（ATP、ADP、CMP、UMP、AMP、IMP、GMP、AdR、HxR、Hx、Ad），用超純水配制成1000 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液I；準(zhǔn)確稱取Xt標(biāo)準(zhǔn)品，用0.01 mol/L NaOH溶液配制成500 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液II。用超純水對(duì)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液I和II進(jìn)行適當(dāng)稀釋，使11 種標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度分別為5、10、20、40、80、120、160 μg/mL，Xt質(zhì)量濃度分別為2.5、5、10、20、40、60、80 μg/mL。

色譜條件：采用Agilent1260PDA 檢測(cè)器，色譜柱為Shim-pack Gis C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm，柱溫30 ℃，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量10 μL。流動(dòng)相A為甲醇溶液；流動(dòng)相B為0.015 mol/L K2HPO4＋0.015 mol/L KH2PO4緩沖液，用H3PO4調(diào)pH值為5.35。梯度洗脫程序：0～12 min，0% A、100% B；12～14 min，3% A、97% B；14～23 min，15% A、85% B；23～35 min，30% A、70% B；之后為0% A、100% B。設(shè)備平衡6 min后測(cè)下一個(gè)樣品。每個(gè)濃度分別進(jìn)樣3 次，根據(jù)保留時(shí)間定性，以色譜圖中峰面積與其相應(yīng)的呈味核苷酸及其關(guān)聯(lián)物質(zhì)量濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，校準(zhǔn)曲線采用決定系數(shù)（R2）進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1.3.5 雪菜測(cè)試樣品前處理

將雪菜樣品粉碎處理，稱取攪拌、均質(zhì)的樣品5 g（精確至0.01 g）于50 mL塑料離心管中，加入4 ℃預(yù)冷的體積分?jǐn)?shù)10%高氯酸溶液15 mL于10000 r/min充分勻漿1 min，然后在10000 r/min條件下冷凍離心10 min，收集上清液置于4 ℃暫存，沉淀物中加入4 ℃體積分?jǐn)?shù)為5%的高氯酸溶液15 mL重復(fù)提取1 次，合并上述提取2 次的上清液，用1.0 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)pH值至5.4，定容至50 mL容量瓶，4 ℃靜置1 h。取靜置后的澄清溶液過0.22 μm的水相濾膜，待上機(jī)檢測(cè)。每組3 個(gè)平行。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS Statistics 25.0軟件中的單因素方差分析進(jìn)行差異顯著性分析（P＜0.05），使用Origin 2017軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 呈味核苷酸關(guān)聯(lián)物標(biāo)準(zhǔn)品和低鹽雪菜樣品的HPLC檢測(cè)

通過研究發(fā)現(xiàn)，采用1.3.4節(jié)中色譜條件進(jìn)樣，混合標(biāo)準(zhǔn)品中的12 種呈味核苷酸關(guān)聯(lián)物和低鹽雪菜中呈味核苷酸關(guān)聯(lián)物在33 min內(nèi)都得到有效分離，如圖1所示。伍彬等[27]利用HPLC在35 min內(nèi)有效分離了8 種ATP及其關(guān)聯(lián)產(chǎn)物。本研究所采用的HPLC分離條件實(shí)現(xiàn)了12 種呈味核苷酸關(guān)聯(lián)物在33 min內(nèi)的快速有效分離，且流動(dòng)相配制簡(jiǎn)易，具有高效快速、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。

圖1 呈味核苷酸關(guān)聯(lián)物標(biāo)準(zhǔn)品及低鹽雪菜樣品的HPLCFig.1 HPLC of flavor nucleotide-related compound standards and low-salt pickled potherb mustard samples

實(shí)驗(yàn)以線性范圍、檢測(cè)限以及回收率等指標(biāo)進(jìn)行方法性能的評(píng)價(jià)。根據(jù)信噪比計(jì)算，當(dāng)待測(cè)物質(zhì)色譜峰的峰高為噪音峰高3 倍時(shí)，確定該濃度為最低檢測(cè)限（limit of detection，LOD）[26]。結(jié)果表明，ATP、ADP、CMP、UMP、AMP、IMP、GMP、AdR、HxR、Hx、Ad這11 種呈味核苷酸關(guān)聯(lián)物在1～160 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，Xt在1～80 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，R2在0.9996～0.9999之間，LOD在0.05～0.20 μg/mL之間，說明該方法具有良好的線性關(guān)系及較高的靈敏度。在本實(shí)驗(yàn)條件下，12 種呈味核苷酸關(guān)聯(lián)物的日內(nèi)濃度變化的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）在0.95%～2.74%，日間濃度變化的RSD在1.62%～4.73%，雪菜樣品中加標(biāo)回收率在77.92%～112.50%，RSD為3.92%～9.52%，儀器精密度和重現(xiàn)性良好，可為研究雪菜呈味核苷酸關(guān)聯(lián)物的變化奠定方法基礎(chǔ)。

2.2 感觀評(píng)價(jià)

由圖2所示，新鮮腌制成熟的低鹽雪菜感官品質(zhì)很好，各項(xiàng)感官指標(biāo)評(píng)分均較高且均衡，整體感官評(píng)分在96.5 分左右。低鹽雪菜經(jīng)蒸汽滅菌處理后脆度和氣味評(píng)分稍有下降，但整體感官評(píng)分仍保持在92.7 分左右。4 組低鹽雪菜的感官評(píng)分在貯藏期間均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，在不同貯藏條件下的變化情況有明顯差異。由圖2A可知，（25±5）℃貯藏期間，M-25組較J-25組感官評(píng)分下降緩慢，貯藏超過18 d感官評(píng)分才低于60 分，而J-25組貯藏到第12天感官評(píng)分低于60 分，即感官品質(zhì)在商業(yè)上不可接受。由圖2B可知，（4±1）℃貯藏期間，M-4組的感官評(píng)分下降速率較J-4組緩慢，貯藏到第70天感官評(píng)分才低于60 分，而J-4組貯藏到第50天感官評(píng)分低于60 分。綜上所述，M-25組、J-25組、M-4組、J-4組的感官可接受貨架期分別約為18、9、60、40 d，冷藏和滅菌處理對(duì)貯藏期間低鹽雪菜感官品質(zhì)的維持均具有重要作用，且二者有較好的協(xié)同效果。

圖2 不同貯藏條件下貯藏期間低鹽雪菜感官評(píng)分的變化Fig.2 Changes in sensory scores of low-salt pickled potherb mustard during storage under different conditions

2.3 低鹽雪菜貯藏期間呈味核苷酸關(guān)聯(lián)物含量的變化

如圖1B所示，采用本研究?jī)?yōu)化的HPLC法檢測(cè)到低鹽雪菜中的呈味核苷酸關(guān)聯(lián)物有ATP、ADP、CMP、UMP、AMP、IMP、GMP、AdR、HxR、Hx、Ad、Xt。其中ATP、IMP、CMP和Hx是新鮮腌制成熟低鹽雪菜中主要的呈味核苷酸關(guān)聯(lián)物，分別占呈味核苷酸關(guān)聯(lián)物總量的37.2%、15.4%、7.1%、8.3%。如圖3所示，在貯藏期間，經(jīng)滅菌處理的低鹽雪菜中呈味核苷酸關(guān)聯(lián)物總量的變化較未滅菌組更緩慢；未滅菌和滅菌的低鹽雪菜中呈味核苷酸關(guān)聯(lián)物總量的變化均在（4±1）℃條件下更緩慢。因此，滅菌和冷藏均對(duì)低鹽雪菜貯藏過程中呈味核苷酸關(guān)聯(lián)物總量的變化有明顯抑制作用。

圖3 不同貯藏條件下低鹽雪菜中呈味核苷酸關(guān)聯(lián)物含量的變化Fig.3 Changes in contents of flavor nucleotide-related compounds in low-salt pickled potherb mustard under different storage conditions

圖4 不同條件貯藏期間低鹽雪菜中ATP關(guān)聯(lián)物總含量的變化Fig.4 Changes in total content of ATP-related compounds in low-salt pickled potherb mustard during storage under different conditions

由圖3A可知，J-25組低鹽雪菜中ATP、AMP、ADP、CMP和UMP的含量變化趨勢(shì)相似，先上升后下降，ATP和AMP在第3 天均上升到最高含量（11.59 mg/100 g和2.73 mg/100 g），然后迅速下降。IMP 的含量在前6 d 無顯著變化，最高含量為4.41 mg/100 g，之后開始迅速下降。Hx含量在第0～9天持續(xù)上升，由2.37 mg/100 g升至9.36 mg/100 g，第9天后趨于平穩(wěn)。Xt含量在貯藏期間持續(xù)上升，第18天上升到最高（3.73 mg/100 g）。GMP和HxR含量緩慢下降，AdR含量緩慢上升，而Ad含量基本保持不變。

M-25組低鹽雪菜中ATP、GMP和CMP的含量分別下降了37.2%、55.6%、66.5%，而AMP的含量上升了52.9%（圖3B），說明高溫滅菌處理可明顯促進(jìn)ATP、GMP和CMP的降解，并積累一定量的AMP。所有呈味核苷酸關(guān)聯(lián)物的含量0～9 d均沒有顯著變化，之后ATP、IMP和AMP的含量分別由5.97、4.78 mg/100 g和4.01 mg/100 g快速下降到0.52、1.46 mg/100 g和2.04 mg/100 g。Xt含量以較快速度上升，Hx含量快速上升，第18天均達(dá)到最高含量（2.28 mg/100 g和10.31 mg/100 g）。ADP、GMP、CMP、UMP和HxR的含量均在緩慢下降，Ad和AdR含量在貯藏期間無顯著變化。

有研究表明，微生物的生命活動(dòng)與核苷酸相關(guān)產(chǎn)物代謝高度相關(guān)[28-30]，王婷[31]研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌具有一定的ATP代謝能力。因此，本研究結(jié)果中J-25組低鹽雪菜呈味核苷酸關(guān)聯(lián)物的含量變化與自身微生物的活動(dòng)密切相關(guān)，微生物加快了呈味核苷酸關(guān)聯(lián)物的變化速率。滅菌可有效降低上述各物質(zhì)生成和降解的速率，在一定時(shí)間內(nèi)維持其含量基本不變。

J-4組低鹽雪菜中ATP、ADP、HxR、Hx和Xt含量在0～20 d無顯著差異（圖3C）。之后ATP含量開始迅速下降，ADP和HxR的含量緩慢下降，而Hx和Xt的含量則以較快速率上升，在第60天分別達(dá)到最高含量（7.85 mg/100 g和2.56 mg/100 g）。其他核苷酸關(guān)聯(lián)物的含量在0～30 d均沒有顯著變化，之后IMP含量快速下降，AMP含量緩慢下降，其他關(guān)聯(lián)物的含量沒有顯著變化。

M-4組低鹽雪菜中ATP、ADP、AMP、IMP和HxR的含量變化趨勢(shì)相似，前30 d基本保持不變，30 d后緩慢下降，其中第60天其ATP和IMP的含量分別為2.02 mg/100 g和3.54 mg/100 g，是初始值的29.7%和66.4%（圖3D）。Hx含量前20 d基本維持不變，之后緩慢上升，第60天的含量為7.84 mg/100 g。其他呈味核苷酸關(guān)聯(lián)物的含量在整個(gè)貯藏期內(nèi)均沒有顯著變化。結(jié)果說明滅菌可有效抑制核苷酸關(guān)聯(lián)物生成和降解的速率，有利于維持低鹽雪菜的品質(zhì)。

J-25組低鹽雪菜ATP、AMP、ADP、CMP和UMP的含量變化呈先上升后下降的趨勢(shì)，而在M-25、J-4和M-43 種貯藏條件下均先保持不變后下降。IMP含量在4 種貯藏條件下的變化趨勢(shì)相似，先保持不變后下降，其中M-4組的下降速率最慢。Hx含量在J-25組中先上升后趨于穩(wěn)定，在其他3 種貯藏條件下均持續(xù)上升。Xt含量在M-4組中基本維持不變，其他3 種貯藏條件下均呈緩慢轉(zhuǎn)快速上升趨勢(shì)。HxR含量在4 種貯藏條件下均緩慢下降，在M-4條件下下降最緩慢。Ad和AdR含量在4 種貯藏條件下無顯著變化，且在M-4條件下含量變化最穩(wěn)定。在貯藏中末期，J-25、M-25和J-4條件下ATP、ADP、AMP、IMP、GMP和CMP均有降解和轉(zhuǎn)化現(xiàn)象，其中在J-25條件下降解和轉(zhuǎn)化速率最快；在M-4條件下ATP、ADP和AMP緩慢降解和轉(zhuǎn)化，而IMP、GMP、CMP和UMP的含量無顯著變化。所有呈味核苷酸關(guān)聯(lián)物含量在M-4貯藏期間變化速率均較慢，表明冷藏和滅菌處理對(duì)低鹽雪菜中呈味核苷酸及其關(guān)聯(lián)物的含量變化均有抑制作用，且二者有較好的協(xié)同效果。

未滅菌的兩組低鹽雪菜貯藏期間呈味核苷酸關(guān)聯(lián)物的含量變化有所不同（圖3A、C）。J-25組呈味核苷酸關(guān)聯(lián)物的總量呈先上升后下降的變化趨勢(shì)，而J-4組則是先基本維持不變后下降。J-4組各呈味核苷酸關(guān)聯(lián)物的含量在前20 d也均無顯著變化，之后的變化速率較J-25組緩慢。雪菜的腌制主要利用了乳酸菌在常溫下所進(jìn)行的乳酸發(fā)酵，而乳酸菌等微生物的活動(dòng)會(huì)產(chǎn)生ATP，并伴隨著ATP的代謝[12,31-33]，J-4組的冷藏條件在一定程度上抑制了乳酸菌的活性，從而導(dǎo)致低鹽雪菜中呈味核苷酸關(guān)聯(lián)物含量的變化幅度小、速率慢。

滅菌的兩組低鹽雪菜貯藏期間呈味核苷酸關(guān)聯(lián)物的含量變化也不相同（圖3B、D）。兩組呈味核苷酸關(guān)聯(lián)物的總量均呈先不變后緩慢下降的變化趨勢(shì)，各呈味核苷酸關(guān)聯(lián)物的含量變化均較緩慢。不同的是，M-25組Xt的含量在貯藏期內(nèi)持續(xù)升高，而M-4組Xt的含量始終基本保持不變。此外，在貯藏中后期，M-4組各呈味核苷酸關(guān)聯(lián)物的含量變化較M-25組更緩慢。張皖君等[30]研究表明，低溫可抑制微生物和內(nèi)源酶活性，從而延緩鱸魚中ATP及其關(guān)聯(lián)物的降解速率。杜鳳霞等[34]研究了低溫貯藏條件下海鱸魚片中ATP及關(guān)聯(lián)物的降解規(guī)律，發(fā)現(xiàn)冷藏抑制其內(nèi)源酶活性，延緩ATP和ADP的降解。綜上所述，冷藏條件可能抑制了低鹽雪菜中微生物及相關(guān)酶的活性，從而有效降低核苷酸及關(guān)聯(lián)物含量變化的速率，有利于低鹽雪菜品質(zhì)的保持。

2.4 低鹽雪菜中ATP關(guān)聯(lián)物總量的變化

ATP及其關(guān)聯(lián)產(chǎn)物主要包括ADP、AMP、IMP、HxR、Hx、AdR、Ad、Xt等[35]。IMP和AMP呈鮮味，而HxR和Hx呈苦味[17,26,36]，由ATP代謝產(chǎn)生的各種滋味物質(zhì)共同作用，對(duì)食品的鮮味等特征有著重要影響[37-38]。ATP作為重要的能量載體，在微生物中的含量較為恒定，其總量與微生物的數(shù)量呈正比[39]。低鹽雪菜中含有大量乳酸菌等發(fā)酵菌，是ATP的重要來源。

J-25組中ATP關(guān)聯(lián)物總含量到第3天顯著上升了13.1%，之后開始快速下降。而M-25組中ATP關(guān)聯(lián)物總含量在前9 d基本保持不變，然后開始以較快速度下降，說明低鹽雪菜中微生物的生命活動(dòng)對(duì)ATP關(guān)聯(lián)物的總含量有顯著影響。J-4組中ATP關(guān)聯(lián)物的總含量在前20 d緩慢上升，但與滅菌組無顯著差異，這可能是冷藏條件在一定程度上抑制了微生物的代謝活動(dòng)。J-4組中ATP關(guān)聯(lián)物的總含量在第20天開始下降，第30天后快速下降；而M-4組中ATP關(guān)聯(lián)物總含量在第40天才開始以較快速度下降。說明微生物的代謝活動(dòng)對(duì)低鹽雪菜中ATP關(guān)聯(lián)物總含量有影響。

魚類死后肌肉中ATP降解途徑多為ATP→ADP→AMP→IMP→HxR→Hx[14]，王丹妮[15]研究發(fā)現(xiàn)縊蟶和文蛤中ATP的降解途徑基本相同，且都有2 種：ATP→ADP→AMP→AdR→HxR→Hx→Xt和ATP→ADP→AMP→IMP→HxR→Hx→Xt。綜合2.4節(jié)和2.5節(jié)分析結(jié)果，與水產(chǎn)品不同，低鹽雪菜貯藏期間ATP關(guān)聯(lián)物總含量變化顯著，由于微生物的作用，其中可能存在著更復(fù)雜的降解路徑。

2.5 低鹽雪菜中4 種核酸來源呈味核苷酸總量的變化

AMP、GMP、CMP和UMP 4 種核苷酸是核糖核酸的基本組成單位，可由核酸在核酸酶的作用下降解得到[40]。在低鹽雪菜中，4 種核苷酸的含量變化可能與其中含有大量微生物產(chǎn)生的RNA密切相關(guān)。AMP、GMP、CMP和UMP 4 種核苷酸都呈現(xiàn)鮮味[30,37-39]，故通過4 種呈味核苷酸的總量變化定性描述其對(duì)雪菜鮮味品質(zhì)的影響。

由圖5可知，J-25組中4 種核苷酸總量在前3 d快速上升，在第3天達(dá)到最大值（8.79 mg/100 g），之后持續(xù)快速下降，第18天趨于0 mg/100 g，結(jié)果表明貯藏前期微生物對(duì)低鹽雪菜的鮮味有一定貢獻(xiàn)，但它也直接導(dǎo)致貯藏后期低鹽雪菜中4 種核苷酸總量快速下降，不利于低鹽雪菜的貯藏。而M-25組4 種核苷酸總量在前3 d緩慢上升了5.8%，之后由慢速下降到第12天轉(zhuǎn)為快速下降，直到第18天含量變?yōu)?.04 mg/100 g，說明滅菌處理可顯著抑制低鹽雪菜中4 種核苷酸總含量的下降。

圖5 不同條件貯藏期間低鹽雪菜中核酸來源的AMP、GMP、CMP、UMP 4 種核苷酸總量的變化Fig.5 Changes in total content of AMP,GMP,CMP and UMP in low-salt pickled potherb mustard during storage under different conditions

J-4組中4 種核苷酸總量在前10 d緩慢下降了6.3%，之后基本保持穩(wěn)定，30 d后開始以較快速度下降，直到第60天總量變?yōu)?.76 mg/100 g。與J-25組貯藏結(jié)果不同，這可能是冷藏條件抑制了微生物的代謝活動(dòng)以及相關(guān)酶活性[31,34]。M-4組中4 種核苷酸總量在前20 d緩慢上升，這可能是冷藏結(jié)合滅菌條件使得核酸降解的速率略大于4 種核苷酸降解的速率所致，之后以較慢的速率下降，第60天4 種核苷酸總量為4.30 mg/100 g，比J-4組同一時(shí)期的總量高出了144.3%，再次說明滅菌處理可顯著抑制低鹽雪菜中4 種核苷酸總含量的下降，且協(xié)同冷藏條件的抑制效果更明顯。

在冷藏條件下，貯藏前期微生物對(duì)低鹽雪菜中4 種核苷酸的含量沒有明顯影響，但在貯藏后期加快了4 種核苷酸總含量的下降速率，使得低鹽雪菜鮮味降低，進(jìn)而使低鹽雪菜品質(zhì)下降。

3 結(jié)論

本研究建立了高效分離測(cè)定低鹽雪菜中呈味核苷酸關(guān)聯(lián)產(chǎn)物的HPLC方法，并探究了低鹽雪菜在4 種不同貯藏條件下感官品質(zhì)和呈味核苷酸關(guān)聯(lián)物含量的變化。結(jié)果表明，J-25、M-25、J-4和M-44 種不同貯藏條件下低鹽雪菜的感官貨架期分別為9、18、40 d和60 d。滅菌和低溫冷藏處理均能延長(zhǎng)雪菜貨架期，且二者具有較優(yōu)的協(xié)同作用。新鮮低鹽雪菜中ATP、IMP、CMP和Hx是主要的呈味核苷酸關(guān)聯(lián)物，分別占呈味核苷酸關(guān)聯(lián)物總量的37.2%、15.4%、7.1%、8.3%，貯藏期間低鹽雪菜中各呈味核苷酸關(guān)聯(lián)物會(huì)發(fā)生降解和轉(zhuǎn)化。M-25組低鹽雪菜中各呈味核苷酸關(guān)聯(lián)物及其總量的變化均較J-25組慢，M-4組的變化同樣較J-4組慢，即在相同貯藏溫度下，滅菌組雪菜貯藏期間各呈味核苷酸關(guān)聯(lián)物有更慢的變化速率。J-4和M-4組雪菜中呈味核苷酸關(guān)聯(lián)物的變化速率均比同等條件下常溫貯藏雪菜組慢。M-4組雪菜中呈味核苷酸關(guān)聯(lián)物的變化比其他3 組更緩慢，說明滅菌和冷藏對(duì)雪菜中各呈味核苷酸關(guān)聯(lián)物變化速率的抑制有協(xié)同作用。此外，低鹽雪菜中與ATP相關(guān)的呈味核苷酸關(guān)聯(lián)物總量和核酸來源的呈味核苷酸總量在滅菌協(xié)同冷藏條件下變化最緩慢。綜上所述，低鹽雪菜中微生物的代謝活動(dòng)和較高的貯藏溫度會(huì)加快呈味核苷酸關(guān)聯(lián)物在貯藏期間的降解和轉(zhuǎn)化，滅菌處理和冷藏條件均能顯著抑制低鹽雪菜中呈味核苷酸關(guān)聯(lián)物的含量變化，且二者具有很好的協(xié)同效果，進(jìn)而有效降低低鹽雪菜在貯藏期間的鮮味衰減速率。在低鹽雪菜的儲(chǔ)運(yùn)過程中，可以重點(diǎn)從冷藏和滅菌處理兩方面考慮，維持雪菜的品質(zhì)。