中醫(yī)藥防治腫瘤鐵死亡的研究進(jìn)展

朱青，陳龍菊

湖北民族大學(xué) 湖北恩施 445000

細(xì)胞死亡是細(xì)胞生命過程中的基本特征，利用這一特征可用于惡性腫瘤治療的研究。了解控制細(xì)胞死亡的機(jī)制對于防治腫瘤的發(fā)展至關(guān)重要。鐵是人體內(nèi)最豐富及維持機(jī)體生命活動必需的微量元素之一，在生命代謝過程中意義深遠(yuǎn)。正常細(xì)胞鐵代謝處于一個不斷吸收、利用、儲存、循環(huán)的動態(tài)平衡中，即鐵穩(wěn)態(tài)，其作用主要表現(xiàn)在維持細(xì)胞的正常生理功能。當(dāng)細(xì)胞中鐵穩(wěn)態(tài)遭到破壞，就會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鐵過載。過量的鐵通過芬頓（Fenton）反應(yīng)產(chǎn)生活性氧可以誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生一種不同于凋亡、自噬、壞死的程序性細(xì)胞死亡方式——鐵死亡，其先決條件可能與含多不飽和脂肪酸磷脂（PUFA-PL）的合成及過氧化、鐵代謝和線粒體代 謝有關(guān)，而其防御系統(tǒng)可能與GPX4-GSH、FSP1-CoQH2、DHODH-CoQH2、GCH1-BH4 有關(guān)，當(dāng)促進(jìn)鐵死亡的細(xì)胞活性顯著超過鐵死亡防御系統(tǒng)提供的解毒能力時，細(xì)胞膜上脂質(zhì)過氧化物的致命積累導(dǎo)致隨后的膜破裂和細(xì)胞鐵死亡[1]。鐵是DNA合成過程中的主要限速因素。腫瘤細(xì)胞由于需要迅速增殖，比正常細(xì)胞對鐵有更高的需求，這使得腫瘤細(xì)胞在鐵穩(wěn)態(tài)失衡時，比正常細(xì)胞對鐵死亡更加敏感[2]。高水平鐵代謝是腫瘤細(xì)胞主要的表現(xiàn)之一，因此，研究鐵死亡在抗腫瘤應(yīng)用方面具有潛在的優(yōu)勢。本文綜述中醫(yī)藥防治腫瘤鐵死亡的研究進(jìn)展，為腫瘤的治療提供新思路。

鐵死亡與腫瘤治療

Dolma 等[3]于2003 年在對大鼠肉瘤基因突變的腫瘤細(xì)胞研究時發(fā)現(xiàn)，新化合物Erastin 導(dǎo)致的細(xì)胞死亡且與細(xì)胞凋亡有著明顯區(qū)別且caspase 抑制劑不能阻斷。Yang 等[4]于2008 年研究發(fā)現(xiàn)RAS-selective lethal 3（RSL3）和RAS-selective lethal 5（RSL5）也可以觸發(fā)這類型的細(xì)胞死亡，其誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡可被鐵螯合劑（DFO）和抗氧化劑（Vitamin E）抑制。2012年，Dixon 等[5]用鐵死亡命名了這種細(xì)胞死亡方式，同時還確定了鐵抑素-1（ferrostatin-1，F(xiàn)er-1）化合物，作為HT-1080 細(xì)胞中erastin 誘導(dǎo)的鐵死亡的最有效抑制劑。鐵死亡在形態(tài)學(xué)上，線粒體體積減小、嵴減少或消失、膜密度增加、外膜破裂，而細(xì)胞質(zhì)膜不破裂，細(xì)胞核大小不變；在生化特征上，鐵離子積累、ROS 聚集以及脂質(zhì)過氧化[6]。脂質(zhì)氧化物堆積，谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4）催化的谷胱甘肽（GSH）還原反應(yīng)不能將其代謝，繼而Fe2+觸發(fā)芬頓反應(yīng)導(dǎo)致大量活性氧（ROS），誘導(dǎo)鐵死亡的發(fā)生[7]。在鐵死亡復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制中，由于GPX4 是清除脂質(zhì)過氧化物的酶，抑制其可以直接誘導(dǎo)細(xì)胞鐵死亡，而GSH 是GPX4 催化過氧化物的輔助因子[8]，所以GPX4/GSH 通路在鐵死亡的機(jī)制研究中較為重要。胱氨酸-谷氨酸反向轉(zhuǎn)運(yùn)體（System-Xc）可將胱氨酸還原為半胱氨酸，參與合成GSH 并將其合成原料轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)胞內(nèi)，因此間接成為GSH 合成的限制因素，是許多鐵死亡誘導(dǎo)劑的作用靶點(diǎn)[9]，該通路是鐵死亡眾多機(jī)制中最為經(jīng)典的通路。研究發(fā)現(xiàn)對于腫瘤鐵死亡分子機(jī)制還有鐵積累、脂肪酸積累和甲羥戊酸途徑抑制 GPX4 的合成等多種途徑[10]。細(xì)胞死亡對于正常發(fā)育、體內(nèi)平衡和預(yù)防惡性腫瘤等過度增殖性疾病至關(guān)重要，通過過氧化物、鐵或多不飽和脂肪酸過載，誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化等方法實(shí)現(xiàn)，達(dá)到清除特定細(xì)胞群（如特定腫瘤類型）的目的是目前研究的熱點(diǎn)。

惡性腫瘤已經(jīng)成為全球第2 大死亡原因，發(fā)病和死亡例數(shù)也逐年上升，尋求預(yù)防和控制的相關(guān)辦法十分重要[11]。研究表明，具有特定細(xì)胞狀態(tài)的癌細(xì)胞容易發(fā)生鐵死亡，例如處于間充質(zhì)狀態(tài)的癌細(xì)胞由于ZEB1 的高表達(dá)而富含PUFA-PL，提示腫瘤細(xì)胞更容易受到鐵死亡的影響[12]。與正常細(xì)胞相比，腫瘤細(xì)胞對細(xì)胞內(nèi)高水平的ROS 更敏感，常用的化療藥物如鉑類、紫杉烷類等均可通過誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生大量ROS，從而激活鐵死亡相關(guān)通路，促使腫瘤細(xì)胞死亡[13]。但是化療藥物大劑量給藥容易引起胃腸道反應(yīng)、骨髓抑制、肝腎功能損害等并發(fā)癥，對患者正常生活造成一定影響[14]。

中藥提取物對腫瘤鐵死亡的應(yīng)用

在歷史古籍中，應(yīng)用中醫(yī)藥抗腫瘤的記載數(shù)不勝數(shù)，隨著現(xiàn)代科技的發(fā)展，中藥提取物作為一種采用先進(jìn)的工藝技術(shù)對中藥材或中藥復(fù)方進(jìn)行提取分離加工而得到的具有相對明確藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)，逐漸被人們應(yīng)用研究。近幾年，中藥提取物在腫瘤鐵死亡的研究展現(xiàn)出巨大的研究前景。通過既往文獻(xiàn)報(bào)道可知，從鐵死亡途徑干預(yù)腫瘤疾病的單體及提取物研究較多，見表1。

表1 中草藥的活性成分從鐵死亡途徑干預(yù)腫瘤疾病

1 山豆根提取物對Nrf2 的反向調(diào)控機(jī)制

Nrf2 作為調(diào)節(jié)氧化還原的核轉(zhuǎn)錄因子，控制細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡蛋白（如GPX4 和SLC7A11）的表達(dá)，下調(diào)Nrf2 可以促使鐵死亡的發(fā)生[18]。而山豆根提取物——苦參堿[20]研究發(fā)現(xiàn)可以激活PERK，其作為Nrf2 的上游結(jié)構(gòu)，可以調(diào)控Nrf2 表達(dá)增加，進(jìn)而促進(jìn)下游HO-1 的表達(dá)，抑制SLC7A11、GPX4 的表達(dá)，誘導(dǎo)CNE1 鐵死亡。有報(bào)道[20]稱PERK 激活后磷酸化轉(zhuǎn)錄因子Nrf2，促使Nrf2 / Keap1 復(fù)合物解離后核轉(zhuǎn)錄，可與抗氧化反應(yīng)元件（ARE）相互作用并激活各種基因，包括HO-1，GCLM，SLC7A11，GCLC，F(xiàn)TH1，ATF6，NQO1，GAPDH 和ATF3，以及Nrf2 本身內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和未折疊蛋白反應(yīng)都被記錄為與腫瘤的發(fā)展有關(guān)，其中HO-1 是一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)錨定的酶，可將血紅素代謝為促氧化亞鐵，高表達(dá)時促進(jìn)鐵積累和 ROS 生成。山豆根作為一種清熱解毒的藥物，其對Nrf2 的調(diào)節(jié)作用可能與激活HO-1 有關(guān)。

2 GPX4 泛素化影響

瓜蒂的活性成分葫蘆素B[21]對Huh-7 的SLC7A11，Transferrin，SLC40A1 表達(dá)變化較小，而GPX4表達(dá)明顯抑制，且Nrf2 和HO-1 的蛋白表達(dá)也明顯降低，依據(jù)這一特點(diǎn)使用免疫共沉淀法檢測發(fā)現(xiàn)葫蘆素B 可以加速GPX4 的泛素化和降解，從而起到鐵死亡的作用。β-欖香烯[22]處理A549，NCI-H460，SPC-A-1 同樣能促進(jìn)GPX4 的泛素化，且聯(lián)合轉(zhuǎn)錄因子TFEB（是自噬-溶酶體途徑的主要調(diào)節(jié)因子）過表狀態(tài)時結(jié)果更為明顯，表明TFEB 促進(jìn)了β-欖香烯誘導(dǎo)的GPX4 溶酶體降解，兩者結(jié)合并激活TFEB從而介導(dǎo)其誘導(dǎo)的鐵死亡發(fā)生。對GPX4 泛素化的研究表明多種途徑都可以造成脂質(zhì)過氧化GPX4 過表達(dá)，并不是單一的從半胱氨酸途徑發(fā)生的鐵死亡。探討α-常春藤皂苷[27]誘導(dǎo)Bel-7402 鐵死亡的可能機(jī)制與下調(diào)xCT 和GPX4 的表達(dá)，上調(diào)DMT1 的表達(dá)有關(guān)。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)鐵代謝紊亂，二價金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白DMT1 轉(zhuǎn)運(yùn)更多的Fe2+到細(xì)胞質(zhì)不穩(wěn)定的鐵池中，促使fenton 反應(yīng)生成ROS 堆積誘發(fā)鐵死亡，DMT1 也是檢測鐵死亡的一個關(guān)鍵指標(biāo)。FHC（又稱FTH1），鐵蛋白重鏈FHC 是一種鐵結(jié)合蛋白，在宿主防御氧化應(yīng)激方面起著重要作用[29]。細(xì)胞色素C 氧化酶（COX）是線粒體電子傳遞鏈的末端酶，線粒體電子傳遞鏈的破壞會導(dǎo)致電子泄露，誘導(dǎo)線粒體ROS 的產(chǎn)生[30]，COX2 可作為一種檢測鐵死亡的敏感蛋白[28]，提示線粒體的受損和鐵死亡的發(fā)生。FACL4 又稱酰基輔酶A 合成酶長鏈家族成員4（ACSL4）是多不飽和脂肪酸（PUFAs）代謝的重要同工酶。ACSL4 是脂質(zhì)生物合成的重要酶，也有助于鐵死亡的執(zhí)行，含鐵酶脂氧合酶通過產(chǎn)生脂質(zhì)氫過氧化物是鐵死亡的主要啟動子，其功能依賴于ACSL4 依賴性脂質(zhì)生物合成的激活[34]。GPX4，SLC7A11 和FTH1 被認(rèn)為是鐵死亡負(fù)調(diào)節(jié)特征的相關(guān)基因，它們的表達(dá)抑制意味著鐵死亡的發(fā)生[35]。鐵死亡的檢測指標(biāo)多種多樣，而GPX4 是其中的關(guān)鍵性指標(biāo)，對于致使GPX4 降低的途徑，近來發(fā)現(xiàn)還可以通過泛素化對其影響，是研究中藥活性成分對鐵死亡影響的新發(fā)現(xiàn)，但是也有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)GPX4 上調(diào)也意味著鐵死亡的發(fā)生，是細(xì)胞內(nèi)部氧化應(yīng)激發(fā)生激烈反應(yīng)的表現(xiàn)，未來還有待更多的中藥成分研究驗(yàn)證。

3 眾多中藥活性成分參與p53 的調(diào)控機(jī)制

眾多實(shí)驗(yàn)表明p53 參與了鐵死亡的進(jìn)展，對于p53 的研究發(fā)現(xiàn)，p53 腫瘤抑制途徑的失活是大多數(shù)人類惡性腫瘤形成的關(guān)鍵事件，p53 蛋白通過作為選擇性調(diào)節(jié)某些p53 轉(zhuǎn)錄靶基因表達(dá)的DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子來實(shí)現(xiàn)其多樣化的細(xì)胞結(jié)果，經(jīng)過實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)SLC7A11 基因是p53 介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制的靶標(biāo)，當(dāng)p53被沉默時，SLC7A11 的下調(diào)被解除[36]。另有研究發(fā)現(xiàn)，巴伐欽通過STAT3/P53/SLC7A11 軸誘導(dǎo)鐵死亡[42]。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)器和轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）屬于STAT家族，是參與腫瘤進(jìn)展的重要轉(zhuǎn)錄因子。實(shí)驗(yàn)研究表明，Nrf2 和STAT3 通過調(diào)節(jié)SLC7A11 在鐵死亡中起關(guān)鍵作用[43]，目前發(fā)現(xiàn)的中藥活性成分對P53 的研究主要集中在清熱藥（如連翹、重樓、黃芩等）、殺蟲藥（如土荊皮、毛泡桐、藤黃等）、少部分在活血藥（如丹參）、補(bǔ)虛藥（如補(bǔ)骨脂）。

4 中藥活性成分參與鐵死亡與鐵自噬的研究

另有少數(shù)實(shí)驗(yàn)對自噬與鐵死亡進(jìn)行了研究，槐耳提取物[45]對SW620 基于（半）胱氨酸/GSH/GPX4 軸為基礎(chǔ)進(jìn)一步研究了HMGB1 做為自噬調(diào)節(jié)劑及信號傳導(dǎo)因子也參與細(xì)胞的鐵死亡。這是中藥單體或提取物對自噬在鐵死亡中的初步探討。自噬根據(jù)降解底物有無專一性，可分為選擇性與非選擇性自噬，鐵自噬是一種特殊類型的鐵蛋白選擇性自噬降解，過度激活鐵自噬會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鐵過載，增加細(xì)胞對鐵死亡的敏感性，從而誘導(dǎo)GSH 耗竭和GPX4 的減少，導(dǎo)致鐵死亡的發(fā)生。在HepG2 和Hep3B 中均觀察到重樓皂苷Ⅱ通過NCOA4/FTH1 鐵蛋白吞噬誘導(dǎo)鐵死亡[46]。NCOA4 是負(fù)責(zé)鐵蛋白吞噬降解鐵蛋白的載體，高水平表達(dá)的NCOA4 細(xì)胞更容易對鐵蛋白自噬敏感，NCOA4/FTH1 是介導(dǎo)鐵離子釋放的主要過程，是一種調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鐵離子含量的選擇性自噬方式。《藥性論》記載槐耳具有破血之功效，《神農(nóng)本草經(jīng)》記載重樓具有清熱解毒、消腫止痛之功效，抗腫瘤治療中主要以活血及清熱解毒消腫為主，符合用藥原則，而目前對于鐵自噬的研究主要以這類藥物為主，未來有望進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)這一類藥物對鐵自噬的共性。

查閱近幾年文獻(xiàn)，綜上可見，目前中藥單體或提取物對鐵死亡抗癌的實(shí)驗(yàn)研究主要集中在SLC7A11/GPX4 這一條經(jīng)典的抗氧化系統(tǒng)，相關(guān)檢測指標(biāo)表現(xiàn)為鐵離子、ROS、MDA 含量的增加，GSH、SOD 含量的降低，且抗氧化抑制劑、鐵死亡抑制劑等均可逆轉(zhuǎn)其鐵死亡的現(xiàn)象，而對于鐵自噬與鐵死亡的實(shí)驗(yàn)[47]通過與正常細(xì)胞的毒性試驗(yàn)對比驗(yàn)證了中藥單體或提取物在發(fā)揮鐵死亡抗腫瘤的安全性，為中藥抗腫瘤安全性提供了理論依據(jù)。以上藥物主要集中在補(bǔ)虛、清熱解毒、活血化瘀等角度，符合腫瘤的病因病機(jī)，體現(xiàn)中醫(yī)藥治療特色。以不同腫瘤的相似研究作為參考范式，對中醫(yī)藥參與腫瘤疾病的診治同樣具有借鑒意義。

中藥復(fù)方對腫瘤鐵死亡的應(yīng)用

1 左金丸

左金丸源自《丹溪心法》黃連與吳茱萸以6∶1為比例配對而成方。衛(wèi)真真等[48]對SW620、LoVo、HCT116、HT29 和Caco2（均為人結(jié)腸癌細(xì)胞株）使用西妥昔單抗單獨(dú)對鐵死亡相關(guān)蛋白水平的表達(dá)沒有明顯的改變，但是聯(lián)合左金丸（黃連、吳茱萸）使用時Nrf2、SLC7A11、GPX4、MDM2 呈濃度依賴性減少，p53 呈濃度依賴性增強(qiáng)，且在使用凋亡抑制劑Z-VAD-FMK、壞死抑制劑necrostatin-1 條件下不能逆轉(zhuǎn)細(xì)胞死亡，當(dāng)使用了鐵死亡抑制劑fer-1 西妥昔單抗對結(jié)腸癌耐藥的作用再次被表達(dá)，表明左金丸可通過誘導(dǎo)鐵死亡增強(qiáng)KRAS 突變型腸癌細(xì)胞并增強(qiáng)對西妥昔單抗的敏感性。

2 固本消積方

還有研究者[49-51]研究國醫(yī)大師潘敏求“肝復(fù)方”化裁而來的固本消積方（人參、黃芪、白術(shù)、茯苓、莪術(shù)、土鱉蟲、石見穿、預(yù)知子、重樓、半枝蓮）含藥血漿誘導(dǎo)HepG2（人肝癌細(xì)胞）鐵死亡發(fā)現(xiàn)可通過調(diào)節(jié) p62/Keapl/NRF2 通路；或是調(diào)節(jié)GPX4 實(shí)現(xiàn)肝癌鐵死亡，還進(jìn)一步探索了TRPV1 與GPX4 的關(guān)系，生信統(tǒng)計(jì)在肝癌中TRPV1 與GPX4 呈負(fù)相關(guān)，即激活TRPV1 可以抑制GPX4 的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)使用TRPV1 拮抗劑對GPX4 蛋白表達(dá)檢測發(fā)現(xiàn)固本消積方干預(yù)后的表達(dá)量低于拮抗劑干預(yù)后的；或是通過調(diào)節(jié)ACSL4、LPCAT3、LOX、NOX1 等脂質(zhì)過氧化關(guān)鍵蛋白的表達(dá)誘導(dǎo)肝癌鐵死亡。上述組方立足抗氧化系統(tǒng)和脂肪酸積累途徑兩條通路展現(xiàn)了鐵死亡在抗腫瘤中的作用，極大的豐富了中藥組方在鐵死亡調(diào)控中的藥用譜，體現(xiàn)了具有多靶點(diǎn)、多通路協(xié)同作用的優(yōu)勢。

小結(jié)與展望

鐵死亡的研究逐漸增多，前期主要是化合物的研究，近年來，中藥作為天然化合物的研究越來越流行，目前國內(nèi)外主流研究主要是基于中藥單體或者是提純物的研究，中藥復(fù)方對腫瘤鐵死亡的研究相對較少，可能與腫瘤復(fù)雜的病機(jī)有關(guān)，并沒有過多明確的組方用之，未來可以立足名老中醫(yī)經(jīng)驗(yàn)的總結(jié)更多探索。鑒于鐵死亡中觀察到的獨(dú)特特征，有可能建立新的潛在的抗癌治療，可能克服與特定凋亡信號通路的失活或耐藥癌細(xì)胞中遇到的改變靶點(diǎn)相關(guān)的多藥耐藥現(xiàn)象。GPX4 和System-Xc 作為協(xié)調(diào)鐵死亡過程的關(guān)鍵，大多數(shù)實(shí)驗(yàn)主要是基于此系統(tǒng)的研究，結(jié)合國外目前的研究發(fā)現(xiàn)，還有脂肪酸積累、鐵積累與鐵自噬、甲羥戊酸等途徑，還有待更多的單體提純物或復(fù)方去進(jìn)一步研究，豐富中醫(yī)藥鐵死亡抗腫瘤的機(jī)制研究，為中醫(yī)藥抗腫瘤提供更多的理論依據(jù)。