河北魚(yú)源氣單胞菌分離株耐藥性研究

于子簫　田洋　李全振　趙寶華　陳佳樂(lè)　李清揚(yáng)

摘要：為研究河北省魚(yú)源氣單胞菌（Aeromonas spp.）分離株耐藥性，選取13種常見(jiàn)抗生素，對(duì)102株淡水魚(yú)源氣單胞菌進(jìn)行K-B紙片法藥物敏感性實(shí)驗(yàn)，并使用PCR方法檢測(cè)相應(yīng)耐藥基因。結(jié)果顯示102株受試菌株對(duì)13種抗生素表現(xiàn)出不同的耐藥率，產(chǎn)生耐藥性的抗生素種類范圍為1～7種，共獲得多重耐藥菌44株，不同菌株耐藥表型較豐富。分離株對(duì)阿莫西林的耐藥率高達(dá)92.2%;對(duì)四環(huán)素的耐藥率為18.6%;對(duì)頭孢拉定的耐藥率為13.7%，對(duì)頭孢呋辛、頭孢他啶、頭孢吡肟三種抗生素均不耐藥。耐藥基因檢出結(jié)果與耐藥表型不完全一致。

關(guān)鍵詞：氣單胞菌（Aeromonas spp.）;耐藥性;多重耐藥菌

細(xì)菌對(duì)于抗菌藥物的耐藥性是由基因介導(dǎo)的遺傳進(jìn)化事件[1]，耐藥性可能是由質(zhì)粒[2]、整合子[3]介導(dǎo)的，耐藥基因也可能存在于細(xì)菌基因組中[4]。除脆弱氣單胞菌（Aeromonas trota）和少數(shù)菌株外，氣單胞菌對(duì)氨芐青霉素有耐藥性，同時(shí)這些細(xì)菌也對(duì)其他青霉素耐藥[5]，但對(duì)單環(huán)內(nèi)酰胺類、第三代第四代頭孢菌素、氨基糖苷類、氟喹諾酮類以及碳青霉烯類抗菌藥物敏感[6]。

盡管氣單胞菌早已作為常見(jiàn)病原體為人所知[7]，美國(guó)實(shí)驗(yàn)室和臨床標(biāo)準(zhǔn)學(xué)會(huì)（CLSI）在近年才發(fā)布關(guān)于檢測(cè)氣單胞菌的操作指南[8]。CLSI推薦使用MH瓊脂進(jìn)行K-B紙片法測(cè)定抗生素敏感性。雖在一些菌種中發(fā)現(xiàn)了對(duì)某種抗生素的特異性敏感，但對(duì)于這個(gè)結(jié)果的研究不夠充分，所以學(xué)界目前認(rèn)為分離株對(duì)抗菌藥物的敏感性似乎與菌種無(wú)關(guān)[9]。

本研究選取10類共13種常見(jiàn)抗生素，對(duì)102株河北省水產(chǎn)技術(shù)推廣總站提供的2020—2021年分離自河北省多個(gè)地區(qū)淡水魚(yú)樣品的氣單胞菌進(jìn)行K-B紙片法藥物敏感性實(shí)驗(yàn)，研究耐藥表型相關(guān)耐藥基因，分析菌株產(chǎn)生耐藥性的原因，為河北省淡水魚(yú)氣單胞菌的合理用藥和病害防治提供指導(dǎo)。

1材料與方法

1.1試劑

實(shí)驗(yàn)主要試劑見(jiàn)表1。

1.2氣單胞菌藥物敏感性實(shí)驗(yàn)

使用大腸桿菌（Escherichia coli）ATCC25922、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）ATCC27853作為質(zhì)控菌株。將受試菌株接種于LB培養(yǎng)基或腦心浸液瓊脂過(guò)夜培養(yǎng)，挑取單菌落直接重懸于0.9%生理鹽水制成菌懸液，將濃度矯正為0.5麥?zhǔn)蠞岫龋鶆蛲坎加贛H瓊脂培養(yǎng)基，28 ℃倒置培養(yǎng)18～24 h。使用游標(biāo)卡尺記錄抑菌圈直徑。參考CLSI2020指南，確定氣單胞菌耐藥表型并統(tǒng)計(jì)分離株耐藥種類數(shù)據(jù)?？股嘏卸ㄕ埸c(diǎn)見(jiàn)表2。統(tǒng)計(jì)抗生素耐藥種類數(shù)據(jù)。

1.3耐藥基因型分析

將102株受試菌株，接種于適量LB液體培養(yǎng)基或腦心浸液肉湯30 ℃、180 r/min過(guò)夜培養(yǎng)，4 ℃，10 000 r/min離心1 min收集菌體，使用EasyPure Genomic DNA Kit提取基因組DNA作為模板保存于-20 ℃冰箱備用。參考文獻(xiàn)[10-11]合成多種耐藥基因引物，使用PCR方法檢測(cè)各類耐藥基因在該耐藥表型下的攜帶情況，

引物信息見(jiàn)表3。無(wú)菌水代替模板作為陰性對(duì)照。取5 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳120 V、30 min，產(chǎn)物使用凝膠成像系統(tǒng)拍照。統(tǒng)計(jì)耐藥基因檢出率，得到耐藥表型和耐藥基因型符合率，分析氣單胞菌對(duì)不同種類抗生素產(chǎn)生耐藥性的原因。

2結(jié)果與分析

2.1藥物敏感性實(shí)驗(yàn)

整理抑菌圈直徑，比對(duì)CLSL2020指南得到102株受試菌株對(duì)13種常見(jiàn)抗生素的耐藥情況，見(jiàn)表4。分離株對(duì)抗生素耐藥種類數(shù)據(jù)見(jiàn)表5。

由表4可以看出，102株受試菌株對(duì)13種抗生素表現(xiàn)出不同的耐藥率，其中對(duì)阿莫西林的耐藥率最高，高達(dá)92.2%;對(duì)四環(huán)素耐藥率較高，耐藥率為18.6%;一代頭孢菌素類頭孢拉定耐藥率為13.7%，但中度敏感率高達(dá)58.8%，但對(duì)頭孢呋辛、頭孢他啶、頭孢吡肟三種抗生素均不耐藥，且只有一株對(duì)頭孢呋辛中度敏感。值得一提的是，這三種藥分別為第二代、三代、四代頭孢菌素。對(duì)復(fù)方新諾明（4.9%）、美羅培南（8.8%）、氟苯尼考（9.8%）呈現(xiàn)出不同程度的耐藥。其中僅有2（2.0%）株耐氨曲南，1（10%）株中度敏感;3（29%）株耐阿卡米星，1（1.0%）株中度敏感;1（1.0%）株耐多黏菌素B，2（2.0%）株中度敏感。產(chǎn)生稀有耐藥性的原因可能為表達(dá)了抗菌劑外排泵基因qacE△1。所有受試菌株均對(duì)阿莫西林不敏感，推測(cè)氣單胞菌對(duì)阿莫西林天然耐藥，需要進(jìn)一步研究其耐藥基因表達(dá)情況。耐藥種類統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明不同分離株對(duì)1～7種抗生素產(chǎn)生耐藥性，耐藥表型較為豐富。多重耐藥菌指對(duì)三種或三種以上抗生素產(chǎn)生耐藥的細(xì)菌，本研究共獲得44株多重耐藥菌。

2.2耐藥基因PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)

檢測(cè)各個(gè)菌株耐藥表型對(duì)應(yīng)的耐藥基因。檢測(cè)所有多重耐藥菌的氨基糖苷類耐藥基因ant（3”）-Ⅰ和獲得性抗菌劑外排泵基因qacE△1。部分電泳結(jié)果如圖1所示。

2.3耐藥基因型分析

共檢測(cè)11種7類耐藥基因，檢出率見(jiàn)表6。

除磺胺類sul3基因和酰胺醇類catA7基因以及喹諾酮類oqxB基因3個(gè)耐藥基因未擴(kuò)增成功，其余8種耐藥基因均擴(kuò)增成功。由擴(kuò)增結(jié)果可知，102株細(xì)菌均檢出TEM基因，與先前推測(cè)的氣單胞菌對(duì)阿莫西林天然耐藥相符合。

在18株耐復(fù)方新諾明（SXT）的菌株中，其中9株擴(kuò)增出磺胺類耐藥基因sul2，與耐藥表型符合率為50%;在11株耐藥譜含氟苯尼考（FLR）的菌株中，8株擴(kuò)增出耐藥基因floR，與耐藥表型符合率為72.7%。

在20株耐四環(huán)素（TCY）的菌株中，tet（A）、tet（B）、tet（E）檢出數(shù)分別為15（75%）、6（30%）、8（40%）。

44株多重耐藥菌中，10株檢出氨基糖苷類耐藥基因ant（3”）-Ⅰ，檢出率為22.7%。其中3株細(xì)菌藥敏試驗(yàn)中對(duì)阿卡米星（AMK）耐藥，均檢出該耐藥基因，符合率100%;12株檢出獲得性抗菌劑外排泵基因qacE△1，檢出率為27.2%。

3討論

近年來(lái)，氣單胞菌感染引起的人類健康問(wèn)題和養(yǎng)殖業(yè)病害問(wèn)題屢見(jiàn)不鮮，學(xué)界對(duì)其耐藥性研究日漸深入。Ndi等[12]研究表明氣單胞菌存在編碼產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶的基因，所以對(duì)青霉素類、碳青霉烯類、單環(huán)-β內(nèi)酰胺類等的耐藥性增加。

Benthotage等[13]在蝦夷扇貝中分離得到多株氣單胞菌，報(bào)道對(duì)黏菌素、萬(wàn)古霉素、克林霉素、紅霉素、利福平等抗菌藥物耐藥。Alcaide等[14]從臨床和水及鰻魚(yú)分離的205株氣單胞菌中33（16.1%）株對(duì)喹諾酮類具有耐藥性，Wimalasena等[15]報(bào)道從寵物海龜中分離得到耐藥氣單胞菌，提示寵物是人類感染氣單胞菌的途徑之一;Goni-vrriza等[16]在西班牙Arga河以及城市污水中分離獲得氣單胞菌110株，抗生素敏感性試驗(yàn)結(jié)果表明高達(dá)72%的菌株對(duì)喹諾酮類抗生素萘啶酸產(chǎn)生抗性，另外產(chǎn)生較高耐藥性的抗生素是四環(huán)素（21%）和復(fù)方新諾明（14%），對(duì)氯霉素、β-內(nèi)酰胺類和氨基糖苷類的耐藥性較弱（≤5%），此外他們認(rèn)為耐藥菌株可以通過(guò)污水傳播到多種環(huán)境中。Odeyemi等[17]對(duì)53株分離自馬來(lái)西亞馬六甲市的氣單胞菌進(jìn)行耐藥性檢測(cè)，對(duì)四環(huán)素（100%）、卡那霉素（5.7%）、慶大霉素（57%）和土霉素（24.5%）耐藥。這與本研究四環(huán)素（186%）耐藥情況差異較大，推測(cè)原因?yàn)楹颖钡貐^(qū)和馬來(lái)西亞馬六甲市抗生素使用情況不同，環(huán)境壓力也不同，造成了不同的耐藥性情況。

本研究中從河北不同淡水魚(yú)養(yǎng)殖場(chǎng)分離獲得多重耐藥菌44株，獲得率為43.14%，屬中等程度多重耐藥情況，反映了可能存在抗生素使用不合理的現(xiàn)象。102株受試菌對(duì)阿莫西林耐藥率接近100%，在養(yǎng)殖過(guò)程中應(yīng)禁止使用該類抗生素;對(duì)四環(huán)素、頭孢拉定、美羅培南、氟苯尼考、復(fù)方新諾明等不同類型抗生素產(chǎn)生不同程度耐藥性，提示可能發(fā)生的耐藥流行情況，為河北淡水魚(yú)養(yǎng)殖行業(yè)制定合理抗生素使用計(jì)劃提供理論依據(jù)。

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Antibiotic resistance of Aeromonas isolated from fish in Hebei Province

YU Zixiao1，TIAN Yang2，LI Quanzhen2，ZHAO Baohua1，CHEN Jiale1，LI Qingyang1

（1.Hebei Normal University，Shijiazhuang 050024，China;2.Hebei Fisheries Technology Extension Center，Shijiazhuang 050035，China）

Abstract：To investigate the drug resistance of Aeromonas spp. isolated from fish raised in Hebei Province，13 kinds of antibiotics were selected， drug susceptibility experiments were performed by K-B disk diffusion method on 102 isolated freshwater fish Aeromonas spp.，and PCR was used to detect the corresponding drug resistance genes.These isolated Aeromonas spp. showed different resistance rates to 13 antimicrobial agents，and showed resistance to 1 to 7 of them.A total of 44 strains of multi-drug resistant bacteria were obtained， and abundant drug-resistant phenotype was found in different strains.The resistance rate of the isolated Aeromonas spp. to amoxicillin was as high as 92.2%， the resistance rate to tetracycline was 18.6%; the resistance rate to cefradine was 13.7%， and no resistant was found to cefuroxime， ceftazidime， or cefepime.The results of resistance gene detection were not fully consistent with the resistance phenotype.

Key words：Aeromonas spp.; antibiotic resistance; multi-drug resistant bacteria

（收稿日期：2022-03-04）

基金項(xiàng)目：河北省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系淡水養(yǎng)殖創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)資助（項(xiàng)目編號(hào)：HBCT2018180207）。

作者簡(jiǎn)介：于子簫（1996.12-），男，碩士研究生，研究方向：分子細(xì)菌學(xué)。E-mail：435012821@qq.com。

通信作者：李清揚(yáng)（1992.6-），女，講師，研究方向：食源性致病微生物學(xué)。E-mail：qingyangli@hebtu.edu.cn。DOI：10.3969/j.issn.1004-6755.2022.05.001