蛋白質(zhì)磷酸化和亞硝基化互作對(duì)宰后羊肉嫩度的影響

杜曼婷，高夢(mèng)麗，游紫燕，李 可，白艷紅,*

（1.鄭州輕工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450001；2.河南省冷鏈?zhǔn)称焚|(zhì)量安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450001；3.食品生產(chǎn)與安全河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 鄭州 450001）

肉嫩度是重要的肉品質(zhì)之一，也是吸引消費(fèi)者購(gòu)買的主要因素[1-2]。影響宰后肉嫩度的因素最主要的是肌原纖維蛋白和細(xì)胞骨架蛋白的降解[3-4]。鈣蛋白酶系統(tǒng)主要包括μ-鈣蛋白酶、m-鈣蛋白酶和鈣蛋白酶抑制蛋白，其中，μ-鈣蛋白酶參與宰后肌肉肌原纖維蛋白和細(xì)胞骨架蛋白的降解[5-6]，對(duì)宰后肌肉的嫩化具有重要作用。在宰后復(fù)雜的生理生化變化過(guò)程中，蛋白質(zhì)翻譯后修飾如磷酸化和亞硝基化會(huì)作用于μ-鈣蛋白酶或肌原纖維蛋白，使其結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生變化，進(jìn)而影響μ-鈣蛋白酶的降解活性或肌原纖維蛋白對(duì)蛋白酶降解作用的敏感性，導(dǎo)致肌原纖維蛋白和細(xì)胞骨架蛋白的降解程度發(fā)生改變，最終影響宰后肉的嫩度。

研究表明，低嫩度組羊肉肌原纖維蛋白的整體磷酸化水平高于高嫩度組，肌原纖維蛋白的磷酸化差異大多數(shù)與肌肉收縮相關(guān)；磷酸化會(huì)降低μ-鈣蛋白酶對(duì)肌原纖維蛋白的降解，引起肌肉收縮，降低肉嫩度[7-10]。本團(tuán)隊(duì)前期研究了肌漿蛋白磷酸化對(duì)μ-鈣蛋白酶活性的影響，發(fā)現(xiàn)μ-鈣蛋白酶的磷酸化負(fù)向調(diào)控其活性，進(jìn)一步研究了磷酸化對(duì)純?chǔ)?鈣蛋白酶的活性調(diào)控機(jī)制，發(fā)現(xiàn)磷酸化和去磷酸化均正向調(diào)控μ-鈣蛋白酶活性，過(guò)高的溫度和鈣離子濃度會(huì)削弱磷酸化對(duì)μ-鈣蛋白酶的作用[11-12]。Hou Qin等[13]發(fā)現(xiàn)S-亞硝基谷胱甘肽（S-nitrosoglutathione，GSNO）處理會(huì)提高蛋白質(zhì)的亞硝基化水平而一氧化氮合成酶抑制劑卻會(huì)降低蛋白質(zhì)的亞硝基化水平，并且蛋白質(zhì)的亞硝基化會(huì)降低μ-鈣蛋白酶的自溶、肌原纖維蛋白和肌間線蛋白的降解、提高剪切力，而去亞硝基化處理后結(jié)果相反，表明蛋白質(zhì)亞硝基化通過(guò)抑制μ-鈣蛋白酶自溶和肌原纖維蛋白降解降低肉嫩度。張朝陽(yáng)[14]也得到類似的研究結(jié)果。劉瑞[15]在離體條件下對(duì)肌原纖維蛋白進(jìn)行不同程度的亞硝基化修飾，研究其對(duì)μ-鈣蛋白酶蛋白水解的敏感性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，肌原纖維蛋白的亞硝基化修飾使其對(duì)μ-鈣蛋白酶的敏感性發(fā)生改變，抑制了肌鈣蛋白-T的降解，但促進(jìn)肌間線蛋白的降解。

以上相關(guān)研究表明，蛋白質(zhì)磷酸化和蛋白質(zhì)亞硝基化均會(huì)對(duì)宰后肉嫩度產(chǎn)生影響。在宰后肌肉成熟的過(guò)程中，肌細(xì)胞會(huì)發(fā)生一系列復(fù)雜的生化變化，蛋白質(zhì)磷酸化和蛋白質(zhì)亞硝基化往往會(huì)伴隨這些變化同時(shí)發(fā)生，或通過(guò)交互作用共同調(diào)控宰后肉嫩度。目前的研究主要集中在蛋白質(zhì)磷酸化、蛋白質(zhì)亞硝基化等單一翻譯后修飾對(duì)宰后肉品質(zhì)的影響，而對(duì)蛋白質(zhì)磷酸化和蛋白質(zhì)亞硝基化如何交互調(diào)控共同作用于宰后肉品質(zhì)的相關(guān)研究鮮有報(bào)道。因此，本研究采用不同處理方式使宰后羊背最長(zhǎng)肌獲得不同程度的磷酸化和亞硝基化修飾水平，通過(guò)探究不同水平磷酸化和亞硝基化處理對(duì)宰后羊背最長(zhǎng)肌pH值、肌原纖維小片化指數(shù)（myofibrillar fragmentation index，MFI）、肌原纖維蛋白降解程度的影響，明確蛋白質(zhì)磷酸化和亞硝基化對(duì)宰后羊肉嫩度的交互影響作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選用3 只10 月齡的小尾寒公羊購(gòu)自河南鄭州滎陽(yáng)某屠宰場(chǎng)，飼養(yǎng)條件、生理成熟度等條件一致，胴體質(zhì)量約為25 kg。在宰后30 min內(nèi)迅速取羊背最長(zhǎng)肌，剔除脂肪和肉眼可見(jiàn)的筋膜，低溫運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室備用。

磷酸酶抑制劑、蛋白酶抑制劑 瑞士Roche公司；激酶抑制劑 美國(guó)Abmole公司；GSNO、一氧化氮合成酶抑制劑（NG-nitro-L-arginine-methyl ester hydrochloride，L-NAME）美國(guó)Sigma公司；三羥甲基氨基甲烷、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、過(guò)硫酸銨、四甲基乙二胺 上海麥克林生化科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

T25高速勻漿機(jī) 德國(guó)IKA公司；TGL-20KR高速冷凍離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；Tecan-Spark-20M多功能微孔板檢測(cè)儀 上海迪奧生物科技有限公司；Mini-PROTEAN Tetra電泳設(shè)備、Mini Trans-Blot轉(zhuǎn)膜設(shè)備、ChemiDocTMXRS＋凝膠成像儀、ChemiDocTMMP凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)Bio-Rad公司；Milli-Q?Reference超純水系統(tǒng) 德國(guó)Merck Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

將同一只羊的雙側(cè)背最長(zhǎng)肌切塊混勻絞碎后隨機(jī)均分成6 個(gè)組，每組3 次生物學(xué)重復(fù)。對(duì)照組（C）：向肉糜中添加等體積的生理鹽水；高磷酸化水平組（P＋）：向肉糜中添加磷酸酶抑制劑（每5 g樣品中1 片抑制劑）；低磷酸化水平組（P－）：向肉糜中添加激酶抑制劑（每5 g肉中添加0.144 μmol激酶抑制劑）；亞硝基化處理組（S＋）：向50 g肉糜中添加50 mL 400 μmol/L的GSNO溶液；去亞硝基化處理組（S－）：向50 g肉糜中加入50 mL 0.1 mol/LL-NAME溶液；磷酸化和亞硝基化水平組（P＋＋S＋）：向50 g肉糜中添加磷酸酶抑制劑（每5 g樣品中1 片抑制劑）和50 mL 400 μmol/L GSNO溶液。并在4 ℃環(huán)境中孵育3 d，為保證宰后肉中的能量不被完全消耗，上述操作均在羊宰后40 min內(nèi)完成。分別在宰后12、24、48、72 h取樣，液氮速凍，于－80 ℃貯藏備用。

1.3.2 肌原纖維蛋白提取

肌原纖維蛋白的提取參考Huang Honggang[16]和Li Chunbao[17]等的方法，并稍作修改。1 g肉樣與6 mL蛋白提取液（100 mmol/L Tris，pH 8.3）、1 片蛋白酶抑制劑（50 mL/片）、2 片磷酸酶抑制劑（25 mL/片），在10 000 r/min條件下冰浴均質(zhì)3 次，每次30 s；然后4 ℃、10 000×g離心30 min，棄上清液，將沉淀在8 mL體積分?jǐn)?shù)為5% SDS溶液（60 ℃）中勻漿30 s后，80 ℃加熱20 min，得到肌原纖維蛋白溶液，分裝后液氮速凍，放置于－80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 樣品制備

用超純水將肌原纖維蛋白溶液稀釋20 倍，BCA法測(cè)定肌原纖維蛋白質(zhì)量濃度并用超純水稀釋至4 mg/mL。肌原纖維蛋白分離參考Chen Lijuan等[7]的方法。制備好的肌原纖維蛋白與上樣緩沖液（100 mmol/L Tris-HCl（pH 6.8）、10 mmol/L二硫蘇糖醇、40 g/L SDS、1 g/L溴酚藍(lán)、250 g/L甘油）等體積混合，混勻后沸水浴5 min，冷卻至室溫，于12 000 r/min離心2 min，取上清液分裝，于－20 ℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 磷酸化水平測(cè)定

采用體積分?jǐn)?shù)4%濃縮膠和體積分?jǐn)?shù)12%分離膠進(jìn)行電泳，濃縮膠電壓70 V，當(dāng)條帶到達(dá)分離膠時(shí)將電壓調(diào)至110 V，并且當(dāng)溴酚藍(lán)指示條帶到達(dá)距離凝膠底部0.5 cm時(shí)停止電泳。電泳結(jié)束后，參照Chen Lijuan等[7]的染色方法，采用Pro-Q Diamond對(duì)磷酸化蛋白進(jìn)行染色，SYPRO Ruby對(duì)全蛋白進(jìn)行染色。先使用固定液（體積分?jǐn)?shù)10%乙酸溶液，體積分?jǐn)?shù)50%甲醇溶液）固定凝膠1 h（30 min，2 次）后水洗30 min（10 min，3 次），Pro-Q Diamond染色液避光孵育染色70 min，用Pro-Q脫色液（體積分?jǐn)?shù)20%乙腈溶液，50 mmol/L乙酸鈉，pH 4.0）避光脫色1 h（30 min，2 次）后水洗15 min（5 min，3 次），采用凝膠成像儀掃描磷酸化蛋白染色條帶。而后將凝膠用SYPRO Ruby染色液避光過(guò)夜染色，SYPRO Ruby脫色液（體積分?jǐn)?shù)7%乙酸溶液，體積分?jǐn)?shù)10%乙醇溶液）避光脫色1 h（30 min，2 次）后水洗15 min（5 min，3 次），采用凝膠成像儀掃描全蛋白染色條帶。使用Quantity One軟件分析蛋白質(zhì)磷酸化水平。蛋白質(zhì)磷酸化水平為整體磷酸化蛋白光密度值（P）與全蛋白光密度值（T）的比值。

1.3.5 亞硝基化水平測(cè)定

參考Zhang Chaoyang等[18]的方法略作修改，將羊背最長(zhǎng)肌切碎并加入提取緩沖液（50 mmol/L NaCl和50 mmol/L NH4HCO3，pH 7.8），12 000 r/min勻漿2 次，每次30 s，8 000×g冷凍離心勻漿10 min，吸取上清液，用BCA試劑盒測(cè)上清液蛋白質(zhì)量濃度，并用緩沖液將蛋白質(zhì)量濃度稀釋至1 mg/mL，然后進(jìn)行亞硝基硫醇（S-nitrosothiol，SNO）含量測(cè)定。取50 μL蛋白溶液分別與溶液A（含1 g/100 mL磺胺的0.5 mol/L鹽酸）和溶液B（含0.2 g/100 mL氯化汞的溶液A）等體積混合，室溫避光反應(yīng)5 min；然后加入100 μL溶液C（含0.02 g/100 mLN-(1-萘基)乙二胺二鹽酸鹽的0.5 mol/L鹽酸），室溫（25 ℃）避光反應(yīng)5 min。用酶標(biāo)儀測(cè)定混合物在540 nm波長(zhǎng)處的吸光度。使用200 μmol/L的GSNO溶液倍比稀釋至1.56 μmol/L，測(cè)得吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，由溶液B和溶液A的吸光度差值計(jì)算SNO含量，單位為nmol/mg（以蛋白質(zhì)量計(jì)）。

1.3.6 pH值測(cè)定

參考GB 5009.237—2016《食品pH值的測(cè)定》[19]，略作修改。取0.5 g肉糜，加入5 mL 0.1 mol/L KCl溶液，于12 000 r/min冰浴均質(zhì)，測(cè)定均質(zhì)液的pH值，每組樣液測(cè)定3 次平行。

1.3.7 MFI測(cè)定

參考Culler等[20]的方法并略作修改。約0.5 g肌肉加入5 mL預(yù)冷緩沖液（100 mmol/L KCl、20 mmol/L K2HPO4、1 mmol/L乙二胺四乙酸、1 mmol/L MgCl2，pH 7.1），勻漿2 次，每次30 s，中間間隔1 min。勻漿液在4 ℃、3 000×g條件下離心15 min，棄去上清液，用5 mL預(yù)冷緩沖液重懸，再次離心。再使用1.25 mL緩沖液將沉淀重懸，使用雙縮脲法測(cè)定蛋白質(zhì)量濃度。用緩沖液將蛋白質(zhì)量濃度調(diào)至（0.50±0.05）mg/mL，使用紫外分光度計(jì)測(cè)定540 nm波長(zhǎng)處的吸光度。MFI按下式計(jì)算：

1.3.8 肌原纖維蛋白降解測(cè)定

1.3.8.1 肌間線蛋白降解

采用體積分?jǐn)?shù)4%的濃縮膠和體積分?jǐn)?shù)12%的分離膠進(jìn)行電泳，濃縮膠電壓70 V，當(dāng)指示條帶到達(dá)分離膠時(shí)將電壓調(diào)至110 V，并且當(dāng)溴酚藍(lán)指示條帶到達(dá)距離凝膠底部0.5 cm時(shí)停止電泳。電泳結(jié)束后，去除濃縮膠并取下凝膠，于預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡凝膠和PVDF膜20 min，平衡前將PVDF膜放在無(wú)水甲醇中活化15 s，按照黑板、黑海綿、濾紙、凝膠、PVDF膜、濾紙、黑海綿的順序放置于預(yù)冷轉(zhuǎn)膜緩沖液中，100 V冰浴60 min，結(jié)束后用Tris緩沖鹽溶液（Tris buffered saline，TBS）（10 mmol/L Tris、150 mmol/L氯化鈉，pH 7.5）清洗PVDF膜上的轉(zhuǎn)膜緩沖液（3 次，每次2 min），封閉液（含0.05%吐溫-20、3%牛血清白蛋白的TBS）室溫封閉2 h，一抗使用鼠抗-肌間線蛋白抗體（D1033，稀釋比為1∶1 000），在4 ℃孵育過(guò)夜（14 h）后用含0.1%吐溫-20的TBS（TBS with 0.1% Tween-20，TBST1）洗滌（3 次，每次20 min），然后與二抗（辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的羊抗鼠免疫球蛋白G，稀釋比為1∶2 500）在室溫孵育2 h后用TBST2（50 mmol/L Tris、150 mmol/L氯化鈉、0.1%吐溫-20，pH 7.5）洗滌（3 次，每次10 min），與電化學(xué)發(fā)光顯色液避光孵育后用凝膠成像儀曝光成像。

1.3.8.2 肌鈣蛋白-T降解

肌鈣蛋白-T的降解測(cè)定方法同1.3.8.1節(jié)，但是其采用體積分?jǐn)?shù)15%的分離膠，一抗是鼠抗-肌鈣蛋白-T抗體（ab13003，稀釋比為1∶1 000）。

1.4 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)均3 次重復(fù)，每個(gè)樣品3 次平行，用SPSS 26.0和Origin 21.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行處理，采用單因素方差分析法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，利用Duncan方法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較，其中P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白質(zhì)磷酸化水平分析

不同處理組在不同孵育時(shí)間下的相對(duì)磷酸化水平變化如圖1和圖2所示，各處理組相對(duì)磷酸化水平隨孵育時(shí)間的改變無(wú)顯著變化。在孵育過(guò)程中，磷酸化處理組的相對(duì)磷酸化水平高于對(duì)照組，其他處理組的相對(duì)磷酸化水平則低于對(duì)照組，并且在宰后孵育前期（12 h）和后期（48～72 h），磷酸化處理組的磷酸化水平顯著高于磷酸化和亞硝基化共同處理組（P＜0.05），表明蛋白質(zhì)亞硝基化會(huì)抑制磷酸化修飾反應(yīng)。細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶的亞硝基化會(huì)抑制其磷酸化并導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[21]。但Guequen等[22]研究結(jié)果相反，可能是不同的研究對(duì)象具有不一樣的作用效果。

圖1 Pro-Q磷酸化蛋白（A）和Ruby全蛋白（B）熒光染色圖Fig.1 Fluorescent staining gel images of phosphorylated myofibrillar protein with Pro-Q diamond (A) and total protein with SYPRO Ruby (B)

2.2 蛋白質(zhì)亞硝基化水平分析

SNO含量越高，表明其蛋白質(zhì)亞硝基化程度越大。由圖3可知，不同處理組的SNO含量隨孵育時(shí)間的延長(zhǎng)發(fā)生顯著改變（P＜0.05）。在孵育過(guò)程中，不同處理組間SNO含量差異顯著（P＜0.05），對(duì)照組、亞硝基化處理組和去亞硝基化處理組的亞硝基化水平顯著升高（P＜0.05），而磷酸化處理組的亞硝基化水平卻顯著降低（P＜0.05），亞硝基化處理組的SNO含量顯著高于對(duì)照組，磷酸化與亞硝基化共同處理組的SNO含量顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），磷酸化處理組則在孵育中后期（24～72 h）低于對(duì)照組，磷酸化與亞硝基化共同處理組的SNO含量在反應(yīng)前期和中期（12～48 h）均顯著低于磷酸化處理組，孵育后期（72 h）則顯著高于磷酸化處理組（P＜0.05），表明蛋白質(zhì)磷酸化能夠抑制蛋白質(zhì)亞硝基化反應(yīng)。Chen Yong等[23]研究發(fā)現(xiàn)磷酸化Dexras1導(dǎo)致鐵流量減少，是因?yàn)镈exras1的磷酸化抑制了其亞硝基化水平，與本研究的結(jié)果一致。

圖3 宰后各組在不同孵育時(shí)間下的相對(duì)亞硝基水平Fig.3 Relative S-nitrosylation level of each group at different times of postmortem storage

2.3 pH值分析

pH值是反映宰后肉成熟進(jìn)程的重要指標(biāo)[24]。由圖4可知，在孵育過(guò)程中，去亞硝基化處理組的pH值隨著孵育時(shí)間的延長(zhǎng)顯著降低（P＜0.05），直至趨于穩(wěn)定，一氧化氮合酶抑制劑通過(guò)減少肌肉細(xì)胞中NO含量、加速糖酵解的進(jìn)程，促進(jìn)pH值下降[25]。磷酸化處理組樣品的pH值先顯著升高后顯著降低直至趨于穩(wěn)定，可能是磷酸酶抑制劑促使磷酸基團(tuán)進(jìn)入磷酸化修飾位點(diǎn)導(dǎo)致溶液體系pH值減小，而后由于磷酸化水平的升高加速了糖酵解進(jìn)程[26]。對(duì)照組、去磷酸化處理組、亞硝基化處理組和磷酸化與亞硝基化共同處理組的pH值則是先降低后升高直到趨于穩(wěn)定，這是無(wú)氧糖酵解產(chǎn)生的乳酸、蛋白質(zhì)被降解產(chǎn)生的堿性物質(zhì)以及NO含量共同調(diào)控的結(jié)果[27]。當(dāng)磷酸化和亞硝基化修飾共同作用時(shí)，磷酸化修飾對(duì)pH值的影響占主導(dǎo)作用，并且亞硝基化可能會(huì)促進(jìn)磷酸化對(duì)pH值的進(jìn)一步影響。

圖4 宰后各組在不同孵育時(shí)間下的pH值Fig.4 pH of each group at different times of postmortem storage

2.4 MFI分析

MFI是表征宰后肉嫩度的重要指標(biāo)[28-29]。MFI越大，肌原纖維結(jié)構(gòu)被破壞得越嚴(yán)重，肌原纖維蛋白降解程度越大，肉嫩度越好[30-31]。由圖5可知，在整個(gè)孵育過(guò)程中，亞硝基化處理組、磷酸化與亞硝基化共同處理組的MFI均小于對(duì)照組，并且從孵育24 h起，磷酸化處理組的MFI也低于對(duì)照組。在孵育前期（12 h）和后期（48～72 h），磷酸化處理組的MFI顯著大于磷酸化與亞硝基化共同處理組（P＜0.05），且亞硝基化處理組與磷酸化和亞硝基化共同處理組差異不顯著，表明與蛋白質(zhì)磷酸化相比，亞硝基化對(duì)宰后羊背最長(zhǎng)肌肌原纖維內(nèi)部結(jié)構(gòu)的破壞起主要作用。

圖5 宰后各組在不同孵育時(shí)間下的MFIFig.5 MFI of each group at different times of postmortem storage

2.5 肌原纖維蛋白降解分析

2.5.1 肌間線蛋白降解

肌間線蛋白可作為宰后蛋白降解的標(biāo)志蛋白[32]。如圖6B所示，在整個(gè)孵育過(guò)程中，去磷酸化處理組和亞硝基化處理組的肌間線蛋白相對(duì)降解率始終高于對(duì)照組，但在孵育72 h時(shí)，去磷酸化處理組肌間線蛋白的降解程度低于對(duì)照組，而在孵育過(guò)程中肌間線蛋白相對(duì)降解率一直低于對(duì)照組的去亞硝基化處理組卻在此刻略高于對(duì)照組；磷酸化處理組和磷酸化與亞硝基化共同處理組的肌間線蛋白相對(duì)降解率在宰后羊背最長(zhǎng)肌孵育成熟過(guò)程中均低于對(duì)照組，且在孵育中后期（24～72 h），磷酸化與亞硝基化共同處理組肌間線蛋白的降解程度從顯著低于磷酸化處理組（P＜0.05）最終變化至差異不顯著（P＞0.05）。這表明蛋白質(zhì)亞硝基化會(huì)促進(jìn)肌間線蛋白的降解，而蛋白質(zhì)磷酸化抑制肌間線蛋白的降解，且當(dāng)二者共同存在時(shí)，蛋白質(zhì)磷酸化抑制蛋白質(zhì)亞硝基化修飾進(jìn)程，而蛋白質(zhì)亞硝基化相反可能會(huì)促進(jìn)蛋白質(zhì)磷酸化對(duì)肌間線蛋白降解的抑制作用。

圖6 宰后各組在不同孵育時(shí)間下的肌間線蛋白免疫印跡圖（A）和相對(duì)降解率（B）Fig.6 Western blot image (A) and relative degradation rate (B) of desmin in each group at different times of postmortem storage

2.5.2 肌鈣蛋白-T降解

肌鈣蛋白-T降解是宰后肉嫩化和成熟的標(biāo)志[33]。由圖7可知，在整個(gè)孵育過(guò)程中，磷酸化與亞硝基化共同處理組的肌鈣蛋白-T降解程度始終顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），亞硝基化處理組也低于對(duì)照組，但在孵育72 h顯著高于對(duì)照組。在宰后孵育的12 h內(nèi)，各處理組肌鈣蛋白-T的相對(duì)降解率均低于對(duì)照組，但在24～72 h孵育過(guò)程中，磷酸化處理組、去磷酸化處理組以及去亞硝基化處理組肌鈣蛋白-T的降解程度顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），磷酸化與亞硝基化共同處理組的肌鈣蛋白-T相對(duì)降解率則始終低于亞硝基化處理組。表明在宰后孵育前期（12 h），蛋白質(zhì)磷酸化和蛋白質(zhì)亞硝基化修飾相互促進(jìn)，抑制肌鈣蛋白-T的降解。在孵育中期（24～48 h），蛋白質(zhì)亞硝基化抑制磷酸化反應(yīng)進(jìn)程，而磷酸化促進(jìn)亞硝基化修飾對(duì)肌鈣蛋白-T降解的抑制作用。在孵育后期（72 h），蛋白質(zhì)磷酸化和蛋白質(zhì)亞硝基化相互抑制，導(dǎo)致肌鈣蛋白-T的降解程度明顯降低。

圖7 宰后各組在不同孵育時(shí)間下的肌鈣蛋白-T免疫印跡圖（A）和相對(duì)降解率（B）Fig.7 Western blot image (A) and relative degradation rate (B) of troponin-T in each group at different times of postmortem storage

3 結(jié)論

采用不同處理方式調(diào)控宰后羊背最長(zhǎng)肌的磷酸化和亞硝基化修飾水平，結(jié)果表明，蛋白質(zhì)磷酸化和亞硝基化修飾反應(yīng)可能相互抑制；當(dāng)磷酸化和亞硝基化修飾共同作用時(shí)，磷酸化修飾主要影響pH值的變化，并且亞硝基化會(huì)促進(jìn)磷酸化對(duì)pH值的進(jìn)一步影響；與蛋白質(zhì)磷酸化相比，蛋白質(zhì)亞硝基化對(duì)宰后羊背最長(zhǎng)肌肌原纖維內(nèi)部結(jié)構(gòu)的破壞起主要作用；當(dāng)磷酸化和亞硝基化修飾共同存在時(shí)，蛋白質(zhì)磷酸化抑制蛋白質(zhì)亞硝基化反應(yīng)，而蛋白質(zhì)亞硝基化相反可能會(huì)促進(jìn)蛋白質(zhì)磷酸化對(duì)肌間線蛋白降解的抑制作用；在宰后孵育前期（12 h），蛋白質(zhì)磷酸化和蛋白質(zhì)亞硝基化修飾相互促進(jìn)，在孵育中期（24～48 h），蛋白質(zhì)磷酸化促進(jìn)亞硝基化反應(yīng)進(jìn)程，而亞硝基化抑制磷酸化反應(yīng)進(jìn)程，在孵育后期（72 h），蛋白質(zhì)磷酸化和蛋白質(zhì)亞硝基化相互抑制，最終導(dǎo)致肌鈣蛋白-T的降解程度明顯降低。蛋白質(zhì)磷酸化和亞硝基化修飾互作不利于宰后羊肉嫩度。