表面增強拉曼光譜法同時檢測果汁中的啶蟲脒和福美雙

馬立鑫，吳 瑋，許 騫，尹麗梅，韓 恩，白竣文，蔡健榮,*

（1.江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013；2.江蘇大學農(nóng)業(yè)工程學院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013）

果蔬在生長過程中容易受到細菌、真菌和害蟲的侵害，造成品質(zhì)下降，經(jīng)濟價值降低。因此，對病蟲害有良好防治效果的農(nóng)藥被廣泛應用到果蔬生產(chǎn)過程中。農(nóng)藥的噴灑雖然取得了很好的防治效果，但是過度使用產(chǎn)生的殘留可能會存在于農(nóng)產(chǎn)品中，嚴重危害人們的健康[1-2]。啶蟲脒是一種新型的煙堿類殺蟲劑，結構式如圖1A所示，具有廣譜殺螨活性，通常用來防治蘋果、柑橘等果樹上的蚜蟲，但是啶蟲脒具有神經(jīng)毒性、致癌性和肝腎毒性[3-4]。福美雙常用于果蔬生產(chǎn)過程中，結構式如圖1B所示，含有二硫代氨基甲酸酯基團，主要用作防霉劑、殺菌劑，但是毒理學實驗證明福美雙具有細胞毒性和致畸性[5-6]。在實際生產(chǎn)過程中，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)者為了獲得更大的經(jīng)濟收益，通常使用多種農(nóng)藥對病害、蟲害進行防治，有時甚至會加大用量和多次噴灑，而農(nóng)藥的半衰期各不相同[7-8]，導致農(nóng)作物上通常殘留多種農(nóng)藥。因此，開發(fā)一種靈敏、可靠、快速檢測食品中多種農(nóng)藥殘留的方法十分必要。

圖1 啶蟲脒（A）和福美雙（B）的化學結構式Fig.1 Chemical structures of acetamiprid (A) and thiram (B)

目前，單一和混合農(nóng)藥殘留的檢測主要采用色譜法或色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的方法進行，如高效液相色譜法[9]、毛細管電泳法[10]、氣相色譜-質(zhì)譜法[11]、液相色譜-質(zhì)譜法[12]等。這些方法雖然穩(wěn)定性好、檢測精度高，但是存在操作繁瑣、檢測耗時、需要專業(yè)培訓、設備成本高等局限性，無法實現(xiàn)現(xiàn)場檢測[13-14]。表面增強拉曼光譜（surface-enhanced Raman spectroscopy，SERS）技術是一種利用金或銀納米顆粒形成的納米間隙作為熱點區(qū)域，顯著增強拉曼信號的分析技術，相比于其他檢測方法，SERS技術具有操作簡單、快速、超靈敏、成本低等優(yōu)點[15-17]，被廣泛應用于食品安全檢測、生物醫(yī)學分析等眾多領域。目前，基于SERS技術檢測農(nóng)藥殘留的研究越來越多。Tao Mingzhu等[18]利用SERS技術結合化學計量學對噻苯達唑、多菌靈、毒死蜱3 種農(nóng)藥進行檢測。Hussain等[19]利用尺寸優(yōu)化后的銀包金納米球為SERS基底，通過SERS技術對梨中的三環(huán)唑和福美雙農(nóng)藥殘留進行檢測，檢測限（limit of detection，LOD）分別達到了0.005 mg/kg和0.003 7 mg/kg。Xiao Li等[20]利用負載金納米球的細菌纖維素為基底材料檢測蘋果表面的福美雙殘留物，LOD低于0.5 mg/kg。Dong Sa等[21]利用核酸適配體對啶蟲脒進行特異性檢測，獲得啶蟲脒的LOD為2.66 μg/L。這些研究都只對單一農(nóng)藥成分進行檢測或者對多種農(nóng)藥分別進行檢測，并沒有實現(xiàn)對混合農(nóng)藥的同時檢測，而實際生產(chǎn)過程中通常是多種農(nóng)藥同時殘留。Xu Ruimin等[22]利用膠體銀納米粒子負載的三維二氧化硅微球陣列實現(xiàn)了2,4-二氯苯氧乙酸、草甘膦和吡蟲啉的同時檢測，但類似利用SERS技術免標記同時檢測混合農(nóng)藥的研究還比較少。SERS技術具有窄峰寬、尖銳峰形的獨特優(yōu)勢，可以大大減少不同特征峰之間的重疊[23]，具有多目標同時檢測的潛力。Li Penghui等[24]在磷烯上的模板生長金銀納米復合材料，用于檢測噻菌靈和福美雙，LOD分別達到了10－7mol/L和10－8mol/L。Pham等[25]合成了信號優(yōu)化的金銀合金納米顆粒（Au-Ag alloy nanoparticles，Au-Ag ANPs），并用來檢測羅丹明B，LOD達到了10－11mol/L。Au-Ag ANPs的制備過程相對簡單，并且具有很好的拉曼增強效果。

因此，本研究以Au-Ag ANPs為SERS基底，選擇蘋果汁為代表果汁樣本，通過人為添加兩種農(nóng)藥標準溶液，然后對蘋果汁進行簡單的離心處理，利用SERS技術同時檢測蘋果汁中啶蟲脒和福美雙混合農(nóng)藥殘留，旨在為SERS技術在多種農(nóng)藥快速同時檢測中的應用提供可行性實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

氯金酸四水合物、二水合檸檬酸三鈉、硝酸銀（均為分析純）國藥集團化學試劑有限公司；4-氨基苯硫酚（4-aminothiophenol，4-ATP）（純度97%）上海麥克林生化科技有限公司；福美雙標準品（純度99%）北京伊諾凱科技有限公司；啶蟲脒標準品（純度97%）上海畢得醫(yī)藥科技有限公司；有機蘋果汁樣品（100%果汁）北京匯源食品飲料有限公司。

1.2 儀器與設備

HRS-5A便攜式拉曼光譜儀 蔚海光學儀器（上海）有限公司；RG160-AT臺式高速離心機 上海盧湘儀離心機儀器有限公司；數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；電子分析天平 上海天美天平儀器有限公司；UV-1601紫外-可見分光光度計 北京北分瑞利分析儀器有限責任公司；磁力攪拌水浴鍋 邦西儀器科技有限公司；HT-7800透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM）、Regulus-8100場發(fā)射掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）日本日立集團；Tecnai G2 F20高分辨率透射電子顯微鏡（high resolution transmission electron microscope，HRTEM）美國FEI公司；Litesizer 500激光粒度儀 奧地利Anton Paar公司。

1.3 方法

1.3.1 SERS襯底Au-Ag ANPs的制備與優(yōu)化

參照Han Qingyan等[26]的方法并適當修改用于合成基底。向25.0 mL燒杯中加入15.6 mL的超純水，將燒杯轉移到100℃的數(shù)顯磁力攪拌水浴鍋中，在磁力攪拌、沸騰狀態(tài)下持續(xù)5 min。然后加入0.2 mL的氯金酸溶液（0.01 mol/L）和0.2 mL的硝酸銀溶液（0.005、0.01、0.015、0.02、0.025 mol/L和0.03 mol/L），5 min后加入1.6 mL的檸檬酸鈉溶液（0.1 mol/L），沸騰條件下繼續(xù)攪拌20 min，得到不同金銀物質(zhì)的量比的Au-Ag ANPs，室溫下避光保存?zhèn)溆谩?/p>

使用4-ATP作為SERS標簽分子，根據(jù)其在不同金銀物質(zhì)的量比的Au-Ag ANPs中增強后的拉曼信號強弱選擇出最優(yōu)的金銀物質(zhì)的量比，并作為后續(xù)實驗最優(yōu)的基底材料。具體操作如下：將5 μL Au-Ag ANPs和5 μL 4-ATP在0.2 mL的離心管中混勻孵育5 min，然后取出5 μL滴加到載玻片上的鋁箔膠帶上，使用便攜式拉曼光譜儀（激發(fā)波長785 nm、強度150 mW、積分時間0.5 s）隨機選取10 個點采集SERS光譜。

1.3.2 納米材料基底的表征

用透射電子顯微鏡和場發(fā)射掃描電子顯微鏡觀察納米顆粒的形貌特征和大小，用配備了能譜儀（energy dispersive spectrometer，EDS）的高分辨率透射電子顯微鏡得到納米顆粒的元素組成，用激光粒度儀得到納米顆粒的粒徑分布情況。

1.3.3 啶蟲脒與福美雙混合農(nóng)藥標準溶液的制備

單一農(nóng)藥標準溶液制備：用分析天平分別稱量10 mg啶蟲脒和10 mg福美雙的標準品，加入20 mL的樣品瓶中，用乙醇補足體積至10 mL分別得到1 000 mg/L的啶蟲脒和福美雙農(nóng)藥標準儲備液，在2 mL離心管中用超純水稀釋配制出不同質(zhì)量濃度的農(nóng)藥標準溶液，于4 ℃冰箱中避光保存?zhèn)溆谩?/p>

混合農(nóng)藥標準溶液制備：分別取100 μL啶蟲脒和福美雙農(nóng)藥標準儲備液同時加入800 μL超純水中，配制成含有100 mg/L啶蟲脒和福美雙的混合農(nóng)藥標準溶液，進一步用超純水稀釋配制不同質(zhì)量濃度的混合農(nóng)藥標準溶液。

1.3.4 蘋果汁中農(nóng)藥殘留樣品的前處理

分別向5 mL蘋果汁中加入不同體積的啶蟲脒和福美雙農(nóng)藥標準儲備液，并用果汁補足液體到10 mL，獲得不同質(zhì)量濃度的啶蟲脒和福美雙農(nóng)藥殘留樣品。使用數(shù)控超聲波清洗器超聲處理10 min，然后用臺式高速離心機6 000 r/min離心5 min，取上清液用于后續(xù)拉曼光譜采集。

1.3.5 拉曼光譜采集

調(diào)整便攜式拉曼光譜儀參數(shù)：激發(fā)波長為785 nm，工作功率為150 mW，積分時間為3 s。具體的SERS光譜采集過程如下：分別取5 μL濃縮20 倍的金銀合金納米顆?；准尤?.1 mL的離心管中，然后分別加入不同質(zhì)量濃度待測樣本溶液，混勻并孵育5 min，取出5 μL混合物滴在鋁箔膠帶上，用于SERS光譜采集。為了提高實驗的穩(wěn)定性和準確性，每個樣品取5 個不同的隨機位點進行光譜采集。啶蟲脒和福美雙農(nóng)藥殘留LOD參考Hussain等[27]的方法計算：

式中：SD為空白樣品的標準偏差；k為相應校正曲線的斜率。

1.3.6 高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）檢測

HPLC檢測條件：Agilent C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為V（甲醇）∶V（水）＝70∶30；流速為0.7 mL/min；柱溫為室溫；進樣量為20 μL；檢測波長：福美雙220 nm，啶蟲脒245 nm。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

使用拉曼光譜儀自帶軟件AccuRam對采集的光譜進行平滑和基線校正預處理，并導出數(shù)據(jù)進一步用Origin 2018軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 金銀合金納米顆?；撞牧系谋碚髋c優(yōu)化

圖2A和圖2B分別顯示了Au-Ag ANPs的TEM圖像和SEM圖像，顆粒整體呈球狀，顏色黑白相間明顯，有深有淺，單個納米顆粒直徑在35～50 nm范圍內(nèi)。為了表征納米顆粒整體的粒徑分布情況，利用激光粒度儀得到了納米顆粒整體的水動力學直徑分布圖（圖2C），納米顆粒的粒徑在20～140 nm波長處均有分布，但集中分布在54 nm波長處左右。圖2D為不同金銀物質(zhì)的量比的Au-Ag ANPs的紫外可見光吸光光譜，結果顯示，隨著硝酸銀添加量的增加，納米顆粒的最大吸收峰從496 nm逐漸變?yōu)?46 nm，表明納米顆粒中銀元素比例的增加。圖2E、F顯示了通過HRTEM得到的Au-Ag ANPs（金銀物質(zhì)的量比2∶4）元素映射圖譜，說明制備的納米顆粒含有金元素和銀元素，而且金元素物質(zhì)的量/銀元素物質(zhì)的量比值為0.52。以上結果說明Au-Ag ANPs成功合成。為了探究具有最佳SERS增強能力的Au-Ag ANPs，使用4-ATP（1×10－5mol/L）作為SERS標簽分子，根據(jù)不同金銀物質(zhì)的量比的Au-Ag ANPs對4-ATP的增強能力，選擇對4-ATP增強效果最好的Au-Ag ANPs作為后續(xù)實驗最優(yōu)的基底材料。圖3A顯示了不同金銀物質(zhì)的量比的Au-Ag ANPs對4-ATP增強后的拉曼光譜圖，388、1 075、1 588 cm－1處為4-ATP的拉曼特征峰，其中1 075 cm－1處的強度最大。因此，選擇4-ATP在1 075 cm－1處的最強SERS峰的強度繪制柱狀圖（圖3B）。從圖3B可以發(fā)現(xiàn)，當金銀物質(zhì)的量比為2∶4、2∶5、2∶6時，拉曼增強效果都比較好，但是圖3B中的插圖顯示出在室溫避光保存條件下，當金銀物質(zhì)的量比為2∶5、2∶6時，膠體溶液產(chǎn)生黑色沉淀，表明部分納米顆粒發(fā)生聚集產(chǎn)生肉眼可見的沉淀物，因此后續(xù)實驗選擇金銀物質(zhì)的量比為2∶4的Au-Ag ANPs作為拉曼增強基底材料。

圖2 金銀合金納米顆粒的表征Fig.2 Characteristics of Au-Ag alloy nanoparticles

圖3 4-ATP的拉曼光譜圖（A）和拉曼強度柱狀圖（B）Fig.3 Raman spectra (A) and Raman intensity (B) of 4-ATP

2.2 啶蟲脒和福美雙單一農(nóng)藥的SERS檢測

圖4A顯示了不同質(zhì)量濃度的啶蟲脒水溶液檢測到的SERS圖譜，隨著啶蟲脒質(zhì)量濃度的增大，在437、631、825、1 105 cm－1處的特征峰逐漸增強；福美雙的SERS圖譜如圖4B所示，主要存在561、925、1 144、1 380、1 509 cm－1處的特征峰，特征峰的強度隨著福美雙質(zhì)量濃度的增大而變大。福美雙和啶蟲脒在水溶液狀態(tài)下具有不同的SERS峰，并且各自的最強峰（啶蟲脒：631 cm－1；福美雙：1 380 cm－1）間隔很遠，具有同時檢測的可能性。表1展示了啶蟲脒和福美雙的特征峰的峰位歸屬分析結果。

表1 啶蟲脒和福美雙在SERS中主要振動頻率歸屬Table 1 Major vibration frequency attributions of acetamiprid and thiram in SERS

圖4 水溶液中不同質(zhì)量濃度啶蟲脒和福美雙單一農(nóng)藥的SERS光譜Fig.4 SERS spectra of different concentrations of acetamiprid and thiram in aqueous solution

2.3 啶蟲脒和福美雙混合農(nóng)藥的SERS檢測

2.3.1 水溶液中混合農(nóng)藥同時檢測

啶蟲脒和福美雙混合農(nóng)藥的SERS圖譜如圖5所示，631 cm－1處的SERS峰為啶蟲脒的最強特征峰，強度隨著啶蟲脒質(zhì)量濃度的增加而增大；福美雙的最強特征峰（1 380 cm－1）強度隨著福美雙質(zhì)量濃度增加而增大。與單一農(nóng)藥成分相比較，兩種混合農(nóng)藥各自的特征峰在水溶液狀態(tài)下可以同時檢測到，631、825 cm－1處是啶蟲脒的特征峰，561、925、1 380、1 509 cm－1處是福美雙的特征峰，以上特征峰在混合農(nóng)藥狀態(tài)下可以各自顯示出單獨的峰，但是由于1 105（啶蟲脒）、1 144 cm－1（福美雙）的出峰位置比較接近，峰寬相對較大，所以在混合狀態(tài)下表現(xiàn)出復合峰的形態(tài)，如圖5中綠色框線所標。由于啶蟲脒和福美雙的大多數(shù)特征峰并不會相互干擾和掩蔽，因此并不影響對啶蟲脒和福美雙的同時檢測。

圖5 水溶液中不同質(zhì)量濃度的啶蟲脒和福美雙混合農(nóng)藥的SERS光譜Fig.5 SERS spectra of different concentrations of acetamiprid and thiram mixtures in aqueous solution

2.3.2 蘋果汁樣品中混合農(nóng)藥的SERS光譜分析與定量

在蘋果汁中兩種農(nóng)藥殘留同時檢測的SERS光譜結果如圖6所示，與水溶液中混合農(nóng)藥的SERS圖譜相比，原本在561 cm－1處的峰偏移到了556 cm－1，925 cm－1處的峰偏移到了918 cm－1，這種微小的漂移可能是目標物在SERS增強基底上的不同位姿所致[27]。另外，730 cm－1處出現(xiàn)了比較強的峰，這可能是蘋果汁中的糖分干擾導致的[34]。對比圖5、6可以看出，蘋果汁中福美雙和啶蟲脒的SERS信號強度均低于水溶液中的SERS強度，這可能是蘋果汁中的基質(zhì)成分干擾導致的。因為有些基質(zhì)成分會吸附在SERS增強基底表面，使得啶蟲脒和福美雙與基底的結合位點減少，同時也會增加目標物與基底的距離，沒有足夠小的間隙，導致SERS增強效果降低。盡管如此，啶蟲脒和福美雙的最強特征峰也會顯現(xiàn)，甚至在蘋果汁中可以同時觀察到0.5 mg/L質(zhì)量濃度的啶蟲脒和0.05 mg/L的福美雙。利用啶蟲脒在631 cm－1處的SERS強度和福美雙在1 380 cm－1處的SERS強度與其質(zhì)量濃度各自建立標準曲線。如圖7所示，蘋果汁中啶蟲脒和福美雙的校正曲線分別為y＝999.095 8lnx＋1 746.395 1、y＝3 863.214 6lnx＋13 837.129 7，決定系數(shù)分別為0.979 9、0.998 5，具有良好的相關性。啶蟲脒和福美雙的SERS特征峰與質(zhì)量濃度的自然對數(shù)呈線性相關，而不是與質(zhì)量濃度本身呈線性相關，這可能是受到了樣品基質(zhì)的干擾。LOD是檢測研究中常用的評價參數(shù)，根據(jù)1.3.5節(jié)公式計算，在蘋果汁中啶蟲脒和福美雙的LOD分別為0.422 31 mg/L和0.035 56 mg/L。GB 2763—2021《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》中規(guī)定的蘋果中福美雙和啶蟲脒的最大殘留限量分別為5 mg/kg和0.8 mg/kg，因此本方法的LOD可以達到國家標準。為了驗證本研究建立的SERS免標記同時快速檢測啶蟲脒和福美雙檢測方法的準確性和精密度，額外采用標準添加的方式在蘋果汁中同時添加不同質(zhì)量濃度的啶蟲脒和福美雙，同時與HPLC方法進行比較，結果如表2所示。SERS方法中，蘋果汁中福美雙和啶蟲脒的平均回收率分別為81.67%～101.25%和98.70%～119.36%，相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）范圍分別在2.72%～7.68%和5.44%～15.15%?；厥章屎途芏冉Y果表現(xiàn)良好，表明該SERS方法適用于蘋果汁中啶蟲脒和福美雙的同時檢測。另外在HPLC方法中，福美雙和啶蟲脒的平均回收率分別為85.00%～94.95%和95.60%～114.86%，二者的RSD分別為1.60%～8.22%和3.52%～5.12%。用SPSS軟件進行t檢驗，P＝0.216＞0.05，結果無顯著差異，說明SERS方法和HPLC方法結果一致性較好。從表2中也可以看出，與HPLC方法相比較，SERS方法的RSD較高，這可能是由于納米顆粒分布相對不均勻，形成的納米間隙不同導致拉曼信號產(chǎn)生較小差異，但總體可以滿足檢測需求。因此，所提出的SERS方法與HPLC方法相比，SERS方法操作更簡單、快速、樣品處理簡單，更適合現(xiàn)場檢測。

表2 SERS和HPLC方法檢測加標蘋果汁樣品中啶蟲脒和福美雙的回收實驗結果Table 2 Recoveries of thiram and acetamiprid in spiked apple juice samples detected by SERS and HPLC

圖6 蘋果汁中不同質(zhì)量濃度的啶蟲脒和福美雙混合農(nóng)藥的SERS光譜Fig.6 SERS spectra of different concentrations of acetamiprid and thiram mixtures in apple juice

圖7 蘋果汁中啶蟲脒和福美雙的校正曲線Fig.7 Calibration curves of acetamiprid and thiram in apple juice

3 結論

本研究選用金銀合金納米顆粒作為SERS基底，選擇蘋果汁作為代表果汁樣本，通過對蘋果汁樣本進行簡單的超聲和離心處理，利用便攜式拉曼光譜儀對蘋果汁中的啶蟲脒和福美雙農(nóng)藥殘留進行同時檢測，根據(jù)631 cm－1（啶蟲脒）和1 380 cm－1（福美雙）處的SERS強度與農(nóng)藥殘留的質(zhì)量濃度建立線性關系。向蘋果汁中同時添加啶蟲脒和福美雙標準溶液，回收率實驗結果顯示福美雙和啶蟲脒的平均回收率為81.67%～119.36%，相對標準偏差范圍為2.72%～15.15%。此方法得到的啶蟲脒和福美雙的最低LOD均低于GB 2763—2021《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》中規(guī)定的最大殘留量要求，能夠實現(xiàn)果汁中啶蟲脒和福美雙同時快速定量檢測。在未來，隨著便攜式拉曼光譜儀性能的提高和拉曼增強效果材料的發(fā)展，將具有更高的穩(wěn)定性，此樣品處理及檢測簡單的方法有望實現(xiàn)多種農(nóng)藥殘留的現(xiàn)場同時檢測。