龍膽苦苷腹腔注射對單側(cè)輸尿管梗阻小鼠腎間質(zhì)纖維化的改善作用及其機制

彭炳鴻，曾琪，譚睿陟，粟宏偉，劉建，4

1 西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院腎病內(nèi)科，四川瀘州 646000；2 西南醫(yī)科大學附屬中醫(yī)醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合研究中心；3 西南醫(yī)科大學附屬中醫(yī)醫(yī)院泌尿外科；4 西南醫(yī)科大學附屬中醫(yī)醫(yī)院腎病內(nèi)科

慢性腎臟?。–KD）的發(fā)病率和病死率逐年遞增，最新報道顯示，我國成人CKD患病率為8.2%［1］。目前對于終末期CKD 尚缺乏有效的治療措施，因此急需尋找新的藥物以延緩CKD 進展。腎間質(zhì)纖維化既是終末期腎病的典型共同病理改變，又是決定慢性腎臟病進程的關鍵因素，因此延緩腎間質(zhì)纖維化對CKD的治療具有重要意義。龍膽苦苷（GPS）是從龍膽科植物中提取的裂環(huán)烯醚萜苷類化合物，具有抗炎鎮(zhèn)痛、抗氧化應激和清除自由基等作用，對肺纖維化、肝纖維化、腹膜纖維化等纖維化疾病有較好的治療效果［2-5］，但其對腎間質(zhì)纖維化的作用和機制仍不清楚。2023年2月—7月，我們對單側(cè)輸尿管梗阻（UUO）小鼠給予GPS 進行干預，觀察小鼠腎間質(zhì)纖維化的改善情況，并探討其可能的作用機制，旨在為后續(xù)藥物研發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF級雄性C57BL/6小鼠31只，6～8周齡，體質(zhì)量22～25 g，由成都藥康生物科技有限公司提供。飼養(yǎng)環(huán)境相對濕度50%～60%、溫度20～22 ℃，12 h/12 h 晝夜循環(huán)，自由攝食、飲水。本實驗經(jīng)西南醫(yī)科大學實驗動物倫理委員會審批通過（批號：swmu20230038）。

1.1.2 藥品、試劑與儀器 GPS（成都德思特生物技術有限公司）；厄貝沙坦（法國賽諾菲公司）。Masson染色試劑盒（珠海貝索生物技術有限公司）；HE染色試劑盒（上海碧云天科技有限公司）；α-SMA 單克隆抗體（德國CST 公司）；Fn 多克隆抗體（美國Abcam公司）；GAPDH 多克隆抗體（武漢三鷹生物技術有限公司）。酶標儀（Synergy2 型，美國Bio-Tek 公司）；凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad 公司）；PCR 儀（LightCycler480Ⅱ型，瑞士Roche 公司）；生物顯微鏡（DM500型，日本Olympus公司）。

1.2 GPS對UUO小鼠腎間質(zhì)纖維化的作用觀察

1.2.1 動物分組與模型制備 取25 只小鼠，隨機分為假手術組、模型對照組、GPS 低劑量組、GPS 高劑量組、厄貝沙坦組，每組各5只。采用結(jié)扎單側(cè)輸尿管的方式建立UUO 模型。腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉小鼠，從背部靠近右腎位置切開皮膚，鈍性分離皮下、肌肉各層，暴露并游離出右腎和輸尿管，在輸尿管近腎端使用3-0 手術線進行雙結(jié)扎，中間剪斷，逐層關閉縫合。假手術組進行上述操作，但不結(jié)扎、不剪斷輸尿管。

1.2.2 藥物干預 造模完成后，GPS 低劑量組、GPS 高劑量組分別給予0.1、0.2 g/kg GPS 腹腔注射，厄貝沙坦組給予0.02 g/kg 厄貝沙坦腹腔注射，模型組和假手術組給予等體積生理鹽水腹腔注射，均1次/天，連續(xù)7 d。

1.2.3 標本采集 術后第8 天將小鼠處死，取右腎組織，一部分放入4%甲醛溶液中固定，用于組織形態(tài)學觀察；另一部分放置于-80 ℃保存，用于mRNA和蛋白檢測。

1.2.4 小鼠腎組織形態(tài)學觀察 取甲醛溶液固定的腎臟組織，脫水透明后石蠟包埋，切片備用。65 ℃烘烤2 h，脫蠟、復水，采用HE 染色法觀察組織形態(tài)學變化，Masson染色法觀察組織纖維化程度。

1.2.5 小鼠腎組織Fn、α-SMA 蛋白檢測 采用Western blotting 法。取凍存的腎臟組織，加入蛋白裂解液提取蛋白，考馬斯亮藍法測定蛋白濃度。進行SDS-PAGE 凝膠電泳，100 V 轉(zhuǎn)膜100 min，5%脫脂牛奶封閉1 h，分別加入α-SMA、GAPDH 抗體（稀釋比例均為1∶1 000）、Fn 抗體（稀釋比例為1∶800），4 ℃孵育過夜；洗膜3 次，加入二抗（稀釋比例為1∶10 000），室溫孵育1 h（α-SMA、GAPDH）、2 h（Fn）；TBST 洗膜，曝光成像。以GAPDH 為內(nèi)參，采用Image J 軟件分析目的蛋白的相對表達量。

1.2.6 小鼠腎組織Fn、α-SMA mRNA 檢測 采用實時定量PCR 法。取凍存的腎組織，采用TRIzol 法提取總RNA，測定RNA濃度和純度后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。PCR 擴增引物序列見表1。反應體系：上、下游引物各1 μL，2×擴增試劑10 μL，cDNA 2 μL，無菌無酶水。反應條件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 20 s，共40個循環(huán)。以GAPDH 作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。

表1 PCR擴增引物序列

1.3 GPS對UUO小鼠腎組織基因表達的影響觀察

1.3.1 轉(zhuǎn)錄組測序 取6 只小鼠，隨機分為模型組和GPS 組各3 只。建立UUO 模型后，GPS 組給予0.2 g/kg GPS 腹腔注射，模型組給予等體積生理鹽水腹腔注射，1次/天，連續(xù)7 d。第8天處死小鼠，取右腎組織分為兩份，一份寄往廣州基迪奧生物科技有限公司完成轉(zhuǎn)錄組測序；另一份置于-80 ℃凍存，用于后續(xù)差異表達關鍵基因的驗證。

1.3.2 轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)處理 測序得到的原始讀段包含低質(zhì)量序列，利用Fastp 軟件進行分析和過濾，從而獲得潔凈讀段，以保證數(shù)據(jù)質(zhì)量及結(jié)果可靠性。除去含數(shù)據(jù)接頭序列、低質(zhì)量序列、全部都是A 堿基序列以及含未知堿基比例大于10%序列后，有效數(shù)據(jù)均高于99%，說明本實驗測序數(shù)據(jù)質(zhì)量佳。利用RSEM 計算每個樣本中所有基因的表達量，并用DESeq2 法進行差異表達基因分析，篩選標準為FDR＜0.05 且|log2（FC）|＞1。借助基因本體論（GO）和京都基因和基因組百科全書（KEGG）對差異表達基因的生物學功能和信號通路進行富集分析。

1.3.3 差異表達基因的驗證 取“1.3.1”中GPS組和模型組各3 只小鼠以及“1.2”中GPS 高劑量組和模型組各5 只小鼠的腎組織，采用PCR 方法檢測差異表達基因。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用GraphPad Prism9.0 統(tǒng)計軟件。符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 GPS對UUO小鼠腎間質(zhì)纖維化的作用

2.1.1 各組腎組織病理形態(tài)學比較 HE 染色顯示，假手術組腎組織形態(tài)正常；模型對照組腎小管擴張，間質(zhì)炎細胞浸潤，腎小管上皮細胞空泡變性；與模型對照組比較，GPS 高、低劑量組和厄貝沙坦組病理損傷均有所減輕，其中GPS 高劑量組改善效果更明顯。Masson 染色顯示，假手術組腎間質(zhì)未見明顯藍色膠原著色；模型對照組腎間質(zhì)大量藍色膠原著色，且著色較深；與模型對照組比較，GPS 高、低劑量組和厄貝沙坦組腎間質(zhì)藍色膠原著色均減少，其中GPS 高劑量組減少更加顯著。見OSID 碼圖1。

2.1.2 各組小鼠腎組織Fn、α-SMA 蛋白表達比較見表2。

表2 各組小鼠腎組織Fn、α-SMA蛋白表達量比較（± s）

表2 各組小鼠腎組織Fn、α-SMA蛋白表達量比較（± s）

注：與假手術組比較，*P＜0.05；與模型對照組比較，#P＜0.05；與GPS 低劑量組比較，△P＜0.05。

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2.1.3 各組小鼠腎組織Fn、α-SMA mRNA 表達比較 見表3。

表3 各組小鼠腎組織Fn、α-SMA mRNA表達量比較（± s）

表3 各組小鼠腎組織Fn、α-SMA mRNA表達量比較（± s）

注：與假手術組比較，aP＜0.05；與模型對照組比較，#P＜0.05；與GPS 低劑量組比較，△P＜0.05。

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2.2 GPS對UUO小鼠腎組織基因表達的影響

2.2.1 兩組差異表達基因篩選結(jié)果 與模型組比較，GPS 組共篩選出710 個差異表達基因，其中下調(diào)基因142個、上調(diào)基因568個。見OSID碼圖2。

2.2.2 差異表達基因的富集通路分析結(jié)果 GO分析顯示，差異表達基因的功能主要集中在細胞進程、生物調(diào)節(jié)、生物進程調(diào)控等方面，見OSID 碼圖3。KEGG 分析顯示，差異表達基因主要富集于Rap1、Ras、PI3K/AKT、MAPK信號通路等，見OSID碼圖4。

2.2.3 GPS 對差異表達關鍵基因的影響 對上述差異表達基因提高篩選標準，篩選|log2（Fc）|≥1.5且FDR＜0.05的基因，利用NCBI及其子數(shù)據(jù)庫PubMed篩選與纖維化相關的基因，并取其對纖維化的作用趨勢與測序結(jié)果的變化趨勢一致的基因，排名前10位的基因為Smyd1、TET1、GZMA、CXCL3、肝細胞生長因子（HGF）、VASH1、ADGRL4、TNFSF8、IL6Ra、含卷曲螺旋域蛋白3（CCDC3）。對這10個基因進行RT-qPCR 驗證，結(jié)果顯示，與模型組比較，GPS 組腎組織HGF、CCDC3 mRNA 表達升高（P均＜0.05），見表4。驗證結(jié)果與測序結(jié)果一致，說明該測序結(jié)果真實可信。其余8個基因因驗證結(jié)果與測序結(jié)果不一致，或測序結(jié)果Count 值為0 或1，故不考慮其為GPS干預靶點。

表4 兩組小鼠腎間質(zhì)纖維化關鍵基因表達量比較（± s）

表4 兩組小鼠腎間質(zhì)纖維化關鍵基因表達量比較（± s）

注：與模型組比較，*P＜0.05。

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3 討論

CKD 病理損傷的共同途徑是腎間質(zhì)纖維化，同時也是CKD 進展為終末期腎臟病的關鍵病理環(huán)節(jié)，因此延緩腎間質(zhì)纖維化進程是治療CKD 的關鍵。目前臨床治療主要采用的藥物包括激素、RAAS 抑制劑、SGLT-2 抑制劑等，但效果仍不夠理想。中藥已廣泛應用于我國腎臟病領域，成為CKD 一體化治療方案中不可或缺的一部分，因此從天然植物中發(fā)掘新藥以改善腎纖維化具有重要意義。已有研究表明，厄貝沙坦對腎臟具有較好的保護效果，選用其作為本研究的陽性對照藥物，可將GPS 的改善效果與其作對比，初步判斷GPS 的用藥價值。GPS 具有抗炎、抗氧化應激等活性，對纖維化有較好的改善效果。動物實驗表明，GPS 可通過抑制Shh 信號通路改善大鼠肝纖維化損傷［6］。CHEN 等［2］報道，GPS 能夠抑制博來霉素誘導的小鼠肺纖維化，降低TNF-α、IL-1β等炎癥因子水平，改善肺部組織纖維化病變程度。李玉博等［5］報道，GPS 可以抑制氧化應激反應及腹膜間皮—間充質(zhì)轉(zhuǎn)化進程，從而改善腹膜纖維化程度。本研究結(jié)果顯示，模型對照組小鼠腎組織病理損傷明顯，間質(zhì)大量膠原纖維沉積；經(jīng)GPS干預后，腎組織病理損傷減輕，間質(zhì)膠原纖維明顯減少，表明GPS 能夠改善腎纖維化，且高劑量組的改善效果優(yōu)于低劑量組。

腎臟纖維化病理機制十分復雜，主要包括細胞外基質(zhì)（ECM）沉積、上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）、炎癥細胞浸潤等［7］。成纖維細胞或肌成纖維細胞通過EMT誘導激活，造成ECM 大量沉積，使得正常腎臟組織結(jié)構(gòu)遭到破壞，最終導致腎纖維化的發(fā)生［8］。Fn 和α-SMA 主要由肌成纖維細胞分泌，F(xiàn)n、α-SMA 表達增強是EMT 的主要特征之一［10］。本研究結(jié)果顯示，模型對照組小鼠腎組織Fn、α-SMA 蛋白和mRNA 表達水平較假手術組明顯升高，表明模型對照組腎組織存在腎間質(zhì)纖維化；經(jīng)GPS 治療后，腎組織Fn、α-SMA 蛋白和mRNA 表達水平降低，表明GPS 可通過抑制EMT改善腎間質(zhì)纖維化。

轉(zhuǎn)錄組測序是利用高通量測序技術檢測一定條件下的細胞或組織RNA 表達信息的技術，已廣泛應用于多種領域，包括臨床診斷與治療、基礎研究、新藥物研發(fā)、疾病分子機制等。本研究通過轉(zhuǎn)錄組測序技術分析模型組和GPS 組的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，共獲得710 個差異表達基因，通過進一步篩選和體內(nèi)驗證得到2 個有效基因，HGF、CCDC3 在模型組中低表達，經(jīng)GPS干預后顯著上調(diào)，與測序結(jié)果一致。HGF是一種具有廣泛生物活性的因子，對多種組織器官和細胞具有調(diào)控作用。HGF 是目前已知的唯一與c-Met 具有高親和力的天然配體，與c-Met 受體結(jié)合后，激活下游信號通路如Ras/Raf/MEK/MAPK、JAK/STAT3、Wnt/β-catenin 和PI3K/AKT/NF-κB、mTOR 通路，從而調(diào)控細胞周期、生長和存活、EMT和血管生成、抗凋亡作用等多種生物學過程［10］。已有研究表明，HGF 可阻止纖維化的進展［11］。DONG等［12］報道，熊去氧膽酸通過激活ID1-WNT2/HGF 通路促進肝再生，從而減輕肝纖維化。BAO 等［13］報道，AAV9-HGF 與TGF-β/Smad 抑制劑協(xié)同作用通過抑制鐵死亡來減輕矽肺纖維化。CCDC3 是一種高度保守的蛋白質(zhì)，在糖尿病腎病、脂質(zhì)代謝、抗炎、動脈粥樣硬化和癌癥中發(fā)揮作用［14-15］。BARWINSKA 等［14］對人類腎切除術后腎組織標本和糖尿病腎病腎活檢標本中的腎間質(zhì)進行激光顯微切割（LMD）和RNA 測序，發(fā)現(xiàn)CCDC3 在糖尿病腎病中表達下調(diào)，可能與其參與炎癥和免疫調(diào)節(jié)有關。CCDC3 還可以抑制血管內(nèi)皮細胞中TNF-α/NF-κB誘導的促炎癥反應［16］。由此可見，HGF 和CCDC3均可通過多種途徑影響纖維化。GO 功能富集分析結(jié)果顯示，差異表達基因主要集中在細胞進程、生物調(diào)節(jié)、生物進程調(diào)控等方面；KEGG 通路富集分析發(fā)現(xiàn)，差異表達基因涉及Rap1 通路、Ras 通路、PI3K/AKT 通路、MAPK 通路等。這些信號通路上富集的靶點較多，與炎癥、氧化應激相關，同時調(diào)控細胞生長、增殖等一系列活動，進而參與纖維化的發(fā)生發(fā)展，也是潛在的治療靶點。這表明GPS 能夠改善腎間質(zhì)纖維化，減輕腎臟損傷，治療CKD，其機制可能是通過調(diào)節(jié)多種信號通路，多途徑、多靶點緩解腎纖維化。

綜上所述，GPS 能夠改善UUO 小鼠腎間質(zhì)纖維化，其作用機制可能與上調(diào)HGF 及CCDC3 表達、Rap1 通路、Ras 通路、PI3K/AKT 通路等生物學途徑有關。后續(xù)我們將進一步通過體外實驗進行佐證，為臨床用藥提供理論依據(jù)。