木通果皮多糖提取工藝的優(yōu)化

潘婷

摘要：本次實(shí)驗(yàn)對木通果皮粗多糖提取工藝進(jìn)行了研究。采用熱水回流提取，經(jīng)苯酚硫酸法進(jìn)行含量測定，先單因素依次考察對木通果皮多糖得率的影響，再采用正交優(yōu)化提取次數(shù)、料液比、醇沉濃度在3個(gè)不同水平下提取工藝條件。結(jié)果表明，在提取溫度為96℃（本地沸騰時(shí)的溫度）、提取次數(shù)為3次（每次1 h）、料液比（樣品：提取液g/ mL）1：25，多糖得率為65.4%，RSD=3.72%；木通果皮多糖的提取率高且穩(wěn)定。

關(guān)鍵詞：木通果皮；多糖；正交試驗(yàn)；提取工藝

木通原名通草，別名八月扎莖、菠知子藤等，是木通科木通屬植物木通 、三葉木通 、白木通干燥果實(shí)和藤莖。具有利尿通淋、清心除煩、抗菌消炎的功效。木通果皮含有豐富的多糖和黃酮，但目前對木通果皮多糖含量的提取工藝的研究很少。本次研究木通多糖提取工藝及含量的測定，主要采用正交實(shí)驗(yàn)法對木通多糖最佳提取工藝的確立，再有對其含量的測定，為以后有研究木通多糖方面的工作者提供參考。

1 材料與方法

1.1 研究材料

1.1.1 主要實(shí)驗(yàn)儀器

JH型721紫外分光光度計(jì)、FA2004電子天平、電子天平、離心機(jī)、循環(huán)水式多用真空泵、電熱恒溫水浴鍋、高功率數(shù)控超聲波清洗器、高速萬能粉碎機(jī)、TDL-50B-B型星科離心機(jī)、DZF-6050型真空干燥箱。

1.1.2 研究藥材與試劑

木通果皮藥材來源于貴州省綏陽縣永樂鎮(zhèn)，無水乙醇、氯仿、正丁醇、5%苯酚溶液、濃硫酸。

1.2 研究方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

先配置0.1 mg/ mL的葡萄糖對照品溶液，再按如下表吸取相應(yīng)的對照品溶液于具塞刻度試管中，而后依次加入1 mL的5%苯酚溶液、5 mL濃硫酸，每加一次試劑均需搖勻；末了再靜置放置l0 min，再放入90℃的水浴鍋中反應(yīng)，1號為空白對照，用紫外分光光度計(jì)490nm波長處測吸光度值（A）的回歸方程如下。詳見表1、圖1

1.2.2 木通果皮的預(yù)處理

取一定量于55℃干燥至恒重的木通果皮干制品，粉碎、過篩40目后，裝袋做待測樣品，以備下面提取測定木通果皮多糖含量。

1.2.3 木通果皮的提取

本試驗(yàn)對樣品采取水提法，具體如下：精密稱取上述粉碎過篩后的木通果皮樣品3.000 g置于圓底燒瓶中，加15倍量體積的蒸餾水，置于水浴鍋中一定溫度下，回流提取3次，每次1h，合并提取液，靜置冷卻至室溫，用低速離心機(jī)2000 r/min離心15 min左右，至提取液清晰分層，傾出上層清澈溶液于同一容器中，再用真空泵進(jìn)行抽濾除取離心后溶液里含的少量藥渣，濾液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮之后取出。

1.2.4 木通果皮粗多糖的獲得

再將濃縮液用Sevag試劑法脫蛋白，目前報(bào)道的木通多糖提取液里蛋白質(zhì)的去除用的也是這種方法（但氯仿對人體也有一定毒性，操作時(shí)應(yīng)注意）。收集上清液，濃縮以除去氯仿等有機(jī)試劑。向濃縮液加入乙醇，析出絮狀沉淀，靜止使沉淀完全。再對沉淀進(jìn)行離心并回收乙醇，55℃真空干燥，即得木通粗多糖。

1.2.5 紫外光分光光度計(jì)法對木通果皮多糖含量的測定

將上述所得多糖先用少量溫水溶解完全再定容到一定體積的容量瓶中，精密吸取樣品液，先加入5%苯酚溶液，再加入1.0 mL的5%苯酚溶液及5.0 mL濃硫酸，搖勻后靜置幾分鐘，并放入90℃的水浴鍋中反應(yīng)，冷卻至室溫，放置在紫外分光光度計(jì)中，再將用490 nm波長測定的吸光度值（A）代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算出樣品濃度。

1.2.6 木通果皮多糖含量的計(jì)算

木通果皮多糖的得率（%）=（C×F×10-3/W）×100%

式中：C：樣品溶液濃度（mg/ mL）；

F：稀釋系數(shù)，即稀釋后的總體積。

W：稱取的木通果皮多糖的質(zhì)量（g）。

則此次所測3.00 g的多糖含量為50.13%

1.2.7 木通果皮多糖最佳提取條件的確定

先考察提取次數(shù)、醇沉濃度、料液比、提取溫度對木通果皮在單因素條件下的木通多糖的所得率，為了考察各因素之間的相互影響，在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)3因素3水平的正交實(shí)驗(yàn)來明確木通多糖水提法的最佳提取條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 提取溫度對木通果皮多糖提取工藝的影響

精密稱取3 g左右的木通果皮粉末，每組3份，置于圓底燒瓶中，料液比為1：20，按醇沉濃度70%加入乙醇，提取溫度分為60℃、80℃、96℃（沸騰），提取次數(shù)為2次，每次提取1h，其余操作依照“1.2.3～1.2.6”項(xiàng)所示得到待測液并計(jì)算其多糖的含量，考察提取溫度對木通果皮多糖的提取率的影響，

實(shí)驗(yàn)結(jié)果為提取溫度為60℃、80℃、96℃（沸騰）的多糖所得率分別為21.19%、32.61%、50.63%?？梢钥闯霎?dāng)溫度為96℃時(shí)，即本地的沸騰溫度時(shí)達(dá)到最大值50.63%，這是由于多糖的溶解度隨著溫度的升高而增大了，以及高溫下有對木通果皮細(xì)胞壁的破壞作用，使得糖利于溶出，所以提取溫度選取96℃（即沸騰時(shí)溫度）為最佳提取溫度。

2.1.2 提取次數(shù)對木通果皮多糖提取工藝的影響

精密稱取3 g左右的木通果皮粉末，每組3份，置于圓底燒瓶中，提取次數(shù)設(shè)置為1、2、3、4，料液比

1：20，每次提取1h，置沸水浴中回流提取，醇沉濃度為70%，其余操作依照“1.2.3～1.2.6”項(xiàng)所示得到待測液并計(jì)算其多糖的含量。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果為提取次數(shù)分別為：1、2、3、4次的多糖所得率分別為21.7%、23.79%、48.97%、49.16%，隨著提取次數(shù)的增加，木通果皮多糖的得率呈現(xiàn)上升趨勢，從2次到3次上升最大，1次到2次次之，到3～4次時(shí)基本趨于平緩，增加幅度最??；因此綜合考慮到之后步驟的簡化以及經(jīng)濟(jì)因素，提取3次或4次可能較好。

2.1.3 提取溶劑用量對木通果皮多糖提取工藝的影響

精密稱取3 g左右的樣品，每組3份，置于圓底燒瓶中，分別按料液比：1：10、1：15、1：20、1：25加入相應(yīng)蒸餾水，提取次數(shù)為2次，每次1h，置沸水浴中回流提取，醇沉濃度為70%，其余操作依照“1.2.3～1.2.6”項(xiàng)所示得到待測液并計(jì)算其多糖的含量，考察料液比對木通果皮多糖取得率的影響。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果為：料液比1：10、1：15、1：20、1：25的木通多糖的平均值分別為35.95%、35.97%、42.85%、43%。由此可以看出木通果皮多糖的提取率隨著料液比的增大而提高，從1：10到1：15多糖得率增加緩慢，只有0.2%；但從1：15～1：20時(shí)增大了6.88%，幅度較大；而之后又趨于平緩，1：20～1：25增大了0.15%，而提取成本增加；因此，可能料液比在1：20 左右在多糖得率較好的前提下，成本也較低。

2.1.4 醇沉濃度對木通果皮多糖提取工藝的影響

精密稱取3 g左右的木通果皮粉末，每組3份，置于圓底燒瓶中，料液比為1：20，提取次數(shù)為2次，每次1h，置沸水浴中回流提取，醇沉濃度設(shè)置為80%、70%、60%、50%，其余操作依照“2.2.3～2.2.6”項(xiàng)所示得到待測液并計(jì)算其多糖的含量，考察醇沉濃度對木通果皮多糖取得率的影響。

結(jié)果：醇沉濃度分別為80%、70%、60%、50%，多糖所得率分別為40.93%、39.21%、32.52%、20.12%。由此可以看出，醇沉濃度對木通果皮多糖的提取率有較大影響，濃度越大多糖所得率越高，其間醇沉濃度50%～70%的上升使得多糖多得率的提高較大，從70%～80%時(shí)隨著醇沉濃度的增大，多糖所得率的提高較緩慢。這有可能是醇沉濃度低時(shí)，一些低小分子低聚糖的沉淀不完全，結(jié)果偏低；而當(dāng)醇沉濃度高時(shí)含有的極性較大的苷類等成分也沉淀下來，致使結(jié)果偏高，因此也許70%左右的為較好的醇沉濃度。

2.2 木通果皮多糖的最佳提取工藝的正交實(shí)驗(yàn)分析

依據(jù)單因素試驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，設(shè)置提取條件為：溫度為沸水浴96℃、提取次數(shù)（A）、料液比（B）、醇沉濃度（C）來設(shè)計(jì)正交優(yōu)化試驗(yàn)（表2）。并在上述這3個(gè)單因素實(shí)驗(yàn)對木通果皮提取率的影響結(jié)果基礎(chǔ)上設(shè)定每個(gè)因素3個(gè)水平，在平行操作下，按

L9（34）正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表，以得多糖得率作為評價(jià)指標(biāo)對木通果皮多糖提取工藝條件優(yōu)化。

2.2.1 正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

實(shí)驗(yàn)得出以多糖得率為指標(biāo)，提取次數(shù)，料液比、醇沉濃度的F值均小于F0.05（2，2），則這三者對木通果皮多糖得率都沒有顯著影響。而由正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析中RA、RB、RC分別為0.158、0.159、0.192，則RC>RB>RA，A、B、C三因素對木通果皮多糖得率影響的主次順序是醇沉濃度>料液比>提取次數(shù)。上述結(jié)果分析表明，木通果皮多糖的最佳提取工藝為提取次數(shù)為3次，料液比為1：25，醇沉濃度為85%，而最佳提取溫度為96℃。詳見表3。

2.2.2 最佳工藝的驗(yàn)證

精密稱取木通果皮藥粉樣品3份，每份均為3 g，按上述最佳提出條件進(jìn)行木通多皮多糖的測定，得到平均得率為65.4%，RSD=3.72%，表明工藝重復(fù)性較好，提取多糖含量穩(wěn)定。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)是以干燥后的木通果皮為材料，利用熱水提取，醇沉法得到粗多糖，確定了最佳條件為：提取溫度為96℃（本地水沸騰時(shí)的溫度）、提取次數(shù)是3次，每次1h、醇沉濃度85%、料液比為1：25，多糖得率為65.4%。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表明，該工藝溫度，重復(fù)性較好。

水提法的植物多糖多含有些許蛋白、色素等雜質(zhì)，這些物質(zhì)對于植物多糖的測定可能會有影響。本實(shí)驗(yàn)在進(jìn)行去蛋白時(shí)，所產(chǎn)生的白色絮狀物不多幾乎沒有，據(jù)此可初步得出木通果皮的蛋白質(zhì)含量應(yīng)該不高，對多糖的含量測定影響不大。根據(jù)本次實(shí)驗(yàn)測得數(shù)據(jù)可以看出，熱水提取木通果皮多糖的提取率還是較高的，但多糖的提取法有多種，如可以超聲波提取、酸堿輔助提取、酶解提取等，或參考已研究出的某種植物多糖的提取方法，結(jié)合幾種提取方法混合提取。因此，最適合木通果皮多糖的提取方法，待今后研究者的進(jìn)一步研究。

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