3種不同添加物對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長、非特異免疫和抗病力的影響*

田相利, 秦光彩, 羅 凱, 汪仕爽, 劉 楊, 魏 聰, 王明陽, 董雙林, 劉清兵

(1. 海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(中國海洋大學(xué)), 山東 青島 266003; 2. 嶗山實(shí)驗(yàn)室, 山東 青島 266237; 3. 青島瑞滋集團(tuán)有限公司, 山東 青島 266408)

凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)俗稱南美白對(duì)蝦,自20世紀(jì)80年代末期引進(jìn)中國以來,已成為我國最主要的養(yǎng)殖對(duì)蝦種類之一[1]。中國凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)從沿海發(fā)展到內(nèi)陸,從土塘發(fā)展到工廠集約化,已經(jīng)形成了跨地域、跨時(shí)間、高度集中的產(chǎn)業(yè)模式。然而,隨著對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)的規(guī)?；⒓s化發(fā)展,對(duì)蝦病害也頻繁爆發(fā),給對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)帶來了嚴(yán)重?fù)p失,這成為對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)發(fā)展的主要制約因素[2]。益生菌作為一種控制多種水生動(dòng)物疾病的飼料添加劑,通過促進(jìn)水生動(dòng)物生長、提高免疫反應(yīng)、提高飼料利用率和消化酶活性、改善水質(zhì)等來發(fā)揮益生作用,益生菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖中具有廣泛的應(yīng)用前景[3-4]。

丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)是目前研究較多的產(chǎn)丁酸細(xì)菌之一,是一種厭氧革蘭氏陽性梭狀芽孢桿菌[5]。作為一種廣受關(guān)注的水產(chǎn)益生菌,丁酸梭菌被證實(shí)具有提高腸道消化酶活性和抗應(yīng)激能力、調(diào)節(jié)腸道菌群組成、拮抗病原菌等作用[6-7]。丁酸梭菌的主要代謝物丁酸是水產(chǎn)養(yǎng)殖中研究較多的短鏈脂肪酸之一。研究表明,丁酸不僅能夠有效促進(jìn)動(dòng)物生長[8],同時(shí)在保護(hù)動(dòng)物腸道屏障,提高腸道免疫功能,調(diào)控腸道微生態(tài)環(huán)境及維持腸道微生態(tài)平衡等方面也發(fā)揮著重要的作用[9]。不過,由于丁酸易揮發(fā)、氣味酸臭、動(dòng)物適口性較差等問題,其在水產(chǎn)飼料中一般以丁酸鹽或丁酸酯的形式添加[10],例如丁酸鈉,其在腸道中水解后產(chǎn)生丁酸。研究表明,丁酸鈉能夠調(diào)節(jié)腸道健康、促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)吸收、提高飼料利用率和養(yǎng)殖動(dòng)物的生長[11]。聚β-羥基丁酸酯(Poly-β-hydroxybutyrate, PHB),為短鏈脂肪酸β-羥基丁酸的聚合物,在動(dòng)物腸道中可被降解為水溶性的β-羥基丁酸單體,從而發(fā)揮短鏈脂肪酸作用[12]。研究表明,PHB可促進(jìn)水生動(dòng)物的生長、提高存活率、增強(qiáng)抗病力、調(diào)控水質(zhì)等[13]。盡管益生菌的作用與功效在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中已得到廣泛認(rèn)可,但在一些特定條件下,作為活菌形式使用的益生菌卻存在一定的不便或難度。例如,在對(duì)蝦飼料生產(chǎn)中,由于高溫和膨化等生產(chǎn)條件,直接添加丁酸梭菌活菌在技術(shù)上難度較大。因此,在使用益生菌的同時(shí),近年來人們也在尋求在飼料生產(chǎn)中添加丁酸鹽及相關(guān)化合物等更容易使用的添加物以替代丁酸梭菌活菌。

迄今為止,關(guān)于飼料中添加丁酸梭菌、聚β-羥基丁酸酯和丁酸鈉對(duì)凡納濱對(duì)蝦影響的比較研究尚少見報(bào)道。本研究參考前人的相關(guān)研究,設(shè)計(jì)了向?qū)ξr飼料中分別添加1×1011cfu·kg-1丁酸梭菌CBG01活菌、3%聚β-羥基丁酸酯和1%丁酸鈉,對(duì)比了這3種添加物對(duì)凡納濱對(duì)蝦的生長性能、非特異性免疫指標(biāo)和抗病力的影響,本研究不僅可為3種添加物在凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖中的合理應(yīng)用提供參考,也可有助于益生菌作用機(jī)理的深入解析。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌株與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

丁酸梭菌(C.butyricum)CBG01由中國海洋大學(xué)水產(chǎn)養(yǎng)殖生態(tài)實(shí)驗(yàn)室微生物保種中心提供。養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)開始前,把丁酸梭菌CBG01接種至加強(qiáng)培養(yǎng)基(葡萄糖1 g、酵母提取物0.5 g、胰蛋白胨1 g、牛肉浸膏0.5 g、硫酸銨0.1 g、硫酸鎂0.05 g、磷酸二氫鉀0.4 g、硫酸錳0.02 g、氯化鈉0.2 g、碳酸鈣0.1 g和蒸餾水100 mL)中,置于厭氧培養(yǎng)箱中37 ℃條件下活化培養(yǎng)24 h;其次將培養(yǎng)物在10 000 r·min-1(4 ℃)條件下離心20 min,菌體用無菌生理鹽水配制成1×1010cells·mL-1的菌懸液備用;最后參考Li等[14]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)丁酸梭菌活菌菌體的使用劑量。

聚β-羥基丁酸酯(PHB)購自寧波天安生物材料有限公司(中國寧波),有效成分為98%,PHB的使用劑量參照Duan等[15]和張?jiān)耓16]的研究結(jié)果。

丁酸鈉購自青島根源生物技術(shù)有限公司(中國青島),有效成分為98%,丁酸鈉的使用劑量參照張曉曉等[17]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

本實(shí)驗(yàn)共設(shè)計(jì)3個(gè)處理組(1×1011cfu·kg-1丁酸梭菌活菌,CB;3%聚β-羥基丁酸酯,PHB;1%丁酸鈉,BS)和1個(gè)對(duì)照組(DZ),每個(gè)組設(shè)置5個(gè)重復(fù)。

1.2 飼料制備

基礎(chǔ)飼料為購自青島正大農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司(中國青島)的商品飼料,主要成份如表1所示。實(shí)驗(yàn)飼料分為丁酸梭菌添加組(CB組,基礎(chǔ)飼料中添加1×1011cfu·kg-1丁酸梭菌CBG01活菌),PHB添加組(PHB組,基礎(chǔ)飼料中添加3% PHB),丁酸鈉添加組(BS組,基礎(chǔ)飼料中添加1%丁酸鈉)和對(duì)照組(DZ組,基礎(chǔ)飼料)。分別將丁酸梭菌、聚β-羥基丁酸酯、丁酸鈉均勻噴灑在對(duì)蝦飼料上,之后用魚油和海藻酸鈉溶液混合包裹[14],對(duì)照組飼料則直接將海藻酸鈉和魚油包裹在添加等量無菌生理鹽水的商品飼料表面,置于通風(fēng)處陰干,4 ℃保存?zhèn)溆?。為保證飼料中活菌的含量以及活菌的活力,所有飼料在制備后的2 h內(nèi)完成投喂。

表1 基礎(chǔ)飼料的營養(yǎng)成分

1.3 實(shí)驗(yàn)對(duì)蝦與養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)所用凡納濱對(duì)蝦來自青島正大農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司(中國青島)。由于原養(yǎng)殖場(chǎng)養(yǎng)殖對(duì)蝦的海水鹽度為23,而本實(shí)驗(yàn)所用海水鹽度為31,因而在暫養(yǎng)期間將養(yǎng)殖海水鹽度每日升高2,直至升到31,并繼續(xù)暫養(yǎng)14 d, 每天以蝦體體質(zhì)量5%的比例飼喂基礎(chǔ)飼料(見表1)。暫養(yǎng)與馴化結(jié)束后,對(duì)蝦饑餓24 h,隨后挑選健康、規(guī)格整齊的凡納濱對(duì)蝦300尾(平均體長(5.92±0.21) cm,平均體質(zhì)量(3.02±0.13) g),隨機(jī)均勻分配到20個(gè)水族箱(53 cm× 28 cm× 34 cm,50 L)中。對(duì)蝦養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)在青島瑞滋集團(tuán)有限公司的養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行,養(yǎng)殖周期為6周。

對(duì)蝦養(yǎng)殖期間,每天8:00、12:00、16:00和20:00進(jìn)行投喂。每日總投喂量為對(duì)蝦體質(zhì)量的8%。每次喂食1 h后用虹吸管收集殘餌和糞便,且在每次投喂和換水之前都要再次收集,收集后用水沖洗2～3次,60 ℃烘干并稱重。每日上午換水1次,每次換水量為1/3。對(duì)蝦養(yǎng)殖期間水質(zhì)條件設(shè)置如下:溫度25～28 ℃,鹽度28～31,pH 7.8～8.0,溶氧量>5 mg·L-1。

1.4 樣品采集

養(yǎng)殖結(jié)束后,將各組所有的凡納濱對(duì)蝦統(tǒng)一進(jìn)行饑餓處理24 h并進(jìn)行稱重記錄。從每個(gè)水族箱中隨機(jī)抽取6尾對(duì)蝦,每個(gè)處理組共抽取30尾蝦,采集對(duì)蝦的血液和肝胰腺。用無菌注射器采集血液并置于2 mL的滅菌離心管中,4 ℃保存24 h后以3 000 r·min-1轉(zhuǎn)速離心10 min,收集血清,-80 ℃保存。用消毒的剪刀和鑷子采集對(duì)蝦肝胰腺樣品,樣品剪碎后置于含有RNA保護(hù)液的滅菌離心管中,4 ℃靜置12 h后,轉(zhuǎn)到-80 ℃冰箱保存。

1.5 指標(biāo)測(cè)定

1.5.1 對(duì)蝦生長指標(biāo) 對(duì)蝦饑餓處理1 d后,將每個(gè)水族箱中對(duì)蝦的初末體質(zhì)量進(jìn)行稱重記錄。計(jì)算對(duì)蝦的成活率、特定生長率及飼料效率的公式[18-21]如下:

成活率(SR)=(Nt/N0)×100%;

特定生長率(SGR)=[(lnWt- lnW0)/T] × 100%;

飼料效率(FER)=(Wt-W0)/WF× 100%。

式中:N0和Nt分別表示凡納濱對(duì)蝦初始數(shù)量和終末數(shù)量(尾);W0和Wt分別表示凡納濱對(duì)蝦的初始體質(zhì)量和終末體質(zhì)量(g);T為養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)周期(d);WF表示養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)期間飼料投喂量(g)。

1.5.2 血清非特異性免疫參數(shù)和抗氧化能力 使用南京建成生物工程研究所(中國南京)的商業(yè)檢測(cè)試劑盒測(cè)定以下免疫參數(shù):對(duì)蝦血清中的堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase, AKP)、酸性磷酸酶(Acid phosphatase, ACP)、總一氧化氮合酶(Total nitric oxide synthase, T-NOS)、溶菌酶(Lysozyme, LZM)、過氧化物酶(Peroxidase, POD)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD)活性、總抗氧化能力(Total antioxidant capacity, T-AOC)和酚氧化酶(Phenoloxidase, PO)含量[18-21]。

1.5.3 肝胰腺中免疫相關(guān)基因 使用Trizol試劑從對(duì)蝦肝胰腺中提取總RNA,利用PrimeScriptTMRT試劑盒(Takara, 日本)將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,然后使用QuantStudioTM5 Real-time PCR系統(tǒng)(應(yīng)用生物系統(tǒng)公司,美國)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量RT-qPCR檢測(cè)免疫相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量。具體指標(biāo)包括超氧化物歧化酶基因、酚氧化酶原基因、溶菌酶基因、熱休克蛋白70基因、β-1,3-葡聚糖結(jié)合蛋白基因(LGBP)、Toll、Relish、免疫缺陷(Imd)基因、雷帕霉素靶蛋白基因(TOR)、真核翻譯起始因子4E基因(eIF4E)及其結(jié)合蛋白基因(4E-BP)。根據(jù)Luo等[19]的PCR擴(kuò)增程序與引物序列進(jìn)行qPCR擴(kuò)增,采用2-ΔΔCt相對(duì)定量法,計(jì)算飼糧中添加丁酸梭菌、PHB和丁酸鈉后對(duì)蝦肝胰腺中免疫相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)水平。

1.5.4 攻毒實(shí)驗(yàn) 樣品采集完畢后,以正常飼養(yǎng)條件繼續(xù)飼喂剩余的凡納濱對(duì)蝦5 d,隨后用副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)進(jìn)行攻毒。副溶血弧菌由中國海洋大學(xué)水產(chǎn)養(yǎng)殖生態(tài)實(shí)驗(yàn)室微生物保種中心提供,活化培養(yǎng)參考王明陽等[21]的方法。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,第14天的LC50(半數(shù)致死濃度)為8.3×108cfu·mL-1,即為副溶血弧菌的注射濃度。每個(gè)處理組隨機(jī)挑選21尾凡納濱對(duì)蝦進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)置3個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)放置7尾對(duì)蝦。14 d攻毒實(shí)驗(yàn)后,統(tǒng)計(jì)對(duì)蝦的累積死亡率。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

使用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。經(jīng)正態(tài)性、同質(zhì)性和獨(dú)立性檢驗(yàn)后,所有數(shù)據(jù)均采用單因素方差分析(one-way ANOVA)分析和Tukey’s多重比較分析。用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±S.E.)展示統(tǒng)計(jì)結(jié)果,P<0.05表示組間存在顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)蝦生長性能

飼料中添加丁酸梭菌活菌(CB)、聚β-羥基丁酸酯(PHB)和丁酸鈉(BS)對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長性能的影響如表2所示。CB組對(duì)蝦末體質(zhì)量和特定生長率均最高,顯著高于BS組和DZ組(P<0.05),與PHB組間差異不顯著(P>0.05)。PHB組對(duì)蝦末體質(zhì)量和特定生長率均顯著高于DZ組(P<0.05),與BS組間不存在顯著差異(P>0.05),BS組與DZ組間的末體質(zhì)量和特定生長率差異也不顯著(P>0.05)。CB組、PHB組和BS組對(duì)蝦成活率和飼料效率均顯著高于DZ組(P<0.05),其中,CB組飼料效率最高,BS組成活率最高。

表2 凡納濱對(duì)蝦的生長情況和存活率

2.2 對(duì)蝦血清非特異性免疫指標(biāo)

飼料中添加丁酸梭菌活菌(CB)、聚β-羥基丁酸酯(PHB)和丁酸鈉(BS)對(duì)凡納濱對(duì)蝦血清非特異性免疫指標(biāo)的影響如圖1所示。

CB組對(duì)蝦血清中堿性磷酸酶(AKP)、酸性磷酸酶(ACP)、溶菌酶(LZM)、過氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)活性,酚氧化酶(PO)含量以及總抗氧化能力(T-AOC)均顯著高于DZ組(P<0.05),其中,AKP和SOD活性顯著高于其他3組(P<0.05)。

PHB組對(duì)蝦血清中AKP、ACP、總一氧化氮合酶(T-NOS)、LZM、POD、SOD活性以及T-AOC均顯著高于DZ組(P<0.05),其中,ACP活性顯著高于其他3組(P<0.05)。

BS組對(duì)蝦血清中ACP、LZM、POD、SOD活性以及T-AOC均顯著高于DZ組(P<0.05),其中POD活性和T-AOC顯著高于其他3組(P<0.05)。

2.3 SOD、LZM、proPO、LGBP和HSP70基因相對(duì)表達(dá)水平

飼料中添加丁酸梭菌活菌(CB)、聚β-羥基丁酸酯(PHB)和丁酸鈉(BS)對(duì)凡納濱對(duì)蝦肝胰腺SOD、LZM、proPO、LGBP和HSP70基因相對(duì)表達(dá)水平的影響如表3所示。CB組、PHB組和BS組對(duì)蝦肝胰腺中SOD、LZM、LGBP和HSP70基因相對(duì)表達(dá)量均顯著高于DZ組(P<0.05),且各處理組間差異不顯著(P>0.05)。CB組對(duì)蝦肝胰腺中proPO基因相對(duì)表達(dá)量最高,顯著高于BS組和DZ組(P<0.05),而與PHB組相比則不存在顯著差異(P>0.05)。

表3 凡納濱對(duì)蝦肝胰腺中SOD、LZM、proPO、LGBP和HSP70基因的相對(duì)表達(dá)量

2.4 Imd、Toll和Relish基因相對(duì)表達(dá)量

飼料中添加丁酸梭菌活菌(CB)、聚β-羥基丁酸酯(PHB)和丁酸鈉(BS)對(duì)凡納濱對(duì)蝦肝胰腺Imd、Toll和Relish基因相對(duì)表達(dá)量的影響如圖2所示。PHB組對(duì)蝦肝胰腺中Imd基因相對(duì)表達(dá)量最高,顯著高于BS組和DZ組(P<0.05),與CB組間差異不顯著(P>0.05)。CB組對(duì)蝦肝胰腺中Imd基因相對(duì)表達(dá)量顯著高于DZ組(P<0.05),與BS組間差異不顯著(P>0.05)。CB組對(duì)蝦Toll基因相對(duì)表達(dá)量顯著高于DZ組(P<0.05),但與其他兩處理組間差異不顯著(P>0.05),PHB組和BS組對(duì)蝦肝胰腺中Toll基因相對(duì)表達(dá)量與DZ組間差異也不顯著(P>0.05)。CB組和PHB組對(duì)蝦肝胰腺中Relish基因相對(duì)表達(dá)量顯著高于DZ組(P<0.05),而與BS組間不存在顯著差異(P>0.05),BS組與DZ組間Relish基因相對(duì)表達(dá)量差異也不顯著(P>0.05)。

圖2 凡納濱對(duì)蝦肝胰腺中Imd、Toll和Relish基因的相對(duì)表達(dá)量

2.5 mTOR信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)

飼料中添加丁酸梭菌活菌(CB)、聚β-羥基丁酸酯(PHB)和丁酸鈉(BS)對(duì)凡納濱對(duì)蝦肝胰腺mTOR信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)的影響如圖3所示。CB組、PHB組和BS組對(duì)蝦肝胰腺中TOR、4E-BP和eIF4E1α基因相對(duì)表達(dá)量均顯著高于DZ組(P<0.05),另外,PHB組對(duì)蝦肝胰腺中TOR、4E-BP和eIF4E1α基因相對(duì)表達(dá)量顯著高于BS組(P<0.05)。CB組對(duì)蝦TOR基因相對(duì)表達(dá)量顯著高于BS組(P<0.05),而4E-BP、eIF4E1α和eIF4E2基因相對(duì)表達(dá)量與BS組間差異不顯著(P>0.05)。CB組和PHB組對(duì)蝦肝胰腺中eIF4E2基因相對(duì)表達(dá)量顯著高于DZ組(P<0.05),而BS組與DZ組間差異不顯著(P>0.05)。

圖3 凡納濱對(duì)蝦肝胰腺中mTOR信號(hào)通路相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量

2.6 抗病力

如圖4所示,經(jīng)副溶血弧菌攻毒后,對(duì)照組對(duì)蝦累計(jì)死亡率顯著高于CB組、PHB組和BS組(P<0.05),而3處理組間差異不顯著(P>0.05)。

圖4 飼料中添加丁酸梭菌活菌、3%聚β-羥基丁酸酯和1%丁酸鈉對(duì)副溶血弧菌感染后凡納濱對(duì)蝦累計(jì)死亡率的影響

3 討論

3.1 生長指標(biāo)

近年來,作為一類效果優(yōu)良、綠色環(huán)保的飼料添加劑,益生菌日益受到廣泛關(guān)注。益生菌不僅可提高養(yǎng)殖對(duì)象的生長性能,具有調(diào)控養(yǎng)殖水體水質(zhì)和提高宿主免疫力及抗病力的潛力[22-23],還可通過與致病菌競爭生存環(huán)境等機(jī)制來抑制致病菌的繁殖,從而提高水產(chǎn)動(dòng)物的成活率[24]。進(jìn)一步研究表明,益生菌能通過影響腸道細(xì)菌群落的種間相互作用促進(jìn)宿主腸道菌群的穩(wěn)態(tài),進(jìn)而提高腸道的營養(yǎng)消化能力[25]。在種類繁多的益生菌中,丁酸梭菌對(duì)水生動(dòng)物生長和健康的有益作用已得到驗(yàn)證與認(rèn)可。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),飼料中添加適宜濃度的丁酸梭菌可有效促進(jìn)部分養(yǎng)殖動(dòng)物的生長,涉及的種類包括凡納濱對(duì)蝦[26]、吉富羅非魚(Oreochromisniloticus)[5]、日本囊對(duì)蝦(Marsupenaeusjaponicus)[27]等。與此同時(shí),國內(nèi)外對(duì)于與丁酸梭菌主要的代謝產(chǎn)物丁酸相關(guān)的丁酸鹽、丁酸酯及丁酸聚合物等作為抗生素替代的環(huán)保型飼料添加劑的功能與作用也進(jìn)行了較多研究,例如丁酸鈉、三丁酸酯和聚β-羥基丁酸酯等[28-32]。有研究表明,聚β-羥基丁酸酯和丁酸鈉單獨(dú)使用或者與其他丁酸衍生物聯(lián)合使用可有效提高梭魚(Lizahaematocheila)[28]、中華絨蝥蟹(Eriocheirsinensis)[29]、西伯利亞鱘(Acipenserbaerii)[30]、黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)[31]、草魚(Ctenopharyngodonidellus)[32]等水生動(dòng)物的生長和飼料利用率。不過目前為止,關(guān)于丁酸梭菌、丁酸鈉和聚β-羥基丁酸酯3種添加物對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長性能影響的比較研究尚未見報(bào)道。在本研究中,飼料中添加丁酸梭菌和PHB后凡納濱對(duì)蝦的末體質(zhì)量、特定生長率和飼料效率均顯著高于對(duì)照組,但添加丁酸鈉組對(duì)蝦的末體質(zhì)量和特定生長率與對(duì)照組相比未見顯著差異。這一結(jié)果表明,添加丁酸梭菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長促進(jìn)作用要明顯優(yōu)于添加丁酸鈉,但與添加PHB的效果基本相當(dāng)。

3.2 血清非特異性免疫酶活性

一般認(rèn)為,對(duì)蝦多依靠其非特異性免疫系統(tǒng)來抵御外來病原微生物的入侵[33]。當(dāng)受到入侵時(shí),對(duì)蝦的模式識(shí)別蛋白或受體(PRPs)與病原體相關(guān)分子模式(PAMPs)識(shí)別并結(jié)合,如肽聚糖(PG)、脂多糖(LPS)和β-1, 3-葡聚糖(βG),然后激活各種免疫反應(yīng)[34]。對(duì)蝦體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生一些免疫分子如抗菌肽、酚氧化酶、氧化酶和Toll受體等[35]。其中,酚氧化酶執(zhí)行黑化作用,并由酚氧化酶原(proPO)級(jí)聯(lián)控制,在無脊椎動(dòng)物免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用,使其能夠?qū)Σ≡w感染做出快速反應(yīng),而β-1,3-葡聚糖結(jié)合蛋白(LGBPs)則是 proPO級(jí)聯(lián)的模式識(shí)別蛋白(PRPs)[36]。其他免疫成分,如堿性磷酸酶(AKP)和酸性磷酸酶(ACP)是溶酶體中的主要水解酶,在甲殼類動(dòng)物的免疫系統(tǒng)中也起著至關(guān)重要的作用,是先天免疫的第一道防線[37]。此外,對(duì)蝦中的抗氧化酶系統(tǒng)(如超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)和谷胱甘肽等)可以保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激的影響[37-38]。總抗氧化能力(T-AOC)被認(rèn)為是評(píng)估抗氧化酶系統(tǒng)抗氧化狀態(tài)的重要指標(biāo)[39]。由于具有較高的氧化能力,NO可以激活機(jī)體的免疫功能,而NO的產(chǎn)生依賴一氧化氮合酶(NOS)的作用,NO和NOS活性在對(duì)蝦的防御系統(tǒng)中起著重要作用[40-41]。本研究中,與對(duì)照組相比,添加丁酸梭菌處理組的對(duì)蝦血清中AKP、ACP、LZM、POD、SOD活性、T-AOC和PO含量均顯著提高,添加PHB處理組的對(duì)蝦血清中AKP、ACP、T-NOS、LZM、POD、SOD活性以及T-AOC有所升高,丁酸鈉處理組中ACP、LZM、POD、SOD活性和T-AOC也有所提高。這與以往的研究相似,例如,飼料中添加適宜濃度的丁酸梭菌可提高凡納濱對(duì)蝦中LZM、AKP、ACP、SOD等活性和T-AOC[42];添加3%PHB顯著提高了凡納濱對(duì)蝦中T-AOC和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)等酶活性,而添加1%、3%和5%PHB均可顯著提高對(duì)蝦中NO含量[15];飼料中添加適宜濃度的丁酸鈉可提高凡納濱對(duì)蝦的AKP活性和PO含量[43]。在本研究中,與對(duì)照組相比,3個(gè)處理組的POD、SOD活性和T-AOC均顯著提高,說明3種添加物均可在一定程度上提高凡納濱對(duì)蝦的抗氧化能力。但3種添加物間相比較,其作用效果存在一定的差異。丁酸梭菌處理組的對(duì)蝦血清AKP和SOD活性及PO含量最高;而添加PHB處理組的ACP、T-NOS和LZM活性最高,丁酸鈉處理組則是POD活性和T-AOC最高。總體而言,3種添加物均可一定程度提高凡納濱對(duì)蝦非特異免疫相關(guān)酶活性,其中添加丁酸梭菌和PHB效果優(yōu)于添加丁酸鈉,更有助于對(duì)蝦抗應(yīng)激能力的提升。

3.3 肝胰腺組織免疫相關(guān)基因表達(dá)水平

甲殼動(dòng)物主要依靠先天免疫系統(tǒng)進(jìn)行自身防御,主要包括細(xì)胞免疫和體液免疫兩大類[44-45]。體液免疫包括對(duì)微生物的識(shí)別、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(如Toll通路、IMD通路、JAK/STAT通路)以及免疫效應(yīng)物的產(chǎn)生[46]。Toll通路和IMD通路是調(diào)控抗菌肽基因表達(dá)的重要信號(hào)通路。其中,Toll通路在對(duì)革蘭氏陽性細(xì)菌和真菌的反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用,而IMD信號(hào)優(yōu)先介導(dǎo)對(duì)革蘭氏陰性菌的先天免疫[46-47]。信號(hào)通路激活導(dǎo)致核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核,最終誘導(dǎo)免疫效應(yīng)分子如抗菌肽的表達(dá),Relish則是NF-κB家族成員之一[48-49]。另外,mTOR(mechanistic target of rapamycin)信號(hào)通路在營養(yǎng)調(diào)節(jié)和細(xì)胞發(fā)育中發(fā)揮著重要作用,并廣泛存在于真核生物、食物攝入和環(huán)境應(yīng)激等過程中[47]。其中,mTORC1(mechanistic target of rapamycin complex 1)是代謝的主要調(diào)節(jié)因子,通過真核翻譯起始因子4E(eIF4E)結(jié)合蛋白1(4E-BP1)和S6激酶的磷酸化促進(jìn)翻譯[50]。eIF4E蛋白家族由eIF4E1, eIF4E2和eIF4E3組成[51],其活性受4E-BPs的調(diào)控[52]。本研究中,添加丁酸梭菌后對(duì)蝦肝胰腺所有的免疫相關(guān)基因(SOD、LZM、LGBP、HSP70、Imd、Toll、Relish、TOR、4E-BP、eIF4E1α、eIF4E2)的相對(duì)表達(dá)量均顯著上調(diào)。相比較,PHB添加組中的對(duì)蝦肝胰腺Toll基因與丁酸鈉添加組中的Imd、Toll、Relish、eIF4E2基因的表達(dá)水平與對(duì)照組相比未見顯著差異。綜合比較發(fā)現(xiàn),添加丁酸梭菌和PHB均對(duì)凡納濱對(duì)蝦免疫相關(guān)基因的表達(dá)有較好的促進(jìn)作用,飼料中添加丁酸梭菌和PHB可以有效誘導(dǎo)免疫相關(guān)基因的表達(dá),進(jìn)而提高凡納濱對(duì)蝦的免疫能力。添加丁酸鈉也可以促進(jìn)免疫相關(guān)基因的上調(diào),但其作用效果在一定程度上要弱于添加丁酸梭菌和PHB。當(dāng)然,關(guān)于三者對(duì)凡納濱對(duì)蝦免疫相關(guān)基因表達(dá)的影響差異的原因還值得進(jìn)一步研究。

3.4 抗病力

隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展,各種細(xì)菌、病毒、真菌和寄生蟲性疾病不斷出現(xiàn),造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[53]。其中,細(xì)菌性疾病被認(rèn)為是水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物最主要的致病因素之一[54],而弧菌則是海水養(yǎng)殖動(dòng)物主要的條件性致病菌,包括副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)、哈維氏弧菌(V.harveyi)、創(chuàng)傷弧菌(V.vulnificus)等[55-56]。尤其副溶血弧菌,可引起急性肝胰腺壞死綜合征(AHPNS)或早期死亡綜合征(EMS),對(duì)對(duì)蝦具有較高致死率[57]。益生菌可通過與病原菌競爭結(jié)合位點(diǎn)和營養(yǎng)物質(zhì)、產(chǎn)生抑菌物質(zhì)、調(diào)節(jié)免疫指標(biāo)等方式來提高宿主的抗病力[24]。因此,通過合理添加益生菌,提高對(duì)蝦免疫力和抵抗力,是目前對(duì)蝦健康養(yǎng)殖管理的主要對(duì)策之一。研究表明,飼料中添加適宜濃度的丁酸梭菌或PHB可提高養(yǎng)殖動(dòng)物對(duì)副溶血弧菌[14]、維氏氣單胞菌(Aeromonasveronii)[58]、愛德華氏菌(Edwardsiellaictaluri)[59]、鰻弧菌(V.anguillarum)[29]等病原菌的抗病力。丁酸鈉也可以在一定程度上降低養(yǎng)殖動(dòng)物被白斑綜合癥病毒(WSSV)感染后的死亡率[60]。在本研究中,添加丁酸梭菌、PHB和丁酸鈉均顯著降低了副溶血弧菌攻毒時(shí)凡納濱對(duì)蝦的死亡率,但在提高對(duì)蝦對(duì)副溶血弧菌抵抗力效果上未見顯著差異。

4 結(jié)論

飼料中添加丁酸梭菌、PHB和丁酸鈉均可不同程度提高凡納濱對(duì)蝦的生長性能和非特異免疫能力,能夠顯著提高對(duì)蝦對(duì)副溶血弧菌感染的抵抗力。綜合比較,添加丁酸梭菌和PHB的作用效果基本相當(dāng),在一定程度上優(yōu)于添加丁酸鈉。因此,在飼料生產(chǎn)加工過程中難以添加丁酸梭菌活菌的情況下,建議適當(dāng)添加聚β-羥基丁酸酯作為丁酸梭菌的替代品。