芍藥苷轉(zhuǎn)化酶G6046 的異源表達(dá)及酶活鑒定

韓瀠儀 李章涵 曹學(xué)麗 裴海閏

（北京食品營(yíng)養(yǎng)與人類(lèi)健康高精尖創(chuàng)新中心 北京工商大學(xué)輕工科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 100048）

芍藥（Paeonia lactifloraPall）在中藥中被廣泛使用，歷史悠久，安全性好［1］?！板羞b丸”和“逍遙散”是典型的含有芍藥的中草藥制劑，是治療抑郁癥類(lèi)疾病的處方藥［2-3］。芍藥的干根具有減輕疼痛、補(bǔ)血和調(diào)理月經(jīng)的藥理活性［4］。芍藥苷是一種植物源水溶性單萜類(lèi)糖苷，是芍藥的重要成分之一，對(duì)心腦血管系統(tǒng)尤其是在糖尿病相關(guān)的大血管并發(fā)癥方面有保護(hù)作用［5-6］。此外，研究表明，芍藥苷通過(guò)抑制小鼠海馬小膠質(zhì)細(xì)胞，激活神經(jīng)元FGF?2/FGFR1 信號(hào)，實(shí)現(xiàn)神經(jīng)保護(hù)和抗抑郁作用［7］。因此，芍藥苷有可能是治療帕金森、阿爾茨海默?。?-10］、抗凋亡［11］、抗炎［12］、抗氧化［13］和抗抑郁活性［7,14-15］的重要候選藥物。

生物利用度低是許多具有藥理作用的天然化合物的共同限制［16］。芍藥苷主要從芍藥中提取，口服給藥后，直接吸收的很少，生物利用度較低［17］。芍藥苷靜脈給藥后主要以原型從腎臟排泄，離體肝灌流結(jié)果顯示它幾乎不能被代謝［18］。芍藥苷在血漿中的動(dòng)力學(xué)參數(shù)也表明，它很少能在肺、肝和腸壁中轉(zhuǎn)化和吸收［19］。有研究表明，芍藥苷主要由腸道菌群代謝，其藥理作用可能通過(guò)芍藥苷代謝物產(chǎn)生［20］。然而，由于芍藥苷的生物利用度低和藥理機(jī)制未被揭示，導(dǎo)致其臨床適用性受到很大限制［18,21］。最近有研究顯示，腸道微生物酶的降解可能是芍藥苷生物利用度低的主要原因之一［14］。此外，關(guān)于芍藥苷及其他活性成分在大鼠胃腸道菌群中的吸收和轉(zhuǎn)化的研究表明，芍藥苷在大鼠盲腸和結(jié)腸中24 h 內(nèi)被完全轉(zhuǎn)化［22］。這些結(jié)果證實(shí)了腸道菌群會(huì)代謝芍藥苷，并且芍藥苷可能對(duì)腸道微生物菌群同樣有調(diào)節(jié)作用，從而有助于緩解抑郁癥［14］。因此，研究芍藥苷的代謝產(chǎn)物及其腸道細(xì)菌的代謝作用對(duì)深入了解其藥理機(jī)制具有重要意義。

一些微生物酶具有相對(duì)的底物特異性。它們通常催化某一個(gè)特定的化學(xué)鍵類(lèi)型或是具有立體結(jié)構(gòu)特異性的反應(yīng)。由于微生物代謝產(chǎn)物與哺乳動(dòng)物代謝產(chǎn)物的相似性，微生物轉(zhuǎn)化已被用作研究某些藥物或天然產(chǎn)物在哺乳動(dòng)物體內(nèi)代謝的有效輔助方法［23-24］。有研究表明，微生物可以轉(zhuǎn)化芍藥苷，如短刺小克銀漢霉（Cunningham blakesleeana）（AS 3.970）［25-26］，但至今沒(méi)有詳細(xì)的機(jī)制報(bào)道。

本課題組前期通過(guò)蛋白質(zhì)質(zhì)譜和轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析鑒定，在短刺小克銀漢霉中確定了一個(gè)芍藥苷轉(zhuǎn)化酶G6046（paeoniflorin converting enzyme, GenBank:OP856858.1），此酶可以將芍藥苷轉(zhuǎn)化為其他代謝產(chǎn)物，相關(guān)研究成果已發(fā)表［27］。使用軟件PSIPRED 4.0［28］和Phyre2［29］預(yù)測(cè)了G6046 的跨膜區(qū)、信號(hào)肽、二級(jí)結(jié)構(gòu)及三級(jí)結(jié)構(gòu)，分析預(yù)測(cè)模型結(jié)果發(fā)現(xiàn)，N 端第42-57 個(gè)氨基酸的區(qū)域?yàn)榭缒さ鞍讌^(qū)。因此，前期研究還對(duì)基因N 端1-246 bp 堿基序列進(jìn)行截?cái)?，命名為G6046?NΔ82，再將目的基因G6046?NΔ82 和載體pET?22b 進(jìn)行連接，成功構(gòu)建了G6046?NΔ82?22b［27］。為了驗(yàn)證此載體表達(dá)出的G6046 截?cái)嗍欠窬哂猩炙庈盏霓D(zhuǎn)化活性，本研究在大腸桿菌（Escherichia coli）中表達(dá)、純化了G6046 蛋白的NΔ82 截?cái)?，并在體外對(duì)其酶活性進(jìn)行了評(píng)估。結(jié)果證實(shí)G6046 蛋白確實(shí)可以將芍藥苷轉(zhuǎn)化為多種代謝產(chǎn)物，且經(jīng)過(guò)純化及條件優(yōu)化后，可以大大提高了芍藥苷的轉(zhuǎn)化效率。這可能為研究芍藥苷的微生物代謝提供了一條線索。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與材料 氨芐青霉素（Amp）、異丙基-β-D?硫代半乳糖苷（IPTG）、苯甲磺酰氟（PMSF）、5×蛋白上樣緩沖液和Tris：北京索萊寶科技有限公司；咪唑：賽默飛世爾科技有限公司；甘油、乙酸乙酯、正丁醇、乙醇和甲醇（分析純），上海麥克林生化科技有限公司；NaCl、HCl 和NaOH（分析純）：中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)有限公司；甲醇（色譜純），美國(guó)Fisher Scientific 公司；芍藥苷標(biāo)準(zhǔn)品：上海源曄生物科技有限公司；Ni?NTA 鎳柱：美國(guó)GE Healthcare 公司；Bradford：天根生化科技有限公司；胰蛋白胨和酵母提取物：英國(guó) OXOID 公司。

1.1.2 菌株與培養(yǎng)基 大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞：北京全式金生物技術(shù)有限公司；G6046?NΔ82?22b 重組質(zhì)粒為本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建［27］。LB 液體培養(yǎng)基（g/L）：胰蛋白胨10、NaCl 10、酵母提取物5；LB 固體培養(yǎng)基（g/L）： 胰蛋白胨10、NaCl 10、酵母提取物5、瓊脂15；Amp 抗性液體LB 培養(yǎng)基（g/L）：胰蛋白胨10、NaCl 10、酵母提取物5、100 mg/L Amp。Amp 抗性固體LB 培養(yǎng)基（g/L）：胰蛋白胨10、NaCl 10、酵母提取物5、瓊脂15、100 mg/L Amp。

1.1.3 儀器與設(shè)備 電子分析天平：美國(guó)Denver 公司；高效液相色譜儀（HPLC）：Agilent 1260，美國(guó)Agilent 科技有限公司；恒溫金屬浴和恒溫磁力攪拌器：英國(guó)OXOID 公司；小型臺(tái)式離心機(jī)：北京索萊寶科技有限公司；高速冷凍離心機(jī)、恒溫振蕩培養(yǎng)箱和微量核酸蛋白檢測(cè)儀：Thermo Scientific 公司；高壓蒸汽滅菌鍋：日本松下公司；超凈工作臺(tái)：北京化工廠；超聲波細(xì)胞破碎儀：上海滬析實(shí)業(yè)有限公司；超速離心機(jī)：日本日立公司。

1.2 方法

1.2.1 重組載體G6046?NΔ82?22b 在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá) 將已經(jīng)構(gòu)建成功的G6046?NΔ82?22b 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21（DE3）中，誘導(dǎo)表達(dá)G6046目的蛋白。首先將凍存的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞BL21（DE3）（100 μL）在冰上融化5-10 min 后，加入重組質(zhì)粒（1 μL），于冰上放置30 min。將混合液于42℃水浴中熱激60 s，隨后立即在冰上冷激2 min。向冷激后的混合液中加入LB 液體培養(yǎng)基900 μL 后，放置于37℃，150 r/min 振蕩培養(yǎng)45 min，離心2 min（1 000 ×g），棄上清（管內(nèi)剩余大約100 μL LB 液體培養(yǎng)基）。振蕩混合均后將混合液均勻涂布在Amp抗性的LB 固體培養(yǎng)基上。37℃培養(yǎng)過(guò)夜后，挑取一個(gè)單克隆菌落，接種至100 mL LB 液體培養(yǎng)基（100 μg/mL Amp），37℃，180 r/min，培養(yǎng)12 h 作為種子液。向1 L 的LB 液體培養(yǎng)基中接種種子液30-50 mL，37℃，160 r/min 培養(yǎng)至OD600=0.8 時(shí)，加入IPTG 使終濃度為0.5 mmol/L 進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。繼續(xù)在一定溫度（37℃、20℃、16℃）條件下分別培養(yǎng)4 h、12 h或者20 h，離心（4℃，8 000 r/min，15 min），棄上清，收集菌體并儲(chǔ)存于?40℃以備進(jìn)一步使用。

1.2.2 芍藥苷轉(zhuǎn)化酶G6046 的提取 將5 g 菌體重懸于50 mL 裂解緩沖液（50 mmol/L Tris，pH 8.5，300 mmol/L NaCl，10%甘油），加入500 μL PMSF（0.01 mol/L）。將渦旋均勻的菌懸液置于冰上，超聲破碎45 min（超聲3 s，停9 s，功率120 W），超聲后的菌液于4℃，16 000 r/min 離心1 h。分別收集上清和沉淀，取少許沉淀于1.5 mL 離心管中，溶于30 μL裂解緩沖液（圖1?A 中P），4℃留存?zhèn)溆?。?0 μL上清（圖1?A 中S），4℃留存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 芍藥苷轉(zhuǎn)化酶G6046 的純化 Ni?NTA 柱沖洗平衡后將上一步中收集的蛋白上清液于4℃層析柜中流經(jīng)Ni?NTA 柱，收集30 μL 流出液（Ft），4℃留存?zhèn)溆?。使? 倍柱體積的裂解緩沖液沖洗Ni?NTA 柱，收集30 μL 流出液（W1），4℃留存?zhèn)溆?。使? 倍柱體積的20 mmol/L 咪唑溶液沖洗Ni?NTA柱，收集30 μL 流出液（W2），4℃留存?zhèn)溆?。使?0 mL 濃度為200 mmol/L 咪唑溶液洗脫目的蛋白，收集洗脫液，取30 μL（E），4℃留存?zhèn)溆?。蛋白純化完成后，使? 倍柱體積的去離子水沖洗Ni?NTA柱，沖洗后將Ni?NTA 柱保存于20%乙醇中，存放于4℃層析實(shí)驗(yàn)冷柜備用。用Bradford 法測(cè)定洗脫的G6046 蛋白的濃度，用SDS?PAGE 評(píng)估目標(biāo)蛋白的純度。

1.2.4 芍藥苷轉(zhuǎn)化反應(yīng) 將純化后的G6046 芍藥苷轉(zhuǎn)化酶轉(zhuǎn)入超濾管中，經(jīng)高速冷凍離心機(jī)（3 000r/min，4℃）超濾濃縮，再加入裂解緩沖液繼續(xù)超濾，此步驟重復(fù)3 次以去除咪唑，最后濃縮至1 mL。使用微量核酸蛋白檢測(cè)儀檢測(cè)蛋白濃度，計(jì)算蛋白含量。用裂解緩沖液稀釋至原體積（相當(dāng)于原濃度蛋白溶液），按酶∶芍藥苷=1∶1（mg/mg）的比例添加芍藥苷，即為芍藥苷反應(yīng)液。置于室溫下反應(yīng)，第0、24、48、72、96 小時(shí)分別取50 μL 反應(yīng)液，按反應(yīng)液∶甲醇 = 1∶6 的比例加入甲醇（色譜級(jí)），使酶失活。待蛋白沉淀后離心，盡可能完全去除沉淀，吸取上清液過(guò)0.22 μm 濾膜，進(jìn)行HPLC 檢測(cè)。

1.2.5 生物轉(zhuǎn)化活性的HPLC 分析 向2 mL 離心管中加入1 mL 裂解緩沖液（pH 8.5），1 mg 芍藥苷，待溶解后加入濃度為1 mg/mL 的純G6046 蛋白溶液，每24 h 取反應(yīng)液50 μL 檢測(cè)，連續(xù)監(jiān)測(cè)反應(yīng)96 h。使用Agilent ZORBAX SB?C18 色譜柱（150 mm×4.6mm, 5 μm）進(jìn)行HPLC 分析以檢測(cè)芍藥苷和轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的濃度。HPLC 流動(dòng)相為甲醇（A）和0.2%磷酸水（B）（A∶B = 30∶70）；檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm；流速為1 mL/min；洗脫時(shí)間為15 min；柱溫30℃；進(jìn)樣量10 μL。G6046 比酶活被定義為在25℃條件下，每1 h 轉(zhuǎn)化1 μmol 芍藥苷所需酶量。

1.2.6 pH 的優(yōu)化 調(diào)節(jié)裂解緩沖液至不同pH（7.0、8.0、9.0、10.0），取40 μL G6046 酶液（1 mg/mL），加入960 μL 不同pH 的裂解緩沖液，25℃下預(yù)保溫30 min 后分別加入1 mg 芍藥苷底物，經(jīng)HPLC 檢測(cè)反應(yīng)初始芍藥苷含量后立即放入25℃金屬浴中進(jìn)行反應(yīng)。于1 h、2 h、3 h 取樣50 μL，按反應(yīng)液∶甲醇 = 1∶6 的比例加入甲醇（色譜級(jí)）。待蛋白沉淀后離心，去除沉淀，吸取上清液過(guò)濾膜（0.22 μm），通過(guò)HPLC 檢測(cè)芍藥苷反應(yīng)量，檢測(cè)方法同1.2.5。

1.2.7 反應(yīng)溫度的優(yōu)化 優(yōu)化反應(yīng)pH 后，選取芍藥苷轉(zhuǎn)化酶G6046 反應(yīng)最適pH，在經(jīng)Ni?NTA 柱純化后的目的蛋白在超濾濃縮后使用最適pH 裂解緩沖液稀釋至原體積，取6 個(gè)離心管，分別加入1 mL酶液，保存于15℃、25℃、35℃、45℃、55℃和65℃金屬浴30 min 后每管中加入1 mg 芍藥苷，利用HPLC 檢測(cè)反應(yīng)初始芍藥苷含量。檢測(cè)后立即保存在相應(yīng)溫度的金屬浴中進(jìn)行反應(yīng)，每1 h 測(cè)定芍藥苷的含量。按反應(yīng)液∶甲醇 = 1∶6 的比例加入甲醇（色譜級(jí)）。待蛋白沉淀后離心，去除沉淀，吸取上清液過(guò)濾膜（0.22 μm），通過(guò)HPLC 檢測(cè)第0、1、2、3、10、16、24 小時(shí)的芍藥苷反應(yīng)量，檢測(cè)方法同1.2.5。

2 結(jié)果

2.1 重組大腸桿菌誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化

由圖1?A 可知，G6046?NΔ82?22b 蛋白部分為包涵體形式存在于沉淀中，但也有部分蛋白在上清中表達(dá)。不同誘導(dǎo)條件下的蛋白含量結(jié)果如圖1?B，16℃，誘導(dǎo)24 h 產(chǎn)酶量最高，達(dá)到5.34 mg/g。因此在后續(xù)優(yōu)化轉(zhuǎn)化反應(yīng)實(shí)驗(yàn)時(shí)均選用此條件誘導(dǎo)目的蛋白的表達(dá)。

2.2 不同反應(yīng)條件對(duì)芍藥苷轉(zhuǎn)化酶G6046活性的影響

2.2.1 pH 對(duì)芍藥苷轉(zhuǎn)化酶G6046 活性的影響 在不同pH（7.0、8.0、9.0、10.0）條件下芍藥苷轉(zhuǎn)化酶G6046 的pH?酶活曲線如圖2 所示。在pH 9.0 時(shí)，第1 小時(shí)轉(zhuǎn)化量為0.246 mg（2.35%），到第3 小時(shí)芍藥苷轉(zhuǎn)化量為1.327 mg（12.67%），芍藥苷轉(zhuǎn)化率最高，如圖2 所示。由此可以計(jì)算得知，在25℃，pH 9.0 條件下G6046 比酶活為4.22 U/mg。因此，芍藥苷轉(zhuǎn)化酶G6046 反應(yīng)最適pH 為9.0。

圖2 芍藥苷轉(zhuǎn)化酶G6046 的pH-酶活曲線Fig. 2 pH-enzyme activity curve of paeoniflorin converting enzyme G6046

2.2.2 溫度對(duì)芍藥苷轉(zhuǎn)化酶G6046 活性的影響 由于芍藥苷轉(zhuǎn)化酶G6046 反應(yīng)最適pH 為9.0，因此選用pH 9.0 的裂解緩沖液為反應(yīng)環(huán)境來(lái)優(yōu)化反應(yīng)溫度。扣除空白對(duì)照后得到不同溫度-酶反應(yīng)速度曲線如圖3 所示，由結(jié)果可知，酶反應(yīng)曲線在約3 h 內(nèi)保持線性關(guān)系，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，曲線趨于平緩，反應(yīng)速率逐漸降低。

圖3 芍藥苷轉(zhuǎn)化酶G6046 在pH 9.0，不同溫度條件下酶反應(yīng)曲線Fig. 3 Enzyme reaction curves of paeoniflorin converting enzyme G6046 at pH 9.0 and different temperatures

取前3 h 呈線性關(guān)系的部分繪制pH 9.0 條件下不同溫度G6046 反應(yīng)模型（圖4?A）。由圖可知，在45℃條件下，前3 h 酶反應(yīng)曲線斜率最高，酶活最強(qiáng)，酶反應(yīng)線性關(guān)系為y=10.57x。取各溫度下前3 h 呈線性關(guān)系部分繪制溫度-酶活曲線圖（圖4?B）。由圖可知，在pH 為9.0，溫度為45℃時(shí)，芍藥苷轉(zhuǎn)化率最高，第1小時(shí)芍藥苷轉(zhuǎn)化量為1.107 mg（10.57%），第3 小時(shí)芍藥苷轉(zhuǎn)化量為3.320 mg（31.71%），由此可以計(jì)算得知，在45℃，pH 9.0 條件下G6046 比酶活為14.56 U/mg。因此，芍藥苷轉(zhuǎn)化酶G6046 反應(yīng)最適pH 為9.0；最適溫度為45℃。后續(xù)實(shí)驗(yàn)中G6046 轉(zhuǎn)化芍藥苷條件選用pH 9.0，溫度45℃。

圖4 G6046 在不同溫度下反應(yīng)曲線Fig. 4 G6046 reaction curves at different temperatures

2.3 芍藥苷轉(zhuǎn)化反應(yīng)結(jié)果

芍藥苷標(biāo)準(zhǔn)品液相色譜圖（圖5?A）中芍藥苷出峰時(shí)間為6.747 min；芍藥苷轉(zhuǎn)化酶G6046 與芍藥苷在原反應(yīng)條件（pH 8.0；25℃；酶-芍藥苷 = 1∶10，mg/mg）下反應(yīng)96 h 的液相色譜圖（圖5?B）中芍藥苷出峰時(shí)間為6.762 min。如圖5?B 結(jié)果顯示，芍藥苷的峰面積隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸降低，并隨之產(chǎn)生3 種新的物質(zhì)，且這3 種新物質(zhì)峰面積隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，出峰時(shí)間分別為2.963 min、4.247 min、10.684 min。由此可以說(shuō)明G6046 可以將芍藥苷轉(zhuǎn)化為3 種新的物質(zhì)，這3 種物質(zhì)在后續(xù)的研究中已經(jīng)得到了鑒定［27］。

圖5 芍藥苷和不同條件下芍藥苷轉(zhuǎn)化反應(yīng)后的HPLC 色譜圖Fig. 5 HPLC analysis of paeoniflorin and paeoniflorin after conversion reaction under different conditions

前2.2.1 得出最佳反應(yīng)pH 為9.0，在此pH 條件下，25℃，加入芍藥苷（酶-芍藥苷 = 1∶10，mg/mg）連續(xù)反應(yīng)48 h，結(jié)果如圖5?C 所示。由圖可知，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，芍藥苷的含量明顯的減少，3種反應(yīng)產(chǎn)物隨之明顯增多。與芍藥苷標(biāo)準(zhǔn)品（圖5?A）對(duì)比發(fā)現(xiàn)，在反應(yīng)48 h 后，反應(yīng)液中的芍藥苷幾乎被反應(yīng)完全。對(duì)比原反應(yīng)條件（圖5?B），轉(zhuǎn)化反應(yīng)速度得到了明顯的提高。

在2.2.2 中得到最適pH 和溫度條件下（pH 9.0；45℃），按酶-芍藥苷（1∶10，mg/mg）的比例加入芍藥苷進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)開(kāi)始的0 h 與反應(yīng)進(jìn)行到28 h 時(shí)得到HPLC 結(jié)果如圖5?D 所示。與芍藥苷標(biāo)準(zhǔn)品（圖5?A）對(duì)比可以看出，芍藥苷的含量明顯的減少，3 種產(chǎn)物含量明顯增加。并且在反應(yīng)28 h 后，反應(yīng)液中的芍藥苷已經(jīng)反應(yīng)完全。對(duì)比原反應(yīng)條件（圖5?B）和僅優(yōu)化pH 的反應(yīng)條件（圖5?C），轉(zhuǎn)化反應(yīng)速度得到進(jìn)一步提高。

在最適pH 和溫度條件下（pH 9.0；45℃）擴(kuò)大酶與芍藥苷的比例，由最初的酶-芍藥苷（1∶10，mg/mg）擴(kuò)大到酶-芍藥苷（1∶20，mg/mg），反應(yīng)36 h，取50 μL 反應(yīng)液處理后（處理方法同1.2.5）得到HPLC 色譜圖（圖6）。由圖6 可知，在反應(yīng)36 h 后反應(yīng)液中的芍藥苷已經(jīng)反應(yīng)完全，且仍可以生成同樣的3 種主要產(chǎn)物。證明在優(yōu)化后的反應(yīng)條件下，可以將G6046 與芍藥苷的比例擴(kuò)大到1∶20（mg/mg），適當(dāng)延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間仍可以反應(yīng)完全。因此本研究后續(xù)選用pH 9.0，45℃，G6046?芍藥苷（1∶20，mg/mg）進(jìn)行反應(yīng)，以期能夠獲得更多的反應(yīng)產(chǎn)物，以進(jìn)行下一步的產(chǎn)物純化及鑒定。反應(yīng)體系逐步擴(kuò)大如圖7 所示。

圖6 G6046 轉(zhuǎn)化芍藥苷36 h 后HPLC 檢測(cè)圖Fig. 6 HPLC analysis of 36 h conversion of paeoniflorin by G6046

圖7 G6046-芍藥苷反應(yīng)體系逐步放大示意圖Fig. 7 Schematic of G6046-paeoniflorin reaction system by step-by-step amplification

3 討論

本研究在確定了短刺小克銀漢霉中一個(gè)芍藥苷轉(zhuǎn)化酶G6046 的基礎(chǔ)上，對(duì)該酶基因中選定的功能片段進(jìn)行截取，再將目的基因G6046?NΔ82 和載體pET?22b 進(jìn)行連接，成功構(gòu)建了G6046?NΔ82?22b。為了進(jìn)一步探究G6046 截?cái)嗍欠窬哂猩炙庈盏霓D(zhuǎn)化活性以及對(duì)其酶活力的評(píng)估，必須選用合適的宿主來(lái)完成構(gòu)建載體的表達(dá)和純化。

3.1 芍藥苷轉(zhuǎn)化酶G6046的表達(dá)純化

大腸桿菌E. coli因?yàn)槠溥z傳背景清楚、培養(yǎng)成本低、生長(zhǎng)迅速等特點(diǎn)，成為如今最常用的外源重組蛋白表達(dá)的宿主［30-32］。而影響大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)率的主要因素有表達(dá)載體的選擇和合適表達(dá)蛋白質(zhì)的菌種的選擇。適用于蛋白質(zhì)表達(dá)的載體種類(lèi)繁多，應(yīng)用最多的是pET 系列，能在大腸桿菌中高效且高產(chǎn)表達(dá)蛋白，在誘導(dǎo)表達(dá)幾小時(shí)后，目標(biāo)蛋白產(chǎn)量可占總蛋白的50%以上。根據(jù)所使用表達(dá)載體的特點(diǎn)，目標(biāo)基因密碼子的組成等因素選擇特定的表達(dá)宿主菌，而B(niǎo)L?21 菌種缺乏內(nèi)生性蛋白酶ompT、ompP 和Lon protease，因此能防止產(chǎn)出的目標(biāo)蛋白質(zhì)被降解。本研究選用大腸桿菌作為宿主進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，利用pET 系列的載體，可以將外源目的基因克隆到載體中，轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21（DE3）中，可以獲得純度較高、具有一定產(chǎn)量的并且?guī)в? 個(gè)His 標(biāo)簽的蛋白，便于后續(xù)的純化［33-34］。通過(guò)前期的研究發(fā)現(xiàn)，重組的芍藥苷轉(zhuǎn)化酶誘導(dǎo)后以包涵體的形式表達(dá)，因此進(jìn)行了一系列的截?cái)嘣O(shè)計(jì)［27］，發(fā)現(xiàn)G6046?NΔ82?22b 可以表達(dá)一部分蛋白在上清液中。為了提高誘導(dǎo)表達(dá)的效率，本研究在不同誘導(dǎo)條件（誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)時(shí)間）下誘導(dǎo)目的蛋白折疊表達(dá)，結(jié)果可知，在溫度降低，時(shí)間延長(zhǎng)后，每克菌體產(chǎn)酶量呈遞增趨勢(shì)，在16℃，誘導(dǎo)24 h 條件下產(chǎn)酶量最高，達(dá)到5.34 mg/g。這是因?yàn)檩^高溫度下，雖然細(xì)菌的生長(zhǎng)速率較高，同時(shí)也會(huì)導(dǎo)致代謝產(chǎn)物積累，從而抑制細(xì)菌生長(zhǎng)和目的蛋白的表達(dá)。此外，低溫條件下，雖然不利于大腸桿菌的生長(zhǎng)，但是可以使蛋白的合成速率降低，在更溫和的條件下形成正確的折疊，促進(jìn)蛋白的可溶性表達(dá)，更有利于蛋白溶解在上清中。因此選用16℃，誘導(dǎo)24 h 來(lái)誘導(dǎo)目的蛋白的表達(dá)。

3.2 芍藥苷轉(zhuǎn)化酶G6046的最適酶活條件

酶特異性催化化學(xué)反應(yīng)的能力稱為該酶的酶活力，可以用在一定條件下，酶所催化其特異性化學(xué)反應(yīng)的速度來(lái)表示。因此，通常用單位時(shí)間內(nèi)底物的減少量或單一產(chǎn)物的增加量來(lái)表示酶反應(yīng)速度。酶催化反應(yīng)中，pH、溫度、離子強(qiáng)度、抑制劑、激活劑或酶本身的部分失活等都會(huì)對(duì)催化反應(yīng)造成影響。本研究克隆表達(dá)的是芍藥苷轉(zhuǎn)化酶的截?cái)啵贜 端截去了82 個(gè)氨基酸，因此首先考察截?cái)嗪蟊磉_(dá)出的酶是否具有活性，結(jié)果可知，芍藥苷的含量隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸降低，并伴隨3 種新產(chǎn)物的生成，且新生成產(chǎn)物的含量隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，由此可以說(shuō)明構(gòu)建的G6046 具有酶活性，可以將芍藥苷轉(zhuǎn)化為新的物質(zhì)。在這些影響酶活的因素中，pH 和溫度是對(duì)催化反應(yīng)影響較大的兩個(gè)因素［35-36］，因此在優(yōu)化G6046 催化芍藥苷轉(zhuǎn)化反應(yīng)中著重研究反應(yīng)液pH 和溫度對(duì)催化反應(yīng)速度的影響，主要從pH 和溫度兩個(gè)方面進(jìn)行優(yōu)化。在分別嘗試pH 7.0、8.0、9.0、10.0 后發(fā)現(xiàn)，G6046 在pH 9.0 的條件下酶活性最高，比酶活為4.22 U/mg。且優(yōu)化pH 后，芍藥苷轉(zhuǎn)化反應(yīng)可以在48 h 后基本反應(yīng)完全，對(duì)比原條件（圖5?B，pH 8.0；25℃；96 h）可以看出，底物利用率得到了有效的提高，并且反應(yīng)速度得到了明顯提升。優(yōu)化反應(yīng)液pH 后，進(jìn)而優(yōu)化了反應(yīng)溫度。挑選出6 組不同溫度，相同pH（9.0）進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)，在15℃、25℃、35℃、45℃、55℃、65℃的不同條件下，45℃時(shí)反應(yīng)最快，酶活性最高，比酶活為14.56 U/mg。對(duì)比原反應(yīng)條件和優(yōu)化pH 后的反應(yīng)結(jié)果，優(yōu)化pH 和溫度后，在28 h 后芍藥苷可以反應(yīng)完全，酶反應(yīng)速度得到了進(jìn)一步提高。

當(dāng)前，我國(guó)中草藥資源面臨日益緊缺的現(xiàn)狀，同時(shí)也面對(duì)藥材生物利用率低、浪費(fèi)嚴(yán)重等問(wèn)題。不僅限制了其臨床應(yīng)用，更是影響著我國(guó)中藥產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。本課題通過(guò)研究短刺小克銀漢霉中可以轉(zhuǎn)化芍藥苷的G6046 蛋白，將G6046 相關(guān)基因克隆并進(jìn)行外源蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)、優(yōu)化酶催化反應(yīng)條件以及擴(kuò)大酶反應(yīng)體系等，證實(shí)了G6046 蛋白確實(shí)可以將芍藥苷轉(zhuǎn)化為多種代謝產(chǎn)物，大大提高了芍藥苷的轉(zhuǎn)化效率，可能會(huì)提高芍藥苷的生物利用率；反應(yīng)體系的擴(kuò)大也為進(jìn)一步鑒定產(chǎn)物結(jié)構(gòu)和構(gòu)效關(guān)系研究提供了基礎(chǔ)。本研究可能為研究芍藥苷的微生物代謝提供了一條線索，為改善中草藥的生物利用度提供了新策略。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)對(duì)重組載體G6046?NΔ82?22b 在大腸桿菌BL21（DE3）中的轉(zhuǎn)化和誘導(dǎo)表達(dá)實(shí)現(xiàn)了芍藥苷轉(zhuǎn)化酶G6046 的表達(dá)和純化。通過(guò)優(yōu)化該轉(zhuǎn)化酶的酶促反應(yīng)的條件，發(fā)現(xiàn)pH 9.0，45℃條件下，酶活性最高，比酶活為14.56 U/mg，且底物可以反應(yīng)完全。通過(guò)擴(kuò)大酶反應(yīng)體系，將反應(yīng)規(guī)模從G6046?底物（1∶1；mg/mg）擴(kuò)大到G6046?底物（1∶20；mg/mg），使得轉(zhuǎn)化產(chǎn)物產(chǎn)量得到顯著提升，為分離芍藥苷轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，進(jìn)一步研究轉(zhuǎn)化產(chǎn)物結(jié)構(gòu)及芍藥苷在體內(nèi)的代謝機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。