基于SSR 標(biāo)記的廣東黃皮種質(zhì)資源遺傳多樣性分析及分子身份證構(gòu)建

陸育生 彭程 常曉曉 邱繼水 陳喆 陳慧瓊

（廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南亞熱帶果樹生物學(xué)與遺傳資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣東省熱帶亞熱帶果樹研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510640）

黃皮（Clausena lansium（Lour.）Skeels）屬蕓香科（Rutaceae）柑橘亞科（Aurantioideae）黃皮屬（ClausenaBurm. f.），是多年生小喬木、熱帶亞熱帶常綠果樹［1］，原產(chǎn)于我國南部，主要分布在廣東、廣西、福建、海南、云南以及我國臺灣等地［2］。黃皮果實(shí)外觀獨(dú)特，風(fēng)味酸甜可口，更具有止咳化痰、消暑健胃、抗氧化、抑腫瘤、防老年癡呆等功效［3-6］。近年來，荔枝（Litchi chinensisSonn.）、龍眼（Dimocarpus longanLour.）等大宗水果價(jià)格持續(xù)低迷，黃皮的售價(jià)相對喜人，給果農(nóng)帶來了較高的經(jīng)濟(jì)收益，栽培面積持續(xù)擴(kuò)大，已成為華南地區(qū)農(nóng)業(yè)供給側(cè)結(jié)構(gòu)性改革和實(shí)施鄉(xiāng)村振興戰(zhàn)略的重要經(jīng)濟(jì)樹種。廣東省是中國最重要的黃皮產(chǎn)區(qū)之一，種植面積和產(chǎn)量均居全國首位，其中，僅云浮市郁南縣栽培面積就超過1 萬hm2，占全國總面積一半以上，并建成我國首個(gè)黃皮現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)園，初步形成了涵蓋種植、加工、科技、流通、銷售、文旅、餐飲的全產(chǎn)業(yè)鏈條，所產(chǎn)果品成功走出國門，遠(yuǎn)銷北美、中東等國家（http://dara.gd.gov.cn/zfjy/content/post_3979099.html）。

但是黃皮作為小宗果樹，育種工作長期未受到足夠重視，導(dǎo)致目前主栽品種單一且口感不盡如人意，例如栽培面積最大的無核黃皮雖然可食率高，但風(fēng)味偏酸，無法滿足消費(fèi)者對高品質(zhì)水果的需求，而從城甜黃皮雖然口感偏甜，但缺乏風(fēng)味且易于引起膩感，同樣對消費(fèi)者的消費(fèi)熱情產(chǎn)生了不利影響。近年來，伴隨著消費(fèi)升級，消費(fèi)者對高品質(zhì)水果的需求日益高漲，黃皮品種的改良與創(chuàng)新已刻不容緩。廣東黃皮栽培歷史悠久，加之民間習(xí)慣屋前房后實(shí)生種植，經(jīng)過長期的自然變異和人工選擇，形成了豐富的種質(zhì)資源和各具特色的地方品種，可為黃皮遺傳改良和新品種培育提供廣闊的遺傳基礎(chǔ)。然而，由于黃皮為小宗果樹，種質(zhì)資源研究基礎(chǔ)薄弱，缺乏系統(tǒng)的分類鑒定，其龐大的種質(zhì)資源易造成種質(zhì)混亂。特別是隨著黃皮產(chǎn)業(yè)的不斷壯大，各地相互引種和種質(zhì)交流頻繁發(fā)生，導(dǎo)致“同名異物”或“同物異名”現(xiàn)象屢見不鮮。這不僅給黃皮種質(zhì)資源的保護(hù)、管理和開發(fā)利用帶來很大困難，而且也極大損害育種者和種植者的權(quán)益。因此，系統(tǒng)開展廣東黃皮種質(zhì)資源的遺傳多樣性和親緣關(guān)系研究，有利于準(zhǔn)確區(qū)分和鑒定黃皮種質(zhì)，對于黃皮產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展具有重要意義。

種質(zhì)資源鑒定評價(jià)的傳統(tǒng)手段是采用形態(tài)學(xué)標(biāo)記，其具有簡單和直觀的優(yōu)點(diǎn)，但其易受環(huán)境及植物生長發(fā)育狀態(tài)等因素的影響，而且誤差大、耗時(shí)、費(fèi)力，因而存在較大的局限性［7］。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，DNA 分子標(biāo)記作為新興的標(biāo)記技術(shù)，能很好地彌補(bǔ)形態(tài)標(biāo)記的不足，已被廣泛應(yīng)用于植物種質(zhì)資源鑒定研究。SSR（simple sequence repeat），又稱微衛(wèi)星DNA（microsatellites），是由1-6個(gè)核苷酸為重復(fù)單元組成的簡單串聯(lián)重復(fù)序列［8］，重復(fù)單元數(shù)量的差異造成了種質(zhì)資源間豐富的遺傳多態(tài)性。作為第二代分子標(biāo)記的代表，SSR 分子標(biāo)記具有技術(shù)簡便、多態(tài)性豐富、穩(wěn)定性高、重復(fù)性好、共顯性等優(yōu)點(diǎn)［9-10］，被國際植物新品種保護(hù)聯(lián)盟（International Union for the Protection of New Varieties of Plants, UPOV）確定為植物新品種保護(hù)應(yīng)用最廣泛的分子標(biāo)記體系［11］。

目前，SSR 標(biāo)記已廣泛應(yīng)用于蘋果（Malus pumilaMill.）［12-14］、梨（Pyrusspp.）［15-17］、桃（Prunus persica（L.）Batsch）［18-20］、 李（Prunus salicinaLindl.）［21］、板栗（Castanea mollissimaBlume）［22］、柑橘（Citrus reticulataBlanco）［23］、葡萄（Vitis vin?iferaL.）［24-25］、荔枝［26］、火龍果（Hylocereus undatu‘Foo?Lon’）［27］等果樹的遺傳多樣性分析、核心種質(zhì)篩選、遺傳圖譜構(gòu)建以及種質(zhì)鑒定等諸多領(lǐng)域，但關(guān)于SSR 標(biāo)記技術(shù)在黃皮種質(zhì)資源的多樣性分析和分子身份證構(gòu)建方面的研究尚未見報(bào)道。

本研究以農(nóng)業(yè)農(nóng)村部廣州黃皮種質(zhì)資源圃保存的84 份廣東黃皮種質(zhì)為材料，利用項(xiàng)目團(tuán)隊(duì)前期開發(fā)的12 對SSR 引物開展遺傳多樣性分析和分子身份證構(gòu)建，旨在揭示廣東黃皮種質(zhì)資源的遺傳多樣性水平及親緣關(guān)系，從而為黃皮種質(zhì)資源的合理保護(hù)和高效利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

參試的黃皮種質(zhì)資源共84 份，包括已審定的選育品種、具有一定種植規(guī)模的農(nóng)家品種以及從全省各地收集的地方種質(zhì)（實(shí)生單株）（表1），以上所有種質(zhì)資源均保存于廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所農(nóng)業(yè)農(nóng)村部廣州黃皮種質(zhì)資源圃內(nèi)。每份種質(zhì)材料選取新鮮健康的嫩葉1 g，液氮速凍后于?80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 84 份供試廣東黃皮種質(zhì)資源Table 1 84 germplasm resources of wampee in Guangdong province

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA 提取與檢測 采用高效植物基因組DNA 提取試劑盒（DP350，天根生化科技有限公司，中國北京）提取黃皮葉片基因組DNA，所得產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop 2000 微量紫外分光光度計(jì)（Thermo Scientific, USA）進(jìn)行DNA 質(zhì)量和濃度檢測，然后用滅菌ddH2O 將各樣品DNA濃度均稀釋至20 ng/μL 備用。

1.2.2 PCR 反應(yīng)及產(chǎn)物的毛細(xì)管電泳檢測 試驗(yàn)所用的SSR 引物為項(xiàng)目團(tuán)隊(duì)前期從黃皮轉(zhuǎn)錄組序列開發(fā)［28］獲得的12 對多態(tài)性引物（表2）。所有引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，在上游引物的5'端加1 個(gè)熒光素標(biāo)記（carboxyfluorescein,FAM）。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系20.0 μL，包括2× Taq PCR mix 10.0 μL、5 μmol/L 正、反向引物各1.0 μL、20 ng/μL DNA 模板1.0 μL 和ddH2O 7.0 μL。擴(kuò)增程序?yàn)?4℃ 3 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 60 s，35 個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min，4℃保存。PCR 產(chǎn)物稀釋10 倍，取1 μL 加入96 孔板中，再加入甲酰胺和分子量內(nèi)標(biāo)GeneScan 500 LIZ（Thermo Fisher Scientific,USA）混合液（9.5∶0.5，體積分?jǐn)?shù)）9 μL，95℃ 5 min，然后迅速冰上冷卻10 min，3 000 r/min 離心1 min，在ABI 3730 上進(jìn)行自動熒光檢測。

表2 供試SSR 引物信息Table 2 Information of SSR primers used in this study

1.2.3 數(shù)據(jù)處理與分析 電泳結(jié)束后，利用軟件GeneMapper 4.0 對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，獲得每對引物在不同樣品上的擴(kuò)增片段；采用Powermarker 3.25［29］和Popgene 32［30］計(jì)算等位基因數(shù)（Na）、有效等位基因數(shù)（Ne）、觀測雜合度（Ho）、期望雜合度（He）、多態(tài)性信息量指數(shù)（PIC）和Shannon信息指數(shù)（I）；使用Power Marker 3.25 計(jì)算各資源間的Nei's 遺傳距離，隨后基于非加權(quán)分組算術(shù)平均 法（unweighted pair?group method with arithmetic means, UPGMA）在FigTree 1.4.3 中構(gòu)建聚類樹；使用Structure 2.3.4［31］基于貝葉斯聚類方法分析黃皮種質(zhì)資源的群體結(jié)構(gòu)，設(shè)不作數(shù)迭代（length of burnin period）開始時(shí)的馬爾科夫鏈蒙特卡洛（MCMC）為10 000 次，不作數(shù)迭代后的MCMC（mumber of MCMC reps burnin）為100 000 次，采用混合祖先模型（admixture model）和等位變異發(fā)生頻率相關(guān)模型（allele frequency correlated model），群體數(shù)目（K）設(shè)為1-10，對每個(gè)K值模擬運(yùn)算10 次，運(yùn)算結(jié)果以Zip 格式進(jìn)行壓縮，提交給在線軟件Structure harvester（http://taylor0.biology.ucla.edu/struct_harvest/），以判斷群體的Clusters 數(shù)（即最可能的K值）。

1.2.4 分子身份證構(gòu)建 根據(jù)12 對引物在各樣品中擴(kuò)增的帶型，按分子量將條帶從小到大排序，每一種帶型用個(gè)位阿拉伯?dāng)?shù)字1-9 編碼表示，帶型數(shù)超過9 的用小寫英文字母a-z 依次表示，將每個(gè)樣品在12 對引物上的擴(kuò)增帶型數(shù)據(jù)串聯(lián)起來，即得到每個(gè)樣品以12 位數(shù)字或字母表示的分子身份證。

2 結(jié)果

2.1 廣東黃皮種質(zhì)資源SSR位點(diǎn)多態(tài)性分析

利用12 對SSR 引物對84 份廣東黃皮種質(zhì)資源進(jìn)行擴(kuò)增和熒光毛細(xì)管電泳檢測，并計(jì)算獲得各遺傳多樣性參數(shù)（表3）。12 個(gè)SSR 位點(diǎn)共檢測到43 個(gè)等位基因（Na），每對引物檢測到的等位基因?yàn)?-6 個(gè)，平均等位基因3.583 個(gè)。有效等位基因（Ne）為1.416-2.984，平均值為2.187。觀測雜合度（Ho）和期望雜合度（He）變化范圍分別為0.265（CP006）-0.675（CP010）和0.294（CP006）-0.665（CP007），平均值分別為0.497 和0.524。Shannon 信息指數(shù)（I）變化范圍為0.567（CP006）-1.096（CP006），平均I為0.913。各引物的多態(tài)性信息含量（PIC）分布范圍為0.291-0.642，平均PIC值為0.484，其中CP010 最大，CP006 最小。12 個(gè)SSR 位點(diǎn)的PIC值均大于0.25，其中6 個(gè)位點(diǎn)的PIC值大于0.50。

表3 12 對SSR 引物的遺傳多樣性Table 3 Genetic diversity at 12 pairs of SSR markers

2.2 聚類分析

根據(jù)12 對SSR 引物的擴(kuò)增結(jié)果，利用Power Marker 軟件對84 份廣東黃皮種質(zhì)資源進(jìn)行基于UPGMA 方法的聚類分析。結(jié)果（圖1，表4）表明，全部資源可以劃分為6 個(gè)類群，第I 類群包含13 份種質(zhì)，除了‘陽山雞心’外，其他種質(zhì)均來自廣東西部地區(qū)的湛江和云浮。第II 類群包含8 份種質(zhì)，均來自廣東東部地區(qū)的梅州和潮汕。第III 類群包含11 份種質(zhì)，除了‘陽山大葉’‘連南2 號’‘連南3號’‘龍門9 號’外，其他種質(zhì)均來自廣東西部地區(qū)的云浮和陽江。第IV 類群包含6 份種質(zhì)，除了‘始興032’外，其他種質(zhì)均來自廣東中部地區(qū)的惠州。第V 類和第VI 類為培育品種和農(nóng)家品種，來源地分散在廣東各地，其中，第V 類包含30 份種質(zhì)，除‘番禺甜皮’‘白糖黃皮’‘蘿崗獨(dú)核’‘小果甜皮’‘塔下甜皮’外，其他均為雞心黃皮類，特征是果實(shí)均為圓卵形或橢圓形、肉質(zhì)細(xì)嫩、風(fēng)味甜酸適中?！敝?1 號’‘從城雞心’‘雞心5 號’‘揭陽雞心’完全聚在一起，推測這4 份種質(zhì)為同物異名種質(zhì)。第VI 類群包含16 份種質(zhì)，除‘龍門1 號’‘龍門10 號’‘龍門8 號’外，其他均為甜黃皮類，特征表現(xiàn)為果皮淺黃色、肉質(zhì)脆嫩、風(fēng)味清甜、無酸味。

圖1 基于SSR 標(biāo)記的84 份種質(zhì)資源聚類圖Fig. 1 Cluster diagram of 84 wampee germplasm resources based on SSR markers

2.3 遺傳結(jié)構(gòu)分析

進(jìn)一步利用structure 軟件構(gòu)建廣東黃皮種質(zhì)資源的群體居群遺傳結(jié)構(gòu)圖，結(jié)果顯示，84 份種質(zhì)在K=2 時(shí)，ΔK有最大值（圖2），此時(shí)84 個(gè)樣本可分為2 個(gè)亞群（圖3）。亞群A 包含39 份資源，除了來自云浮的‘區(qū)根甜皮’、廣州的‘祿田獨(dú)核’和惠州的‘龍門10 號’等農(nóng)家品種外，其他種質(zhì)均為來源于全省各地的地方種質(zhì)；亞群B 包含45 份資源，除了地方種質(zhì)‘始興032’和‘龍門7 號’外，其他種質(zhì)均為選育品種和農(nóng)家品種，結(jié)果與UPGMA聚類分析結(jié)果一致。84 份材料中有79 份材料在某一類群的同系得分（Q 值）>0.6，占94.05%，表明供試的黃皮種質(zhì)遺傳結(jié)構(gòu)較為簡單，但群體間仍有少量種質(zhì)混雜，存在相互的基因滲透。

圖3 K=2 時(shí)基于SSR 標(biāo)記的84 份黃皮種質(zhì)群體遺傳結(jié)構(gòu)Fig. 3 Genetic structure of 84 wampee germplasm and population at K=2 based on SSR markers

2.4 分子身份證構(gòu)建

按表3 引物的順序?qū)⑺幸镌跇悠分袛U(kuò)增出來的基因型（帶型）的分子量大小進(jìn)行賦值排序（表5），串聯(lián)排列后獲得供試84 份黃皮資源的分子身份證代碼（表6），在同一位置代碼相同則表示基因型相同。其中，推測為同一種質(zhì)的‘潮州11 號’‘從城雞心’‘雞心5 號’‘揭陽雞心’具有相同的分子身份代碼，其余種質(zhì)均具有專屬的分子身份代碼。

表5 12 對SSR 引物的擴(kuò)增帶型編號Table 5 Amplified band codes of 12 pairs SSR primers

3 討論

遺傳多樣性是生命系統(tǒng)的基本特征，是物種適應(yīng)自然和發(fā)生進(jìn)化的產(chǎn)物，開展遺傳多樣性分析對種質(zhì)資源的有效保護(hù)、開發(fā)和利用具有重要意義。目前，關(guān)于DNA 分子標(biāo)記在黃皮種質(zhì)資源遺傳多樣性分析中的應(yīng)用僅有少數(shù)報(bào)道，劉小梅等［32］利用10 對RAPD（random amplified polymorphic DNA）標(biāo)記對來自廣東、廣西和海南的36 份材料進(jìn)行研究，結(jié)果表明上述黃皮種質(zhì)間的親緣關(guān)系較近。李開拓等［33］利用15 對ISSR（inter?simple sequence repeat）引物對來源于福建、廣東和廣西的40 個(gè)黃皮品種（品系）進(jìn)行遺傳多樣性分析，結(jié)果也表明黃皮品種（品系）間的遺傳相似性較大。本研究在前期基于轉(zhuǎn)錄組序列的黃皮SSR 標(biāo)記挖掘的基礎(chǔ)上［28］，首次利用12 對SSR 熒光引物對來源于廣東的84 份黃皮種質(zhì)資源進(jìn)行基因分型和遺傳多樣性分析。多態(tài)性信息含量（PIC）和期望雜合度（He）是衡量種群遺傳多樣性的重要指標(biāo)，PIC反映SSR 位點(diǎn)的變異程度，當(dāng)PIC≥0.5 時(shí)表示位點(diǎn)具有高度多態(tài)性，當(dāng)0.25

根據(jù)SSR 分型數(shù)據(jù)，采用UPGMA 方法進(jìn)行聚類分析。結(jié)果表明，供試的84 份廣東黃皮種質(zhì)資源可分為6 個(gè)類群，第I-IV 類群為地方種質(zhì)，其中，第I 和第III 類群大部分種質(zhì)來自廣東西部地區(qū)，第II 類群主要來自廣東東部地區(qū)，第IV 類群主要來自廣東中部地區(qū)；而第V 類和第VI 類則為具有一定栽培規(guī)模的培育品種和農(nóng)家品種，來源分布于廣東各地。可見，基于UPGMA 的聚類結(jié)果與地理分布有一定關(guān)聯(lián)，但并沒有嚴(yán)格按照材料的地理來源進(jìn)行聚類。關(guān)于黃皮種質(zhì)資源的分類目前尚未有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，傳統(tǒng)習(xí)慣按單一形態(tài)或園藝性狀進(jìn)行簡單分類，如按果實(shí)風(fēng)味分為甜黃皮和酸黃皮，按果實(shí)形狀分為雞心黃皮、圓果黃皮、牛心黃皮、梨形黃皮，按種子的多少分為有核黃皮和無核黃皮等［32］。本研究結(jié)果表明，基于SSR 的分類與傳統(tǒng)形態(tài)分類具有一定的相關(guān)性，如第V 類群中大部分種質(zhì)為雞心黃皮類種質(zhì)，其主要特征是果實(shí)均為圓卵形或橢圓形，肉質(zhì)細(xì)嫩、風(fēng)味甜酸適中；而第VI 類群主要為甜黃皮類，形態(tài)特征是果皮淺黃色、肉質(zhì)脆嫩、風(fēng)味清甜、無酸味。然而傳統(tǒng)形態(tài)分類范圍過寬，且性狀評價(jià)容易受主觀和環(huán)境因素干擾，難以準(zhǔn)確反映種質(zhì)資源間的親緣進(jìn)化關(guān)系；與之相比，基于SSR 的分類是從DNA 水平揭示種質(zhì)資源間的差異，能更全面、準(zhǔn)確地反映種質(zhì)間的親緣關(guān)系，其結(jié)果更加嚴(yán)謹(jǐn)、可靠。

分子身份證是在DNA 指紋圖譜的基礎(chǔ)上，采用一定編碼規(guī)則對電泳圖譜進(jìn)行數(shù)字化處理，從而獲得字符串形式表示的身份代碼；其克服了指紋圖譜人工比對的繁瑣、低效等問題，能簡單、直觀地區(qū)分不同種質(zhì)，被廣泛應(yīng)用于種質(zhì)資源鑒定和品種識別。目前，基于SSR 標(biāo)記技術(shù)已成功構(gòu)建了葡萄［24］、蘋果［35］、梨［36］、火龍果［27］、山楂［7］等多種果樹種質(zhì)資源的分子身份證。本研究利用12 對SSR 熒光引物對84 份黃皮種質(zhì)進(jìn)行擴(kuò)增，獲得指紋圖譜，并采用基因型賦值的方式編碼，得到了供試材料的分子身份證。除了推測為同一種質(zhì)的‘潮州11 號’‘從城雞心’‘雞心5 號’‘揭陽雞心’外，其余種質(zhì)均具有唯一的分子身份證，可被有效區(qū)分，表明SSR標(biāo)記技術(shù)作為一種有效的技術(shù)手段，可用于黃皮種質(zhì)資源的分子身份證構(gòu)建。

4 結(jié)論

廣東黃皮種質(zhì)資源具有較為豐富的遺傳多樣性，基于UPGMA 方法可將供試材料分為6 個(gè)類群，與傳統(tǒng)形態(tài)分類相比，SSR 聚類結(jié)果更嚴(yán)格、準(zhǔn)確；基于12 對SSR 引物的分型結(jié)果，采用數(shù)字加英文字母的編碼方式，成功構(gòu)建黃皮種質(zhì)資源的分子身份證。