菠菜PSY 基因家族的鑒定與表達(dá)分析

任麗 喬舒婷 葛晨輝 魏梓桐 徐晨曦

（1. 上海師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海 200234；2. 上海師范大學(xué)植物種質(zhì)資源開發(fā)協(xié)同創(chuàng)新中心，上海 200234）

類胡蘿卜素（carotenoids）是一類重要的天然色素的總稱，由所有光合生物（包括植物、細(xì)菌、藻類）和一些非光合細(xì)菌、真菌合成［1-2］，是天然產(chǎn)物中最大的家族之一，迄今已分類出850 多種不同的化合物［3］。植物中，類胡蘿卜素存在于各種類型的質(zhì)體內(nèi)，可使植物的花、果實(shí)或根部呈現(xiàn)出鮮艷的色彩［4］。在葉綠體富集的組織中，類胡蘿卜素可以作為光合作用的輔助色素，擴(kuò)大光吸收范圍，并能通過能量淬滅和自由基排除來使植物細(xì)胞免受光氧化和熱應(yīng)激的損傷［5-7］，對植物的生長和發(fā)育具有調(diào)節(jié)作用。此外，類胡蘿卜素還為植物重要激素脫落酸（ABA）和獨(dú)腳金內(nèi)酯（SL）的生物合成提供前體［8-9］。對人體健康來說，類胡蘿卜素及其分解代謝產(chǎn)物是人類飲食中不可或缺的組成部分，可在人體內(nèi)轉(zhuǎn)化為人體所必需的維生素A，有助于降低與衰老相關(guān)的疾病風(fēng)險(xiǎn)［10］。但是人類自身無法合成類胡蘿卜素，需要通過食物攝取和轉(zhuǎn)化來獲得［11］。常見的膳食類胡蘿卜素有α-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素、β-隱黃質(zhì)、葉黃素、番茄紅素和玉米黃質(zhì)等。菠菜和羽衣甘藍(lán)（Brassica oleraceaL. var.acephalaD.C.）等深綠色葉菜類蔬菜的葉黃素和玉米黃質(zhì)含量最高，每克預(yù)制食品可含有75-150 μg［12］。

菠菜（Spinacia oleraceaL.）是莧科藜亞科菠菜屬一年生草本植物，是世界重要的綠葉菜類蔬菜作物之一，主要種植于中國、美國、土耳其和日本，其中中國產(chǎn)量占世界的91%。菠菜營養(yǎng)豐富，味道鮮美，是綠葉菜中類胡蘿卜素含量最高的蔬菜［13］。不同菠菜種質(zhì)資源間，類胡蘿卜素含量存在顯著差異［14］。

類胡蘿卜素幾乎在所有的質(zhì)體中都是從頭合成的，在植物細(xì)胞的葉綠體和有色體中含量豐富［4］。植物中，類胡蘿卜素的酶促反應(yīng)發(fā)生在質(zhì)體膜上，并由核編碼酶介導(dǎo)［15］。該合成途徑首先是由異戊烯焦磷酸（IPP）和二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP）在牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合酶（GGPPS）催化下縮合形成牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸（GGPP）［16］。GGPP 在八氫番茄紅素合酶（PSY）的催化下生成無色的15?順式八氫番茄紅素，這一步驟是類胡蘿卜素生物合成的主要限速步驟［17］。15?順式八氫番茄紅素進(jìn)而在八氫番茄紅素脫氫酶（PDS）、ζ-胡蘿卜素異構(gòu)酶（Z?ISO）、ζ-胡蘿卜素脫氫酶（ZDS）和類胡蘿卜素異構(gòu)酶（CRTISO）的連續(xù)修飾下形成全反式番茄紅素，接著全反式番茄紅素通過1 個(gè)或2 個(gè)環(huán)化酶催化為β-胡蘿卜素或α-胡蘿卜素［18］。隨后在羥化酶和環(huán)氧酶的羥基化和環(huán)氧化作用下產(chǎn)生葉黃素和玉米黃質(zhì)［19］。而玉米黃質(zhì)在玉米黃質(zhì)環(huán)氧化酶（ZEP）催化下生成了紫黃質(zhì)［20］。

PSY 是一類小家族基因，除了在部分藻類（綠藻和微胞藻）中存在PSY I 和PSY II 兩個(gè)家族外，其他藻類和高等植物中僅保留了PSY I 家族［21］。大多數(shù)植物中含有2-3 個(gè)旁系同源基因，但模式植物擬南芥（Arabidopsis thalianaL.）［22］中只有1 個(gè)PSY基因，水稻（Oryza sativaL.）［23］、玉米（Zea maysL.）［24］、番茄（Solanum LycopersicumL.）［25］和小麥（Triticum aestivumL.）［26］中均含有3 個(gè)PSY 基因，而菠菜中共鑒定出4 個(gè)PSY 基因。盡管已經(jīng)對很多植物的PSY 基因進(jìn)行了相關(guān)研究，但菠菜PSY 基因研究卻少有報(bào)道，本研究為后續(xù)對菠菜PSY 基因功能特性的深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗(yàn)所用菠菜‘KS4’‘US362’均為上海師范大學(xué)植物種質(zhì)資源開發(fā)中心保存的自交系材料，其中‘KS4’為類胡蘿卜素高積累型栽培種材料，‘US362’為類胡蘿卜素低積累型野生種材料。菠菜種子經(jīng)過浸種1 d 后，播于72 孔育苗穴盤中，培養(yǎng)基質(zhì)為草炭土與珍珠巖等比例混合。置于人工氣候室培養(yǎng)，光照9 h，黑暗15 h，溫度約為20℃，濕度約為70%。播種后30 d 將菠菜幼苗移栽入塑料花盆中，六葉一心期時(shí)進(jìn)行不同處理。

1.2 方法

1.2.1 菠菜PSY 基因家族的鑒定 從擬南芥（Arabidopsis thaliana）、 甜菜（Beta vulgaris） 和煙草（Nicotiana tabacum）基因組數(shù)據(jù)庫中獲得該物種類胡蘿卜素合成代謝相關(guān)基因的序列，在菠菜（Spinacia olerace）基因組數(shù)據(jù)庫（http://www.spinachbase.org/）中進(jìn)行全基因組 BLAST 分析得到菠菜類胡蘿卜素合成代謝相關(guān)蛋白的同源基因序列。結(jié) 合SMART（http://smart.embl heidelberg.de/） 和PROSITE（https://prosite.expasy.org/）的保守結(jié)構(gòu)域基序分析，從菠菜基因組中鑒定獲得菠菜PSY 候選基因。利用ProtParam 在線軟件（https://web.expasy.org/protparam/）估算菠菜PSY 蛋白序列的分子量（Mw）、理論等電點(diǎn)（pI）、GRAVY 和不穩(wěn)定性指數(shù)。通過Wolfpsort 在線工具（https://wolfpsort.hgc.jp/）進(jìn)行PSY 蛋白的亞細(xì)胞定位預(yù)測。

1.2.2 菠菜PSY 基因保守結(jié)構(gòu)域、保守基序及基因結(jié)構(gòu)分析 依據(jù)菠菜數(shù)據(jù)庫SpinachBase（http://www.spinachbase.org/）中的基因組序列和注釋信息，通過GSDS 2.0 在線網(wǎng)站（http://gsds.gao?lab. org/）對PSY 基因的內(nèi)含子、外顯子及保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行可視化分析。利用NCBI 數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）獲取擬南芥、甜菜、番茄和水稻PSY 基因的蛋白序列，并通過在線網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器MEME（https://meme?suite.org/meme/tools/meme）識別PSY 蛋白中所包含的保守基序。

1.2.3 多序列比對和系統(tǒng)發(fā)育分析 使用ClustalX v.1.83（默認(rèn)參數(shù)）對菠菜、甜菜、擬南芥、番茄、水稻5 個(gè)物種PSY 蛋白序列進(jìn)行多重序列比較，使用MEGA 7 將比對后的序列構(gòu)建NJ 樹，步長檢驗(yàn)值設(shè)為1 000，之后導(dǎo)出進(jìn)化樹文件，利用TBtools 軟件進(jìn)行繪制。

1.2.4 菠菜PSY 基因順式作用元件預(yù)測 利用TBtools 軟件從基因組數(shù)據(jù)中提取菠菜PSY 基因起始密碼子上游2 000 bp 的序列，并使用PlantCARE數(shù) 據(jù) 庫（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）對得到的序列進(jìn)行順式作用元件預(yù)測，預(yù)測結(jié)果通過TBtools 進(jìn)行可視化。

1.2.5 菠菜總類胡蘿卜素含量測定 在菠菜六葉一心期時(shí)，連帶葉柄2 cm 處剪下其第二和第三對真葉，使用冷凍干燥機(jī)（?20℃，10 Pa）凍干處理，48 h 后取出樣品密封放置在?80℃冰箱中保存待測。將樣品加液氮磨至粉碎后取1.0 g 干樣粉末，加入10 mL丙酮沒過樣品，水浴超聲15 min；冷凍離心10 min，過濾收集上清液，反復(fù)提取至樣品無色；合并所有上清液，35℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)；以1 mL 甲醇溶解，過0.22μm 濾膜，進(jìn)行HPLC 檢測。每個(gè)樣品3 次重復(fù)，上述過程在暗環(huán)境中進(jìn)行。

1.2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 分析和相關(guān)性分析 采取菠菜根、莖、葉、葉柄、薹葉、薹葉柄6 個(gè)組織部位的材料，使用TRIzol 法提取菠菜各個(gè)組織的RNA。利用TaKaRa PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）試劑盒將提取的RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA，于?20℃保存?zhèn)溆?。使用DBI?Bioscience BestarTMqPCR Master Mix（SYBR Green）試劑盒在Applied Biosystems 7500 Real Time PCR 儀器上進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。定量引物通過NCBI網(wǎng)站設(shè)計(jì)后，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成（表1）。以菠菜18S為內(nèi)參，以2-ΔΔCt法計(jì)算基因相對表達(dá)量，使用Excel、GraphPad Prism 8.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和作圖。將播種后30 d 的菠菜幼苗為供試材料，以白光為對照組，不同比例的紅藍(lán)光R1B3 和R3B1 為處理組，分別取處理24 h 和12d 的葉片提取RNA 并進(jìn)行基因相對表達(dá)分析，方法同上。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 引物Table 1 Primers used for quantitative real-time PCR

2 結(jié)果

2.1 菠菜PSY基因家族鑒定及理化性質(zhì)分析

本研究從菠菜基因組中共鑒定出4 個(gè)編碼PSY蛋白保守結(jié)構(gòu)域的基因, 其蛋白的理化性質(zhì)分析結(jié)果如表2 所示，菠菜PSY 蛋白的氨基酸數(shù)在351-418 之間, 相對分子質(zhì)量范圍為40-47 kD，理論等電點(diǎn)8.89-9.17。PSY 蛋白總平均疏水性為負(fù)值，屬親水性蛋白。通過對菠菜PSY 蛋白的亞細(xì)胞定位預(yù)測發(fā)現(xiàn)，4 個(gè)PSY 均定位于葉綠體。

表2 菠菜PSY 基因家族的鑒定及理化性質(zhì)Table 2 Identification and characteristic features of PSY gene family in spinach

2.2 菠菜PSY基因結(jié)構(gòu)及蛋白保守基序

菠菜PSY 基因家族不同成員的基因結(jié)構(gòu)具有差異性（圖1）。利用GSDS 2.0 在線工具進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)分析表明，除PSY3基因具有5 個(gè)外顯子外，其他3個(gè)基因具有6 個(gè)外顯子結(jié)構(gòu)，外顯子長度介于50-426 bp；內(nèi)含子長度變化與外顯子相似，介于79-514 bp。

圖1 菠菜PSY 基因結(jié)構(gòu)分析Fig. 1 Gene structure analysis of PSY in spinach

SQS_PSY 是PSY 和角鯊烯合酶（squalene syn?thase, SQS）共有的保守結(jié)構(gòu)域。由保守結(jié)構(gòu)域分析可知（圖2），菠菜PSY 均含有SQS_PSY 保守結(jié)構(gòu)域。保守基序結(jié)果顯示（圖2），菠菜PSY 家族成員至少具有6 個(gè)Motif 基序。SoPSY1 和SoPSY2 的保守基序一致，SoPSY4 的保守基序相比較于SoPSY1、SoPSY2 和SoPSY3，缺少了Motif 5。Motif1、2、3、4、5、6 組成了菠菜PSY 基因家族的典型保守區(qū)域，其中Motif 2 具有活性位點(diǎn)DXXXD（DELVD），并且該結(jié)構(gòu)域在4 個(gè)PSY 蛋白中高度保守。

2.3 菠菜PSY基因家族系統(tǒng)進(jìn)化分析

將鑒定到的4 個(gè)菠菜 PSY 蛋白序列，以及通過NCBI 數(shù)據(jù)庫獲取的PSY 同源基因AtPSY（AAA32836）、OsPSY1（AAS18307）、OsPSY2（AK073290）、OsPSY3（DQ356431）、SlPSY1（ABM45873）、SlPSY2（ABU40771）、SlPSY3（XP_004228928.1）、BvPSY（XP_ 010675231.1） 和BvPSY（KMT13325.1）的蛋白序列，以鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，進(jìn)一步探究菠菜和模式植物間PSY 蛋白的進(jìn)化關(guān)系。結(jié)果（圖2）表明，水稻PSY2 和PSY3 的進(jìn)化分支與其他雙子葉植物平行演化，但水稻PSY1 與雙子葉植物聚為一支；番茄PSY1 和PSY2 保守的聚為一支，菠菜PSY1 和PSY2 與同為莧科的甜菜聚為一支但二者遺傳距離更近；番茄PSY3、菠菜PSY3 和PSY4 形成相對獨(dú)立的進(jìn)化分支。

2.4 啟動(dòng)子順式作用元件預(yù)測

為分析菠菜PSY 基因的上游調(diào)控因子，提取4個(gè)SoPSY 基因起始密碼子上游2 000 bp 的基因組序列，并利用PlantCARE 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行順式作用元件查詢。結(jié)果（圖3）表明，菠菜PSY 基因含有多種環(huán)境和激素響應(yīng)相關(guān)元件，其中參與光響應(yīng)的順式調(diào)控元件和脫落酸響應(yīng)元件最多。除SoPSY3僅含有5個(gè)光響應(yīng)元件外，其余3 個(gè)PSY 基因啟動(dòng)子序列均含有13-15 個(gè)光響應(yīng)元件，如G?Box、Box 4、GT1?motif 和LAMP?element 等，表明該基因可能受光誘導(dǎo)表達(dá)或調(diào)控。此外，在PSY 基因啟動(dòng)子序列中還鑒定出一些低溫脅迫調(diào)控元件LTR、與干旱脅迫相關(guān)的MBS 作用元件和厭氧誘導(dǎo)必需順式作用元件ARE，表明該基因參與的生理變化影響菠菜非生物脅迫的響應(yīng)。

圖3 菠菜PSY 基因啟動(dòng)子區(qū)域順式調(diào)節(jié)元件分析Fig. 3 Characterization of cis-acting regulatory elements in the promoter region of spinach PSY genes

2.5 菠菜PSY基因組織特異性分析

為進(jìn)一步分析SoPSY 基因的生物學(xué)功能，利用RT?qPCR 檢測方法，在菠菜不同組織中檢測SoPSY基因的表達(dá)水平。結(jié)果（圖4）顯示，菠菜PSY 在地上部和地下部組織器官中表達(dá)水平具有顯著的差異，SoPSY4在根中高水平表達(dá)，顯著高于地上部分各組織器官；其余3 個(gè)PSY 基因在葉片中高水平表達(dá)，營養(yǎng)葉和薹葉中表達(dá)最高，其次是薹葉柄、短縮莖和葉柄，在根中表達(dá)量最低。此外，4 個(gè)基因中SoPSY2葉的相對表達(dá)量最高，約是其余基因葉的1.2-45 倍；SoPSY3薹葉的相對表達(dá)量最高，約是其余基因薹葉的1.7-57 倍。

2.6 菠菜PSY基因響應(yīng)紅藍(lán)光比例變化的表達(dá)模式分析

基于PSY 啟動(dòng)子中分布的大量光響應(yīng)元件，為進(jìn)一步分析PSY 基因可能的生物學(xué)功能，以白光為對照組，不同比例的LED 紅藍(lán)光R1B3 和R3B1 處理的菠菜幼苗葉片為供試材料，利用RT?qPCR 方法，檢測野生型材料‘US362’和栽培型材料‘KS4’中SoPSY 響應(yīng)不同光質(zhì)處理的表達(dá)水平變化。結(jié)果表明（圖5，圖6），不同基因型菠菜中，不同SoPSY 基因響應(yīng)紅藍(lán)光比例變化的表達(dá)模式具有差異性。

圖5 紅藍(lán)光處理對‘US362’菠菜PSY 基因表達(dá)特性的影響Fig. 5 Effects of red and blue light treatment on the expression characteristics of PSY genes in ‘US362’ spinach

圖6 紅藍(lán)光處理對‘KS4’菠菜PSY 基因表達(dá)特性的影響Fig. 6 Effects of red and blue light treatment on the expression characteristics of PSY gene in ‘KS4’ spinach

在野生類型菠菜中（圖5），處理24 h 和12 d，SoPSY1和SoPSY2基因響應(yīng)不同紅/藍(lán)光的表達(dá)模式一致，SoPSY3在24 h 處理下，受紅/藍(lán)光誘導(dǎo)表達(dá)顯著下調(diào)，但R3B1 和R1B3 處理組間表達(dá)水平無顯著差異；12 d 處理?xiàng)l件下，SoPSY3受R1B3 誘導(dǎo)表達(dá)顯著上調(diào)，R3B1 使其表達(dá)水平顯著低于白光對照組。SoPSY4在紅/藍(lán)光處理24 h 時(shí)與SoPSY3的表達(dá)模式相似，但各處理?xiàng)l件下SoPSY4的表達(dá)水平無顯著差異；與SoPSY3不同，處理12 d 時(shí)SoPSY4的表達(dá)水平受R3B1 誘導(dǎo)顯著上調(diào)表達(dá)，而R3B1 處理使其表達(dá)水平顯著低于對照組。

在栽培型菠菜‘KS4’中（圖6），紅藍(lán)光處理24 h 下，處理組SoPSY3和SoPSY4基因的表達(dá)水平均不同程度低于對照組，且R3B1 處理下的表達(dá)量低于R1B3 處理組；相反，SoPSY1和SoPSY2基因與對照組相比表達(dá)上調(diào)。處理12 d 時(shí)，4 個(gè)基因的表達(dá)呈現(xiàn)不同的響應(yīng)模式，經(jīng)紅/藍(lán)光誘導(dǎo)后，SoPSY2和SoPSY3基因的表達(dá)量顯著升高且處理組間表達(dá)水平具有顯著差異；SoPSY4相比白光表達(dá)下調(diào)，而SoPSY1的表達(dá)水平與對照相比無明顯變化。上述結(jié)果表明，菠菜PSY 不同的表達(dá)模式可能與其基因啟動(dòng)子區(qū)域中存在不同的光反應(yīng)元件有關(guān)。

2.7 光質(zhì)處理下菠菜類胡蘿卜素積累與PSY基因表達(dá)分析

為進(jìn)一步探究菠菜PSY 基因表達(dá)量與類胡蘿卜素積累的關(guān)系，對不同比例的LED 紅藍(lán)光R1B3、R3B1 處理24 h 和12 d 的菠菜幼苗葉片分別進(jìn)行總類胡蘿卜素含量的測定。結(jié)果（圖7）顯示。處理24 h 后，野生型與栽培型菠菜響應(yīng)紅藍(lán)光比例變化的總類胡蘿卜素含量均顯著低于白光對照。不同之處在于，‘US362’受R1B3 誘導(dǎo)的總含量低于R3B1處理下的含量；而‘KS4’中相反，處理組R3B1 的總類胡蘿卜素含量顯著低于處理組R1B3 的含量。結(jié)果表明，24 h 短時(shí)間處理對‘US362’和‘KS4’總類胡蘿卜素的積累影響大，不同基因型材料的類胡蘿卜素積累對紅藍(lán)光比例的敏感性不同。紅/藍(lán)光處理12 d 后，KS4 菠菜對照組總類胡蘿卜素的含量為299.79 μg/g DW，分別是處理組R1B3、R3B1的2.21 倍和1.86 倍；在‘US362’中，R1B3、R3B1處理對其含量均未產(chǎn)生顯著性影響。結(jié)果表明，在12 d 長時(shí)間處理下，植物材料中光條件影響的類胡蘿卜素積累趨于穩(wěn)定，栽培型菠菜‘KS4’受光條件影響的類胡蘿卜素積累變化趨勢與野生類型菠菜‘US362’不同。

圖7 紅藍(lán)光處理下菠菜總類胡蘿卜素含量變化Fig. 7 Changes of total carotenoid content in spinach under red and blue light treatment

利用不同比例的LED 紅藍(lán)光R1B3、R3B1 處理后類胡蘿卜素含量的變化與4 個(gè)SoPSY 基因的相對表達(dá)水平作相關(guān)性分析（表3）。處理24 h 后，野生類型菠菜‘US362’的R1B3 處理組總類胡蘿卜含量的下降與SoPSY2和SoPSY3基因相對表達(dá)水平正相關(guān)，R3B1 處理組總類胡蘿卜含量的下降與SoPSY1基因相對表達(dá)水平呈顯著負(fù)相關(guān)，與SoPSY3正相關(guān)。處理12 d 后總類胡蘿卜素含量趨于穩(wěn)定，野生類型菠菜‘US362’中各試驗(yàn)組間的總類胡蘿卜素含量差異不顯著，R1B3 處理組SoPSY2、SoPSY3和SoPSY4基因相對表達(dá)水平與含量變化正相關(guān)，其中SoPSY2呈顯著正相關(guān)，R3B1 處理組總類胡蘿卜含量變化與SoPSY1和SoPSY3基因相對表達(dá)水平負(fù)相關(guān)；栽培型菠菜‘KS4’中，R1B3 和R3B1 處理組的總類胡蘿卜素含量顯著低于白光對照組，R1B3 處理組SoPSY1和SoPSY2基因相對表達(dá)水平與含量變化呈正相關(guān)，R3B1 處理組含量變化與SoPSY1相對表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)。上述結(jié)果表明，SoPSY1、SoPSY2和SoPSY3基因的相對表達(dá)水平與處理組總類胡蘿卜素含量變化的相關(guān)性極強(qiáng)，這與它們均具有綠色組織表達(dá)特異性相一致。

表3 紅藍(lán)光處理下菠菜總類胡蘿卜素含量變化與PSY 基因相對表達(dá)量的相關(guān)性分析Table 3 Correlation analysis of total carotenoid content and PSY gene relative expression in spinach under red and blue light treatment

3 討論

3.1 菠菜PSY家族基因分析

本研究通過全基因組篩選在菠菜中鑒定了PSY家族基因，發(fā)現(xiàn)菠菜PSY 有4 個(gè)家族成員，水稻［23］、玉米［24］和番茄［25］中均含有3 個(gè)PSY 基因，模式植物擬南芥中僅有1 個(gè)PSY 基因［22］，表明植物界PSY 蛋白是一類保守且在不同物種間存在一定功能差異。通過對不同物種的PSY 家族的基因結(jié)構(gòu)、功能域和進(jìn)化樹等分析發(fā)現(xiàn)，菠菜的4 個(gè)PSY 蛋白均具有該家族蛋白高度保守的活性位點(diǎn)DXXXD，該位點(diǎn)是判別PSY 基因所編碼的蛋白是否具有酶活力的重要依據(jù)，在蘋果（Malus pumilaMill.）［27］、油菜（Brassica napusL.）［28］、辣椒（Capsicum annuumL.）［29］等物種的PSY 蛋白中也存在同樣的活性位點(diǎn)。進(jìn)化分析上，菠菜SoPSY1 和 SoPSY2 與其他植物PSY 蛋白具有高度保守性，而SoPSY3 和 SoPSY4 形成獨(dú)立的進(jìn)化分支，表明菠菜的4 個(gè)PSY 雖然都具有八氫番茄紅素合酶的保守結(jié)構(gòu)但其功能可能不同。

3.2 菠菜PSY基因具有組織表達(dá)特異性

4 個(gè)PSY 基因的表達(dá)模式分析表明，SoPSY1、SoPSY2、SoPSY3在葉片中高水平表達(dá)，而SoPSY4在根中的表達(dá)水平顯著高于其他組織，這一表達(dá)特征與水稻PSY 表達(dá)模式相似，OsPSY1和OsPSY2啟動(dòng)子中存在大量光響應(yīng)元件并在綠色組織中參與光合作用，而高鹽或干旱脅迫誘導(dǎo)OsPSY3在根系中表達(dá)［23］，故推測SoPSY1、SoPSY2、SoPSY3可能在綠色組織中發(fā)揮功能參與光合作用等，SoPSY4可能具有不同的作用途徑和功能。

3.3 菠菜PSY1、PSY2和PSY3的表達(dá)水平與總類胡蘿卜素含量變化密切相關(guān)

不同組織表達(dá)特異性的PSY 催化類胡蘿卜素合成的能力不同，綠色組織特異性表達(dá)的PSY 的高表達(dá)水平對地上部分類胡蘿卜素積累具有主要貢獻(xiàn)［30］。本研究設(shè)置了R1B3 和R3B1 兩個(gè)光處理?xiàng)l件，栽培類型和野生類型菠菜中4 個(gè)SoPSYs 基因的響應(yīng)模式不同，其中SoPSY1基因的表達(dá)在栽培型菠菜中不受給定光條件影響，SoPSY2基因的表達(dá)模式在兩種類型菠菜中相反，SoPSY3基因在兩種類型菠菜中的表達(dá)模式一致，而且它們的相對表達(dá)水平與總類胡蘿卜素含量變化密切相關(guān)。SoPSY1、SoPSY2和SoPSY3基因的表達(dá)在類胡蘿卜素低積累型的‘US362’中受R1B3 處理誘導(dǎo)，說明藍(lán)光更有效地提高其類胡蘿卜素生物合成基因的轉(zhuǎn)錄水平，但在導(dǎo)致更高代謝產(chǎn)物水平的轉(zhuǎn)錄后步驟中，可能存在其他影響因素。已有的報(bào)道中也觀察到藍(lán)光下生物合成基因的轉(zhuǎn)錄水平較高，如在單色光藍(lán)色LED 下，提高了白菜芽（Brassica campestrisL.）的PSY、PDS、βLCY、εLCY、CYP97A3、CYP97C1、βOHASE1、ZEP、VDE和CCD4基因的轉(zhuǎn)錄水平，而與白光相比，單色紅光降低了這些基因的表達(dá)水平［31］。這可能與紅光下，光敏色素互作因子PHYTOCHROME?INTERACTING FACTOR1（PIF1）抑制了PSY 基因的表達(dá)有關(guān)，在擬南芥［32］中也存在這種現(xiàn)象。

盡管影響菠菜類胡蘿卜素積累的核心調(diào)控因素和分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究，但本研究開展對菠菜八氫番茄紅素合成酶家族基因的生物信息學(xué)分析、表達(dá)特征及其與總類胡蘿卜素含量積累關(guān)系的探索，為菠菜PSY 基因的功能研究提供了新的視角，并且也為基于PSY 基因開發(fā)富含類胡蘿卜素菠菜的分子設(shè)計(jì)育種奠定了理論基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究在菠菜基因組中共鑒定到4 個(gè)PSY 基因，它們在進(jìn)化過程中高度保守。SoPSY1、SoPSY2、SoPSY3基因在綠色組織中表達(dá)水平顯著高于其他組織，SoPSY4具有根組織表達(dá)特異性。菠菜類胡蘿卜素含量在R1B3 和R3B1 處理后均下降；不同基因型菠菜中，各SoPSY 基因響應(yīng)紅藍(lán)光比例變化的表達(dá)模式具有差異性，SoPSY1、SoPSY2和SoPSY3的相對表達(dá)水平與總類胡蘿卜素含量變化密切相關(guān)。