52 個馬鈴薯遺傳多樣性分析及SSR 分子身份證構(gòu)建

安苗 王彤彤 付逸婷 夏俊俊 彭鎖堂，2 段永紅

（1. 山西農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院,晉中 030600；2. 山西蓬勃農(nóng)業(yè)科技股份有限公司,大同 037000）

馬鈴薯（Solanum tuberosumL.）是世界四大主要糧食作物之一，在全世界約162 個國家和地區(qū)均有種植。馬鈴薯富含豐富的營養(yǎng)成分，包括多種維生素及鈣、鉀等微量元素，且容易被消化，功能齊全，被稱贊為“第二面包”。中國是世界上最大的馬鈴薯生產(chǎn)國［1-2］，至今為止，種植歷史約為400 多年，新中國成立以來至2017 年，我國育成馬鈴薯品種622 個，其中國家審定約65 個，明顯落后馬鈴薯育種先進國家［3］。此外，我國育成的馬鈴薯品種親緣關系近，表現(xiàn)出較相似的形態(tài)特征，難以通過形態(tài)標記準確鑒別。在當前馬鈴薯生產(chǎn)中，存在“同名異品種”“同品種異名”的現(xiàn)象，因此，如何對馬鈴薯種質(zhì)資源進行精確、快速的鑒別，并選擇優(yōu)良的雜交組合來培育新品種，是亟需解決的難題［4］。

近年來，隨著生物技術(shù)的發(fā)展，DNA 分子標記技術(shù)的誕生給作物遺傳育種帶來了新的機遇［5-6］。分子標記技術(shù)具有檢測手段簡便、擴增結(jié)果穩(wěn)定、多態(tài)性豐富及快速高效等優(yōu)點，克服了環(huán)境及不同生長階段差異的影響，能夠有效提高育種效率［7-8］。其中SSR 分子標記（simple sequence repeats，簡單重復序列）作為第二代標記技術(shù)，具有共顯性、位點特異性和可重復性高等特點，被國際植物新品種保護聯(lián)合會（UPOV）認定為鑒定植物品種的最強手段［9］。SSR 分子標記已經(jīng)成功應用于花生（Arachis hypogaeaL.）［10］、黃瓜（Cucumis sativusL.）［11］和甜瓜（Cucumis meloL.）［12］等植物的純合子鑒定和單倍體鑒定。Tiwari 等［13］使用14 個SSR 引物分析野生馬鈴薯物種的等位基因變異，檢測到82 個多態(tài)性SSR 標記。de Haan 等［14］利用15 對SSR 引物對900多份秘魯?shù)胤狡贩N和100 多個外來種質(zhì)進行比較，檢測到173 個等位位點，其中2 個群體共有129 個等位位點，占總數(shù)的74.60%。Sharma 等［15］采用SRAP、SNP 標記，并結(jié)合SSR DNA 分子標記技術(shù)，對40 多個馬鈴薯品種進行多態(tài)性分析，結(jié)果顯示3種標記均可區(qū)分40 多個品種。段艷鳳［16］、王鵬等［17］、王若秋等［2］、高玉坤等［18］對馬鈴薯品種（系）的遺傳多樣性進行了SSR 標記分析，并構(gòu)建了相應馬鈴薯品種（系）的DNA 分子身份證。劉春雷［19］利用EST?SSR 引物分析了44 份馬鈴薯品種資源的親緣關系，并構(gòu)建指紋圖譜。山西是我國馬鈴薯的主產(chǎn)區(qū)，晉北地區(qū)是山西馬鈴薯的主要種植地，引進、篩選不同的馬鈴薯品種（系），助力當?shù)伛R鈴薯產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，但對其遺傳背景不明晰，影響了馬鈴薯新品種選育的進程。

為明確山西主要種植及推廣的馬鈴薯品種（系）的親緣關系，對其遺傳多樣性進行評價，明晰其遺傳背景。本研究采用SSR 分子標記，分析52 份馬鈴薯種質(zhì)（系）間的DNA 水平的遺傳差異，明確其親緣關系的遠近，并篩選特異性引物構(gòu)建馬鈴薯的分子身份證，為馬鈴薯種質(zhì)資源的親緣關系分析、分類鑒定以及育種材料的選擇提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

選用52 個馬鈴薯品種（系），均由山西蓬勃農(nóng)業(yè)科技股份有限公司生產(chǎn)，材料信息見表1，于2022 年6 月1 日種植在山西省大同市左云縣北十里村馬鈴薯脫毒種薯示范基地（112°34' E, 39°44' N），海拔1 295 m，無霜期125 d。馬鈴薯以高壟種植的方式播種，株距45 cm，行距60 cm。

表1 供試馬鈴薯品種（系）Table 1 Potato varieties（line）in the research

1.2 方法

1.2.1 馬鈴薯基因組DNA 提取 摘取馬鈴薯幼嫩葉片，用改良的CTAB 法提取基因組DNA［20］，0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 質(zhì)量，使用核酸蛋白檢測儀測定DNA 濃度，之后將樣品DNA 稀釋為50ng/μL，置于?20℃冰箱保存，備用。

1.2.2 馬鈴薯SSR 標記分析 本試驗選用25 對SSR引物，來源于相關文獻［8,21-26］使用的引物，由上海生工生物工程股份有限公司合成，其引物序列見表2。

表2 SSR 引物名稱和序列Table 2 SSR primers name and sequences

SSR?PCR 擴增體系：體系總?cè)萘繛?0 μL，含1 μL 樣品DNA（50 ng/μL），5 μL Mix，上游和下游引物各1 μL，ddH2O 2 μL。

擴增程序： 94℃預變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火45 s，72℃延伸90 s，5 個循環(huán)；95℃變性30 s，53℃退火45 s，72℃延伸90 s，72℃延伸10 min，35 個循環(huán)；4℃反應終止，自動保存。以50 bp DNA Ladder Marker 作為分子量標記，產(chǎn)物經(jīng)8%聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，恒壓170 V，電泳2 h，用銀染法顯色后，放在凝膠觀察燈上進行觀察并拍照記錄［27］。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析 電泳結(jié)束后采取人工讀帶方式，按照“0/1”賦值法進行SSR 多態(tài)性條帶統(tǒng)計，在擴增位點中，清晰可見、可重復的條帶用“1”表示，在同一位點上，缺失或弱帶標記為“0”。根據(jù)基因組DNA 片段大小依次記錄，將數(shù)據(jù)輸入Excel 2010軟件構(gòu)建“0、1”二進制模型。計算各引物擴增的總條帶數(shù)、多態(tài)性條帶數(shù)。

通過PIC 值（polymorphism information content）對引物多態(tài)性進行評估。計算公式為：PICi＝1-∑Pij2，Pij表示標記i 的第j 個等位基因的頻率［28］。

利用POPGENE version 1.31 軟件計算觀測等位基因數(shù)（Na）、有效等位基因數(shù)（Ne）、Nei's 遺傳多樣性指數(shù)（H）、Shannon's 信息指數(shù)（I）；利用NTSYS pc version 2.00e 軟件，通過Qualitiative data模塊計算參試材料間的遺傳相似系數(shù)，SASYS 模塊以非加權(quán)配對算術(shù)平均法（UPGMA）對品種（系）進行聚類分析［29-30］，Tree plot 模塊繪制樹狀聚類圖，根據(jù)不同SSR 標記對條帶的結(jié)果依次排序，采用二維碼技術(shù)（https：//cli.im/）將材料基本信息（包括名稱、統(tǒng)一編號、來源地、字符串DNA）轉(zhuǎn)化為可掃描的二維碼，即二維碼DNA 分子身份證。

2 結(jié)果

2.1 馬鈴薯SSR引物多態(tài)性分析

本試驗前期從25 對SSR 引物中篩選出16 對具有較高多態(tài)性且條帶清晰的引物，多態(tài)引物比率為64.54%。16 對多態(tài)性SSR 引物共檢測到217 個等位位點，平均每對引物檢測位點13.56 個，引物C59 檢測出的位點數(shù)最高為26 個，引物C3 檢測到的位點最低為4 個；多態(tài)位點百分數(shù)介于28.57%-100.00%之間，均值是64.71%，引物C59 檢測到的多態(tài)位點最高為100.00%，引物STM1016 最低為28.57%；觀測等位基因數(shù)（Na）介于1.50-2.00 之間，平均數(shù)為1.96；有效等位基因數(shù)為（Ne）介于1.07-1.38，平均為1.21；Nei's 遺傳多樣性指數(shù)（H）介于0.06-0.24，平均為0.14；Shannon's（I）在0.13-0.39之間，平均為0.24。多態(tài)性引物檢測位點信息見表3，引物C59 對馬鈴薯品種（系）的擴增結(jié)果見圖1。引物多態(tài)性信息含量（PIC）介于0.02-0.30，平均為0.15。其中，引物C3 的PIC值最高，S151 的PIC值最低。16 對引物中有1 對引物為中度多態(tài)位點（0.25 ≤PIC≤0.50）［31］。

圖1 引物C59 對馬鈴薯基因組DNA 的擴增結(jié)果Fig. 1 Amplification results of genomic DNA of potato with primer C59

表3 SSR 引物擴增結(jié)果Table 3 Amplification results of polymorphic SSR primers

2.2 SSR引物多態(tài)性參數(shù)相關分析

由表4 可得，有效等位基因數(shù)（Ne）與Nei's遺傳多樣性指數(shù)（H）、Shannon's 信息指數(shù)（I）均呈極顯著正相關（P<0.01），相關系數(shù)分別為0.961、0.903；Nei's 遺傳多樣性指數(shù)（H）與Shannon's 信息指數(shù)（I）也呈極顯著正相關（P<0.01），相關系數(shù)為0.982；引物的多態(tài)性信息含量（PIC）與觀測等位基因數(shù)（Na）、有效等位基因數(shù)（Ne）、Nei's遺傳多樣性指數(shù)（H）、Shannon's 信息指數(shù)（I）均呈顯著正相關（P<0.05），相關系數(shù)依次為：0.571、0.558、0.586、0.542。表明有效等位基因數(shù)（Ne）、引物的多態(tài)性信息含量（PIC）可以作為評價不同品種（系）馬鈴薯遺傳多樣性的參數(shù)。

表4 各參數(shù)的相關性分析Table 4 Correlation analysis of each parameter

2.3 馬鈴薯親緣關系聚類分析

經(jīng)分析，52 個馬鈴薯品種（系）間遺傳相似系數(shù)范圍是0.01-0.91，變幅為0.89。其中‘東農(nóng)310’和‘克新25’、‘隴薯20 號’和‘北方016’的遺傳相似系數(shù)最高，為0.91，表明兩者的遺傳距離最??；‘北方016’和‘石薯1 號’、‘北方016’和‘石薯3 號’遺傳相似系數(shù)最低，均為0.01，說明他們之間的遺傳距離最大。聚類分析得到52 份供試材料間的遺傳關系（圖2）。

圖2 基于SSR 標記的52 份馬鈴薯品種（系）聚類圖Fig. 2 Clustering diagram of 52 potato varieties（lines）based on SSR marker

在遺傳相似系數(shù)為0.23 處，可將52 份品種（系）分為3 大類。類群I 所含的材料最多，包括49 個品種（系），其中，46 個是北方品種（系），3 個是國外引進品種（系）；類群II 包括2 個品種，‘北方016’和‘晉薯16 號’，其特點是干物質(zhì)含量高、薯皮黃色；類群III 僅包括‘晉薯15 號’。在遺傳相似系數(shù)0.36 處，類群I 又可以分為7 個亞類。第1 亞類含有21 個品種（系），均為抗性較強的品種（系），其中包括‘民豐紅’‘雪川紅’‘黑金剛’‘紫玫瑰’，均為彩色馬鈴薯，‘V7’‘荷蘭806’為國外引進品種，‘蓬勃2 號’‘蓬勃1 號’‘大同里外黃’為地理來源相同的品種，‘青薯10 號’和‘V9’由青海省農(nóng)林科學院選育而成。第2 亞類含有1 個品種‘石薯3 號’；第3 亞類包括‘中加2 號’與‘紫玫瑰’，均為中晚熟品種，抗病性強；第4 亞類也含有2 個品種為‘麗薯6 號’‘冀張薯12 號’，薯皮薯肉均為白皮白肉，中晚熟品種；第5 亞類有17 個品種（系），其中‘隴薯’系列的3 個材料（‘隴薯7 號’‘隴薯10 號’‘隴薯20 號’）、‘京張薯’系列的2 個材料（‘京張薯1號’‘京張薯3 號’）、‘中薯’系列的2 個材料（‘中薯306’‘中薯9 號’）、‘冀張薯’系列的2 個材料（‘冀張薯8 號’‘228’）、本溪市的2 個材料（‘476’‘石薯6 號’），根據(jù)地理來源劃分在一個亞類；第6 亞類含有‘隴薯14 號’和‘青薯9 號’，其薯型均為橢圓形、淺芽眼；第7 亞類包括‘克新13’‘荷蘭13’‘冀張薯12 號’，花冠均淡紫色。

2.4 不同品種（系）馬鈴薯指紋圖譜構(gòu)建

采用16 對多態(tài)性引物對52 個馬鈴薯品種（系）進行DNA 指紋圖譜分析，引物C33、S25、S151 對馬鈴薯品種（系）的PCR 擴增結(jié)果的電泳條帶見圖3。在所選的16 對多態(tài)性引物中任何一對引物都只能區(qū)分部分品種。對16 對多態(tài)性SSR 引物的擴增譜帶進行統(tǒng)計分析，綜合考慮引物的SSR 多態(tài)條帶比率（PPB）、PIC值大小和條帶統(tǒng)計的難易程度，篩選出引物C59、C33、S25 和S151，共4 對引物可構(gòu)建52 個品種（系）的指紋圖譜。C59 擴增出的條帶大小分別為180、170 和160 bp（圖1）；S25 擴增出的條帶大小分別為180、170、160 和150 bp（圖3?A）；C33 擴增出的條帶大小分別為170、160、155和150 bp（圖3?B）；S151 擴增出的條帶大小分別為120、110、100、90 和85 bp（圖3?C）。利用4 對引物可以將馬鈴薯品種（系）正確區(qū)分，將每份材料對應的擴增結(jié)果轉(zhuǎn)化為二進制“0/1”代碼，得到每個品系獨立的唯一編碼，構(gòu)成52 份馬鈴薯材料的“數(shù)字化指紋圖譜”（表5）。

2.5 馬鈴薯品種（系）的分子身份證

使用在線二維碼生成器展示52 個品種的實驗結(jié)果，圖4 中每個QR 編碼圖對應一個品種，編碼的信息包括指紋圖譜及SSR 電泳標記等信息，在生產(chǎn)中，可用于日常的品種鑒別和親本選擇，極大地提高生產(chǎn)效率，方便查看各品種的遺傳信息。

3 討論

3.1 馬鈴薯種質(zhì)資源的遺傳多樣性

通過對種質(zhì)資源進行親緣關系分析、遺傳多樣性評價，能夠了解種質(zhì)資源的變異水平、遺傳結(jié)構(gòu)和背景，可為種質(zhì)資源的開發(fā)、利用以及創(chuàng)新提供研究基礎［31］。本研究利用SSR 標記分析馬鈴薯種質(zhì)資源的遺傳多樣性，16 對多態(tài)性引物共擴增出217個條帶，平均多態(tài)性位點百分率達64.71%，此結(jié)果低于張招娟等［32］的研究結(jié)果（96.60%），與高玉坤等［18］的研究結(jié)果（65.77%）相近。平均多態(tài)性百分率的高低可能與研究材料、選用引物及選用引物的數(shù)量相關。

3.2 馬鈴薯種質(zhì)資源的聚類分析

本研究利用NTSYS pc version2.00e 軟件進行聚類分析，將52 份馬鈴薯種質(zhì)資源劃分為3 個類群。其中類群I 最大，包含49 個品種（系），占總研究材料的94.23%，其中，46 個是北方品種（系），3 個是國外引進品種（系）為‘V9’‘V7’‘荷蘭806’，均適宜晉北地區(qū)種植。46 個北方品種（系）未與類群II、類群III 聚為一類，即大類的劃分上未按照地理來源進行聚類。但類群I 中的第5 亞類‘隴薯’系列、‘冀張薯’系列、‘石薯’系列、‘中薯’系列的研究材料，按照地理來源進行聚類被劃分在同一類群。張海雯等［9］采用SSR 標記對62 份馬鈴薯材料進行遺傳多樣性研究發(fā)現(xiàn)，來源地相同的品種大多聚類為一個分支或距離較近的兩組中，與本研究結(jié)果一致。同時發(fā)現(xiàn)，由相同育種單位山西農(nóng)業(yè)大學高寒區(qū)作物研究所選育的‘晉薯16 號’與‘晉薯15 號’并沒有聚為一類，‘晉薯16’以‘NL94014’作母本，用‘9333?11’為父本配置雜交組合，通過有性雜交選育而成，‘晉薯15’以母本‘9341?14’與父本‘9324?2’雜交后定向選育，二者所采用的骨干親本材料有差異，選育品種的目標性狀不同，因而親緣關系較遠，未聚為一類?？赡芤才c本研究中SSR 標記引物不多，檢測位點有限有關。

3.3 馬鈴薯種質(zhì)資源SSR分子身份證的構(gòu)建

隨著馬鈴薯主糧化進程的推進，馬鈴薯育種品種逐年增加，導致一些品種混淆，出現(xiàn)“同名異物”“同物異名”的現(xiàn)象。在分子標記的基礎上利用二維碼技術(shù)生成品種的分子身份證［33-34］，可有效地解決馬鈴薯鑒定的難題，有利于馬鈴薯種質(zhì)資源的鑒定以及溯源，有利于保護相關的知識產(chǎn)權(quán)。近年來，茶樹［Camellia sinensis（L.）O. Kuntze.］［35］、蘋果（Malus pumilaMill.）［36］、 大豆［Glycine max（L.）Merr.］［37］、小麥（Triticum aestivumL.）［38］等作物都在SSR 分子標記的基礎上，構(gòu)建了分子身份證。本研究中任何一對引物均無法區(qū)分52 個馬鈴薯品種（系），根據(jù)PIC值以及條帶統(tǒng)計的難易程度，逐一加入引物對，對材料進行比較鑒定，直到把52 個供試材料區(qū)分開為止。依據(jù)利用盡量少的引物來區(qū)分品種原則，選擇了C59、C33、S25、S151 共4 對引物構(gòu)建了52 個馬鈴薯品種（系）的數(shù)字化指紋圖譜。管俊嬌等［39］也運用了SSR 標記技術(shù)對22 對引物所形成的電泳圖譜進行分析發(fā)現(xiàn)，4 對引物的擴增結(jié)果組合起來能將22 份青花菜種質(zhì)資源區(qū)分開。劉文林等［40］也運用了SSR 標記技術(shù)對23 對引物所形成的電泳圖譜進行分析，構(gòu)建了63 份馬鈴薯種質(zhì)資源的分子身份證。程林濤等［41］同樣運用此方法構(gòu)建了80 份草地早熟禾種質(zhì)的字符串、二維碼和二維碼分子身份證。本研究選用4 對多態(tài)性SSR 引物構(gòu)建了52 個馬鈴薯品種（系）的數(shù)字化指紋圖譜以及對應的分子身份證，可用于馬鈴薯種質(zhì)資源的鑒定與溯源。

4 結(jié)論

本研究從25 對SSR 引物中篩選出多態(tài)性豐富、穩(wěn)定性好的16 對引物，并對52 份馬鈴薯品種（系）進行SSR 擴增分析，共檢測到147 個多態(tài)性條帶，引物平均多態(tài)條帶比率為64.71%。基于最少引物鑒定最多種質(zhì)的原則。利用C59、S25、C33、S151 共4 對引物組合，構(gòu)建了52 個馬鈴薯品種（系）的數(shù)字化指紋圖譜以及分子身份證，可用于馬鈴薯種質(zhì)資源的鑒定與溯源。