RNAi 技術(shù)在寄生蜂中的應(yīng)用研究進展

張龍喜 呂琳 張歡歡 周金成 車午男 董輝

（1. 沈陽農(nóng)業(yè)大學植物保護學院，沈陽 110866；2. 西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學院蔬菜研究所，拉薩 850032）

RNA 干擾現(xiàn)象最早由Napoli 等［1］于1990 年在矮牽牛（Petunia hyhridaVilm）上發(fā)現(xiàn)。Fire 等［2］在研究秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）RNA干擾過程中闡述了基因沉默現(xiàn)象的本質(zhì)，并將RNA干擾（RNA interference, RNAi）定義為雙鏈RNA（double?strand RNA, dsRNA）降解同源基因mRNA的效應(yīng)。RNAi 不僅存在于植物和真菌，還廣泛存在于昆蟲中［3-6］。

RNAi 技術(shù)現(xiàn)已成為研究生物基因功能主要生物技術(shù)方法［7］，并且成功應(yīng)用于多種昆蟲的基因功能研究中［8］。膜翅目是僅次于鞘翅目和鱗翅目的第三大目，膜翅目中的寄生蜂類群包含12 個科，是膜翅目的重要組成部分，也是防治農(nóng)林害蟲的重要天敵昆蟲資源［9］。寄生蜂的生長發(fā)育依賴于寄主，同時與寄主昆蟲產(chǎn)生相互作用。這些特殊的生物學特性為開展寄生蜂的基因功能研究，尤其是給RNAi 技術(shù)等反向遺傳學手段的實施帶來挑戰(zhàn)。

本文綜述了RNAi 技術(shù)在膜翅目寄生蜂中的發(fā)展與應(yīng)用，包括RNAi 機制、影響RNAi 效率的因素等。研究將為RNAi 技術(shù)在寄生蜂基礎(chǔ)理論和害蟲防治應(yīng)用的相關(guān)研究提供方法參考和科學依據(jù)。

1 RNAi 作用機制與dsRNA 遞送方法

1.1 RNAi機制

RNAi 是一種高度保守的細胞機制，目前已知動物中的RNAi 通路有3 種，包括Short/small interfer?ing RNA（siRNA）通路［10-11］、microRNA（miRNA）通路［12-13］和P?element induced wimpy tesis（Piwi）?in?teracting RNAs（PiRNAs）通路［14］。

在昆蟲中，當dsRNA 導入到細胞后，dsRNA 與R2D2 或內(nèi)源性siRNA 途徑中的Loquacious（Loqs）一起被III 型核糖核酸酶Dicer?2（Dcr2）識別并切割［15］。在這個過程中細胞質(zhì)中的dsRNA 被切割成19-21 nt 的siRNA 雙鏈，隨后siRNA 被裝載到Ago2 后，Ago2 和其他RNA 誘導沉默復合體（RNA induced silencing complex, RISC） 相關(guān)蛋白組裝RISC。RISC 中siRNA 的正義鏈被降解，反義鏈被保留，RISC 通過反義鏈引導RISC 中Ago2 識別并切割互補的靶mRNA［16］。RNAi 主要蛋白質(zhì)參與者是Agronaute（Ago）家族蛋白，Ago 家族蛋白具有靶RNA 切割活性，AGO 蛋白與小RNA 結(jié)合并通過小RNA 和目標mRNA 之間的序列互補，觸發(fā)靶RNA的降解［16-18］。siRNA 通路過程見圖1。

圖1 siRNA 介導的RNAi 通路示意圖Fig. 1 Model of siRNA-mediated RNAi pathway

1.2 dsRNA導入方法

目前dsRNA 的導入方法包括顯微注射法、飼喂法、浸泡法、組織培養(yǎng)法、電穿孔、病毒轉(zhuǎn)染以及轉(zhuǎn)基因等。寄生蜂主要發(fā)育時期都寄生于寄主昆蟲內(nèi)部，因此不同的dsRNA 導入方法受限于其寄生生活的特性。傳統(tǒng)的飼喂、浸泡等方式導入RNA 的方法可能難以起效。目前，寄生蜂RNA 干擾研究中的導入方法集中于注射，包括卵期注射、幼蟲注射、蛹期注射、成蟲注射以及寄主注射（表1）。

表1 RNAi 在寄生蜂中的應(yīng)用Table 1 Application of RNAi in parasitoids

1.2.1 顯微注射法 顯微注射法已報道于麗蠅蛹集金小蜂（Nasonia vitripennis）、中紅側(cè)溝繭蜂（Micr?oplitis mediator）、菜蛾盤絨繭蜂（Cotesia vestalis）、蝶蛹金小蜂（Pteromalus puparum）、斑痣懸繭蜂（Me?teorus pulchricornis）、甲腹繭蜂（Chelonus inanitus）、菜蛾盤絨繭蜂（Cotesia vestalis）、二化螟盤絨繭蜂（Cotesia chilonis）、蝶蛹金小蜂（Pteromalus pupar?um）、日本開臂反顎繭蜂（Asobara japonica）等寄生蜂的基因功能研究中。

在金小蜂中，對毒液鈣網(wǎng)蛋白（venom calretic?ulin component,v?crc）的敲除效率高達90%［22］；在針對Wolbachia密度抑制基因（Wolbachia density sup?pressor,Wds）的敲除中，沉默效率達到了71%［27］。在中紅側(cè)溝繭蜂（M. mediator）中，對Odorant Re?ceptor基因抑制效率超過90%［34］。在菜蛾盤絨繭蜂（C. vestalis） 中， 注射法RNAi 效率可達74%-98%［30］。注射法作用效果快，需要少量的dsRNA 就能對靶標基因進行干擾，但是注射操作對于微型昆蟲來說機械損傷仍然會造成較高的死亡率，同時對于操作環(huán)境和技術(shù)熟練度要求較高。

1.2.2 浸泡法 浸泡法是將供試昆蟲直接浸泡在dsRNA 溶液中，dsRNA 分子直接通過昆蟲氣孔或表皮滲透至體內(nèi)，干擾體內(nèi)靶基因表達。高鵬［35］通過混合dsRNA 和納米材料浸泡處理二化螟盤絨繭蜂（A. chilonis）成蟲，靶基因熱激蛋白基因Cchsp70?4在27℃和36℃下的沉默效率分別達到34.25%和63.36%。然而，何馥晶［36］分別運用納米材料浸泡法與注射法處理二化螟盤絨繭蜂預蛹和蛹發(fā)現(xiàn)，兩種方法對靶基因半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶基因Cccaspase?1的沉默效率無顯著差異。在松毛蟲赤眼蜂（Trichogramma dendrolimi）中，通過dsRNA 溶液注射寄主卵浸泡處理卵內(nèi)的子代蜂，靶基因沉默效率達70%［48］。相比于注射法，浸泡更方便更容易操作，對操作技術(shù)要求較低；相反，浸泡法所需要的dsRNA 量大，實驗成本較高，且需要dsRNA 穩(wěn)定的浸泡環(huán)境。

1.2.3 飼喂法 飼喂法是將dsRNA 加入昆蟲的食物或人工飼料，昆蟲通過取食進入體內(nèi)對靶標基因進行干擾的方法。然而，寄生蜂幼期的生長發(fā)育依賴于寄主，其幼期脫離寄主將難以存活。在保障寄生蜂正常發(fā)育的基礎(chǔ)上對寄生蜂飼喂dsRNA 具有一定難度。目前，應(yīng)用飼喂法在寄生蜂實施RNAi 的研究鮮有報道。

1.2.4 其他RNAi 方法 細胞轉(zhuǎn)染法是利用轉(zhuǎn)染劑直接將dsRNA 遞送到細胞中的干擾方法。Beck等［32］利用細胞轉(zhuǎn)染法成功抑制中紅側(cè)溝繭蜂（M.mediator）glc1.8基因的表達，并挽救High Five 細胞的黏附表型。此外，在昆蟲基因功能的研究中還有轉(zhuǎn)基因、組織培養(yǎng)法、電穿孔、病毒轉(zhuǎn)染等方法［32,49-51］。

續(xù)表1 Table 1 continued

2 RNAi 在寄生蜂中的應(yīng)用

寄生蜂是一類營寄生生活的膜翅目昆蟲，寄主大部分為鱗翅目害蟲。寄生蜂寄生行為依賴于對寄主的精準定位以及攜帶的多種寄生因子，包括毒液、多分DNA 病毒（polydnavirus，PDV）、病毒樣顆粒（virus?like particles or MpVLPs）以及化感相關(guān)蛋白（OBPs、GRs、CSPs、ORs）等。同時，寄生蜂與宿主昆蟲在生長發(fā)育和免疫反應(yīng)的相互作用分子調(diào)控也得到關(guān)注。寄生蜂復雜的生物學特性給RNAi 技術(shù)的實施帶來諸多挑戰(zhàn)。

2.1 寄生蜂生長發(fā)育相關(guān)基因RNAi研究

親本RNAi（parental RNAi, pRNAi）可以通過處理生物體的母代，而在后代觀察到基因沉默表型。Olesnicky 等［28］利用pRNAi 原理沉默麗蠅蛹集金小蜂（N. vitripennis）cad基因，研究表明高濃度的dsRNA 使得胚胎停止發(fā)育，而低濃度時，雌性產(chǎn)出卵表現(xiàn)出表皮缺陷?；趐RNAi 的研究相對較多，在靶基因方面，tudor和Bicauda1?D、Nv?odd paired等與胚胎形成相關(guān)的基因都已相繼在金小蜂中被驗證［24,29］。Geuverink 等［4,19-20,52］利用金小蜂pRNAi，揭示了金小蜂的性別決定級聯(lián)方式。

生物體能夠通過生物鐘基因利用光周期協(xié)調(diào)其發(fā)育、繁殖。其中period(per)、cryptochrome?2(cry?2)、clock(clk) 和cycle(cyc) 等生物鐘基因扮演重要角色［53-54］。Mukai 等［23］對金小蜂per基因進行沉默后，金小蜂不能在短時間內(nèi)產(chǎn)下滯育的卵。相同的是，Dalla 等［26］對金小蜂per基因進行干擾，結(jié)果導致晝夜節(jié)律時鐘加快，改變了其他生物鐘基因的表達，并推遲了滯育。姜卓［48］通過浸泡法成功將RNAi 技術(shù)運用于卵寄生蜂，成功干擾松毛蟲赤眼蜂VgR基因。

2.2 寄生蜂免疫相關(guān)基因RNAi研究

2014 年Colinet 等［45］首次報道了寄生蜂毒液蛋白基因的有效沉默，表明LbGAP 是大量存在于布拉迪小環(huán)腹癭蜂（Leptopilina boulardi）毒液中的毒力因子。毒液鈣網(wǎng)蛋白是金小蜂基因組里鑒定到的僅有毒液蛋白，毒液鈣網(wǎng)蛋白沉默后，抑制了宿主對金小蜂毒液的先天免疫反應(yīng)，并減少宿主出血和黑化［22］。與之相反的是，在對日本開臂反顎繭蜂（A.japonica）中2 個已報道的與寄主黑化反應(yīng)相關(guān)的基因進行RNAi 時，結(jié)果顯示這2 個基因的RNA 干擾效率均在90%以上，但寄主黑化率、寄生蜂寄生率和出蜂率與對照組相比沒有顯著差異［46］。在中紅側(cè)溝繭蜂（M. mediator）中，干擾毒液蛋白基因MmRho1會導致雌蜂卵黃生成素和保幼激素、卵子生成和繭形成的下調(diào)。此外，通過酵母雜交實驗表明MmRho1在中紅側(cè)溝繭蜂發(fā)育和抑制宿主細胞免疫反應(yīng)中發(fā)揮雙重作用［33］。

寄生蜂多分DNA 病毒（PDV）參與調(diào)控了宿主寄生蜂的免疫及生長發(fā)育過程。在中紅側(cè)溝繭蜂（M. mediator）中，MdBV 感染會阻斷High Five 細胞黏附培養(yǎng)板的能力，而通過RNAi 沉默glc1.8的表達可以挽救High Five 細胞黏附［32］。對甲腹繭蜂（C.inanitus）的宿主注射CiV基因的dsRNA 后，挽救了末齡幼蟲的發(fā)育停滯，相反，將相同的dsRNA 注射到寄生蜂卵中則阻止了寄生蜂的羽化，降低了寄生蜂的存活率。推測這些病毒基因可能參與誘導寄主發(fā)育停滯和軟化角質(zhì)層［37］。此外，BVs 可能參與核衣殼的形成［30］。

除此之外，病毒樣顆粒也有助于削弱宿主免疫防御系統(tǒng)。在斑痣懸繭蜂（M. pulchricornis）中，MpVLP 在體外培養(yǎng)的早期階段抑制宿主黏附血細胞的附著和擴散，這最終誘導宿主血細胞凋亡，從而保護宿主中產(chǎn)的受精卵［55］。Yokoi 等［40］通過單基因和聯(lián)合基因沉默兩種MpVLP 因子，導致對宿主幼蟲漿血細胞的抑制作用減弱，表明兩種MpVLP 因子參與了漿血細胞擴散的抑制，但不參與顆粒細胞的抑制。

2.3 其他基因RNAi研究

近年來，隨著RNAi 技術(shù)的成熟，有關(guān)寄生蜂RNAi 的基因功能研究逐漸增多。在靶基因上，包括氣味結(jié)合蛋白基因（CvesOBP17/18/19）、色素合成相關(guān)基因ebony和cinnabar、細胞色素P450基因、熱激蛋白基因（Cchsp70?4）、幼蟲唾液蛋白基因（Pp16911）、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（Cccaspase?1）、α- 淀粉酶基因（PpAmy1、PpAmy2、PpAmy3）、脂肪酸合成酶基因（Fatty Acid Synthases,FASs）、UDP 糖基轉(zhuǎn)移酶基因（UDP?gly?cosyltransferases,UGTs）等相關(guān)的基因功能研究都已報道［21,31,35-36,38-39,41-43,45,47］。

3 RNAi 效率的影響因素

3.1 靶基因的選擇

在已報道的寄生蜂的RNAi 研究中，靶基因或靶序列可分為四類：（1）免疫相關(guān)基因，包括毒液蛋白基因［45-46］、病毒樣顆粒［40］、多分DNA 病毒（PDV）［30,32,40］、幼蟲唾液蛋白基因（Pp16911）［42］等。（2）生長發(fā)育相關(guān)基因，包括DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶基因（Dnmt）［24］、生物鐘基因（per）［23,26］、脂肪酸合成酶基因（FASs）［38］等。（3）生殖及性別決定相關(guān)基因，包括與雄性生殖能力和雌性卵子孵化有關(guān)的基因，如dsx［19-20］、tra和tra2［4］、VgR［48］等。（4）寄主識別和適應(yīng)相關(guān)基因，包括與嗅覺、味覺、視覺、聽覺和觸覺相關(guān)的基因，如氣味結(jié)合蛋白OBPs［31］、味覺受體GRs、化學感覺蛋白CSPs、嗅覺受體ORs［44］、熱激蛋白基因（hsp70?4）［35］、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶基因（Cccaspase?1）［36］等。

值得注意的是，使用致死作為表型結(jié)果時，應(yīng)當考慮假陽性結(jié)果的風險?？梢岳镁哂刑囟ū硇偷幕騺斫⒉?yōu)化RNAi 技術(shù)體系，并作為RNAi效率的指示基因。例如與昆蟲色素沉著相關(guān)的基因，包括laccase［56-57］、ebony［47,58］等。

3.2 脫靶效應(yīng)

與其他昆蟲不同，許多寄生蜂幼期生活于寄主昆蟲體內(nèi)。dsRNA 的靶向性易受宿主昆蟲影響。于昆蟲的脫靶效應(yīng)而言，目前已有參數(shù)來預測脫靶：與靶基因序列一致性達80%的dsRNA 可有效觸發(fā)RNAi；具有完全匹配序列片段≥16 bp 或幾乎完全匹配序列片段>26 bp，其中一個或兩個錯配很少分布的dsRNA（單個錯配插入≥5 bp 的匹配片段之間或插入≥8 bp 匹配片段之間）也能夠觸發(fā)RNAi［59］。例如，在對赤擬谷盜（Tribolium castaneum）篩選防控基因時，dsTcCht10對麗蠅蛹集金小蜂（N.vitripennis）Cht10基因轉(zhuǎn)錄水平有顯著影響，且赤擬谷盜dsTcCht10與麗蠅蛹集金小蜂同源基因的相似性為66.75%，存在連續(xù)19-23 nt 核苷酸的匹配個數(shù)［60］。因此為了更好地將RNAi 技術(shù)應(yīng)用于寄生蜂研究，應(yīng)該加強dsRNA 特異性檢測。

3.3 降解dsRNA的核酸酶

已有的研究表明，昆蟲血淋巴或者中腸中的核酸酶（DNases 和RNases）是降解dsRNA 關(guān)鍵因素。在寄生蜂-宿主昆蟲系統(tǒng)中，宿主昆蟲和寄生蜂產(chǎn)生的相關(guān)核酸酶均可能對dsRNA 產(chǎn)生降解作用。在昆蟲血淋巴濃度初始劑量相同時，分別以1.0、2.3、11.5、33.0 μg 劑量的幾丁質(zhì)合成酶同源基因dsRNA 向美洲大蠊（Periplaneta americana）、大麥蟲（Zophobas atratus）、飛蝗（Locusta migratoria）、斜紋夜蛾（Spodoptera litura）注射，分別導致了82%、78%、76%和20%的損耗［61］。進一步研究發(fā)現(xiàn)，沉默核酸酶基因可顯著提高RNAi 效率，共同沉默多個核酸酶基因也可顯著提高干擾效率［62］。深入研究表明，不同昆蟲降解dsRNA 的核酸酶所需要的生理條件不同［63-64］。在東亞飛蝗（Locusta migratoria）中，LmdsRNase1可以在最適pH 5 下快速降解dsRNA，而中腸的生理pH 6.8 是LmdsRNase2活性的理想值［65］。綜上所述，昆蟲血淋巴和腸道中的核酸酶對RNAi 效率有嚴重影響，鑒定不同昆蟲降解dsRNA 的關(guān)鍵基因，對于研究RNAi 機制具有重要意義。

3.4 dsRNA設(shè)計及其他因素

除了上述影響因素外，dsRNA 的長度、結(jié)構(gòu)、反應(yīng)時間、操作環(huán)境、劑量均會影響RNAi 的研究。List 等［66］總結(jié)了不同目昆蟲RNAi 研究中所用的dsRNA 分子的有效性：（1）在構(gòu)建dsRNA 分子大小有效性范圍時，移除死亡率低于67%的結(jié)果后，結(jié)果顯示有125-628 bp 的有效范圍。在寄生蜂中，dsRNA 分子大小集中在300-600 bp。這些結(jié)果與Huvenne 等［67］的結(jié)果相近。（2）RNAi 反應(yīng)持續(xù)時間可能對死亡率產(chǎn)生影響。在煙粉虱（Bemisia tabaci）中，飼喂ATP 酶dsRNA 在48 h 時，煙粉虱死亡率達70%。對溫帶臭蟲（Cimex lectularius）連續(xù)飼喂28 d 后，死亡率才能達到80%-85%。（3）dsRNA 劑量也是影響RNAi 效果的重要因素。這與dsRNA 的導入方法以及昆蟲的取食方式密切相關(guān)。在RNAi 研究中，穩(wěn)定的操作環(huán)境、昆蟲的處理方式以及實驗器材的處理可能也需要考慮。包括注射或飼喂前對實驗器材的滅菌處理，注射過程對成蟲的麻醉方式，注射或飼喂后的培養(yǎng)環(huán)境，dsRNA 儲存方式的影響等［68-69］。尤其是在設(shè)計靶標基因dsRNA 引物時，也應(yīng)該考慮昆蟲對dsRNA 堿基偏好性。

4 展望

RNAi 具有高效、特異性強等優(yōu)點，現(xiàn)階段已成為研究昆蟲基因功能的常規(guī)技術(shù)。脂質(zhì)體（liposo?mes）修飾和納米材料包被認為是提升干擾效率的潛在有效方法。但是，由于寄生蜂特殊的生活方式，RNAi 技術(shù)在寄生蜂的應(yīng)用上仍然存在著多種挑戰(zhàn)。在寄生蜂中，傳統(tǒng)的飼喂法RNAi 研究鮮有報道，對于dsRNA 在其體內(nèi)的遞送機制也尚未揭示。在遞送方式中，飼喂法操作簡便，但目前仍然缺乏大量生產(chǎn)dsRNA 的成本效益高的方法。顯微注射法在寄生蜂RNAi 研究中應(yīng)用最多，但該方法多數(shù)只能在寄生蜂蛹期和成蟲期操作，難以應(yīng)用于其他發(fā)育時期，尤其是寄生蜂的早期胚胎階段。dsRNA 的脫靶和非脫靶效應(yīng)、作用位點的預測以及潛在的抗性發(fā)展問題也是RNAi 技術(shù)應(yīng)用于寄生蜂的重要大挑戰(zhàn)。目前迫切需要建立基于寄生蜂生物學特點的RNAi方法，重點聚焦提高dsRNA 的遞送效率。相關(guān)方法的建立將有助于掃清寄生蜂分子調(diào)控理論研究和害蟲生物防治應(yīng)用的技術(shù)瓶頸。另外，通過分離昆蟲的腸道共生菌，通過遺傳改造特定共生菌，使其作為在昆蟲體內(nèi)穩(wěn)定表達dsRNA 的媒介。以微生物為媒介的RNAi 方法可作為提高寄生蜂RNAi 效率的重要思路。

此外，隨著RNAi 農(nóng)藥等新型殺蟲劑的研發(fā)與應(yīng)用，相關(guān)RNAi 殺蟲劑對寄生蜂等天敵昆蟲的脫靶效應(yīng)和安全性也值得深入研究。因此，建立寄生蜂類群的RNAi 方法對寄生蜂的分子機理、生理調(diào)控、生物防治應(yīng)用、RNAi 農(nóng)藥安全性評價等諸多方面均具有重要意義。