S-腺苷-L-甲硫氨酸依賴的3-氨基-3-羧基丙基利用酶研究進展

何家樂 董敏

（天津大學(xué)化工學(xué)院 天津大學(xué)系統(tǒng)生物工程教育部重點實驗室，天津 300072）

S?腺苷?L?甲硫氨酸（S?adenosyl?L?methionine，SAM）是除三磷酸腺苷（ATP）外，被有機體應(yīng)用最廣泛的輔因子［1］。SAM 分子中的硫原子通過3 個C?S 鍵分別與甲基、5'?脫氧腺苷（5'?deoxyadenosine，5'?dA）和3?氨基?3?羧基丙基（3?amino?3?carboxy?propyl,ACP）相連，由于形成的锍鎓結(jié)構(gòu)，這3 個C?S鍵都不穩(wěn)定［2］。有機體中不同的SAM 依賴酶可以選擇性地裂解其中不同的C?S 鍵來催化各種生化反應(yīng)（圖1）。SAM 最常見的應(yīng)用方式是作為甲基轉(zhuǎn)移酶的甲基供體［3］。另外，SAM 自由基酶可以催化SAM中C5'?dA?S 均裂，產(chǎn)生5'?脫氧腺苷自由基（5'?dA·），從而引發(fā)底物發(fā)生一系列化學(xué)上困難的轉(zhuǎn)化［4］。與甲基和5'?dA 的廣泛應(yīng)用相比，目前僅有少量利用SAM 中ACP 基團的酶被報道，本文中將這一類酶統(tǒng)稱為ACP 利用酶（ACP utilizing enzyme），文中主要介紹當(dāng)前已發(fā)現(xiàn)的ACP 利用酶催化的反應(yīng)類型、反應(yīng)機制和含有ACP 修飾的對應(yīng)產(chǎn)物的生理功能。

圖1 SAM 依賴酶催化的3 種不同的C-S 鍵斷裂反應(yīng)Fig. 1 Three kinds of C-S bond cleavage reactions of SAM dependent enzymes

目前已知的ACP 利用酶從功能上主要分為兩類：第一類ACP 利用酶能夠以SAM 作為ACP 供體，將ACP 基團轉(zhuǎn)移至相應(yīng)的底物，如RNA、蛋白質(zhì)及各類小分子代謝產(chǎn)物，故稱之為ACP 轉(zhuǎn)移酶。ACP轉(zhuǎn)移反應(yīng)從機制上有極性機理和自由機理兩種不同的反應(yīng)機制（表1）。第二類ACP 利用酶則是催化SAM 的ACP 基團發(fā)生分子內(nèi)的環(huán)化反應(yīng)，生成氨基環(huán)丙基?1?甲酸（1?aminocyclopropane?1?carboxylic acid，ACC）或氮雜環(huán)丁烷2?甲酸（azetidine 2?car?boxylic acid，AZC），ACC 和AZC 可以作為構(gòu)建模塊被引入非核糖體肽或聚酮類天然產(chǎn)物中，所以將其稱為ACP 環(huán)化酶。

表1 ACP 利用酶總結(jié)Table 1 Summary of ACP utilizing enzymes

1 ACP 轉(zhuǎn)移酶

ACP 轉(zhuǎn)移酶的反應(yīng)機制有極性機理和自由基機理兩種。由于N、O 原子親核性較強，目前發(fā)現(xiàn)的N、O 上的ACP 轉(zhuǎn)移反應(yīng)都是通過極性機理進行的。同時電子云密度較高的烯胺碳原子上的ACP 轉(zhuǎn)移反應(yīng)也是通過極性機理進行。組氨酸咪唑環(huán)的C2 位由于電子云密度低，親核性相對較差，所以該位置上的ACP 轉(zhuǎn)移反應(yīng)是目前報道的唯一通過自由基機理完成的ACP 轉(zhuǎn)移反應(yīng)［19］。

1.1 極性機理的ACP轉(zhuǎn)移酶

1.1.1 修飾RNA 的ACP 轉(zhuǎn)移酶 懷丁苷（wybuto?sine，yW）是一種被高度修飾的核苷，特異地存在于真核生物tRNAPhe的37 位［20］。yW 可以通過其體積龐大的疏水結(jié)構(gòu)穩(wěn)定tRNAPhe反密碼環(huán)的構(gòu)象，同時能夠維持苯丙氨酸（Phe）閱讀框的穩(wěn)定，提高翻譯過程的準確性［21］。yW 在酵母中的生物合成過程如下：首先SAM 依賴的RNA 甲基轉(zhuǎn)移酶Trm5 催化G?37N1 上的甲基化，生成m1G?37［22］。隨后SAM 自由基酶TYW1 催化形成4?去甲基丫苷（4?demethylwyosine,imG?14）［23］。然后SAM 依賴的ACP 轉(zhuǎn)移酶TYW2催化imG?14 C7 上的ACP 烷基化［24］。接著甲基轉(zhuǎn)移酶TYW3 催化N4 上的甲基化。最后由雙功能酶TYW4 催化ACP 側(cè)鏈上羧基的甲基化和氨基的甲氧羰基化，最終得到y(tǒng)W［24］（圖2?a）。原核細胞中不存在yW，但Umitsu 等［5］發(fā)現(xiàn)兩種來源于古細菌的TYW2 同源蛋白MjTYW2 和PhTYW2 在體外具有與酵母TYW2 相同的ACP 轉(zhuǎn)移活性。晶體結(jié)構(gòu)表明TYW2 在結(jié)構(gòu)上與I 類SAM 依賴的甲基轉(zhuǎn)移酶相似［25-27］，且TYW2 中結(jié)合SAM 腺苷和核糖部分的保守基序也與I 類甲基轉(zhuǎn)移酶類似，但二者結(jié)合ACP 基團的方式則顯著不同。在I 類甲基轉(zhuǎn)移酶Trm5 中，SAM 的ACP 基團結(jié)合在由DX3GXG 基序所形成的腔（M 腔）內(nèi)，而甲基朝向底物結(jié)合口袋一側(cè)［28］。TYW2 中同樣存在由DX3GXG 形成的M腔，但TYW2 中的M 腔被一個空間位阻很大的氨基酸殘基所占據(jù)，在不同種屬的TYW2 中，該基團可以是His 或Tyr。所以ACP 基團無法進入TYW2 的M 腔，而是結(jié)合在由MXSX2NX3R/K 基序形成的A腔中。正是這種特殊的ACP 基團結(jié)合方式，使得TYW2 具有了ACP 轉(zhuǎn)移酶的活性［5］。

圖2 參與RNA 轉(zhuǎn)錄后修飾的ACP 轉(zhuǎn)移酶TYW2（a）, Tsr3（b）和YfiP（c）Fig. 2 ACP transferase TYW2 (a), Tsr3 (b) and YfiP (c) involved in RNA modification

真核生物核糖體小亞基的18S rRNA 中存在保守的N1?甲基?N3?（3?氨基?3?羧基丙基）-假尿嘧啶（m1ACP3ψ）修飾［29］。以酵母為例，該修飾的生物合成步驟分為三步：首先18S rRNA 的尿苷U?1191被小核仁核糖核蛋白顆粒（snoRNP）催化轉(zhuǎn)化為假尿嘧啶（ψ-1191）［30］，然后RNA 甲基轉(zhuǎn)移酶Nep1催化ψ-1191 嘧啶環(huán)上N1 的甲基化反應(yīng)，生成m1ψ-1191［31-32］，最后由Tsr3 催化m1ψ-1191 嘧啶環(huán)上N3的ACP 轉(zhuǎn)移反應(yīng)，生成最終產(chǎn)物m1ACP3ψ［6］（圖2?b）。其中，Tsr3 是SAM 依賴的ACP 轉(zhuǎn)移酶，生成產(chǎn)物m1ACP3ψ 的同時，將SAM 轉(zhuǎn)變?yōu)?'?甲基硫代腺苷（5'?methylthioadenosine，MTA）。Tsr3 也能夠接受尿苷U 作為底物，催化其N3 上的ACP 轉(zhuǎn)移反應(yīng)，生成ACP3U 修飾［33］。m1ACP3ψ 與18S rRNA 的成熟過程有關(guān)，敲除酵母中Tsr3基因，會導(dǎo)致20S rRNA的積累［34］。Tsr3 含有D/EXS/TW（DTW）保守基序，該基序?qū)τ贏CP 轉(zhuǎn)移活性至關(guān)重要［6］。通過解析來源于古細菌中Tsr3 同源蛋白VdTsr3 和SsTsr3 的晶體結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，Tsr3 在結(jié)構(gòu)上與SPOUT 類RNA 甲基轉(zhuǎn)移酶類似［35］。Tsr3 和Tyw2 在結(jié)構(gòu)上的相似性很低，但采用了相似的策略來結(jié)合SAM 以保證ACP轉(zhuǎn)移反應(yīng)的發(fā)生，而非更常見甲基轉(zhuǎn)移反應(yīng)。在Tsr3 中SAM 的甲基處在不利于反應(yīng)的位置上，而ACP 基團處于更有利反應(yīng)的位置。RNA 甲基轉(zhuǎn)移酶Trm10 與Tsr3 結(jié)構(gòu)相似，但Trm10 結(jié)合SAM 的方式與Tsr3 正相反，在Trm10 中，SAM 的ACP 基團被包埋在蛋白內(nèi)部，而甲基部分暴露于底物RNA 的結(jié)合位點附近［35］。Tsr3 可能是由甲基轉(zhuǎn)移酶進化而來，通過改變SAM 在活性口袋中的結(jié)合方式而獲得了ACP 轉(zhuǎn)移能力。

大腸桿菌的多種tRNA 中都含有ACP3U 修飾［36］，最近，Meyer 等［7］揭示了ACP3U 生物合成的酶學(xué)機理。來源于大腸桿菌的YfiP 是Tsr3 的同源蛋白，但大腸桿菌小核糖體亞基RNA 中并沒有m1ACP3ψ 或ACP3U 兩種轉(zhuǎn)錄后修飾，而是在多種tRNA 可變環(huán)上都含有ACP3U?47 修飾［37］。Meyer等［7］發(fā)現(xiàn)YfiP 能夠?qū)AM 中的ACP 基團轉(zhuǎn)移到tRNA 47 位尿嘧啶核苷的N3 上，生成tRNA 的ACP3U 修飾（圖2?c）。YfiP 序列中也含有D/EXS/TW（DTW）保守基序［6］。YfiP 及其同源蛋白在N 端區(qū)域中都存在用于結(jié)合鋅離子的保守基序——CX2CX6CXC，實驗表明YfiP 是一個鋅結(jié)合蛋白，且對應(yīng)的結(jié)合域是活性必需［7］。大腸桿菌tRNA ACP3U修飾的生理學(xué)意義目前并不清楚。哺乳動物tRNA中同樣存在ACP3U 修飾，例如tRNATyrD 環(huán)中的ACP3U20 和tRNAAsn的ACP3U20a［38］。人類基因組中的DTWD1 和DTWD2 中也存在DTW 結(jié)構(gòu)域，Li 等［38］發(fā)現(xiàn)DTWD1 和DTWD2 都能夠合成ACP3U，但二者對于tRNA 的底物選擇性不同。DTWD1 或DTWD2單敲除導(dǎo)致細胞生長減緩，而DTWD1?DTWD2 雙敲除則導(dǎo)致嚴重的生長缺陷，表明ACP3U 修飾在哺乳動物細胞中具有更為重要的生理學(xué)意義。

1.1.2 植物煙草胺合酶、古細菌熱煙草胺合酶和細菌類煙草胺合酶 煙草胺（nicotianamine，NA）是一種在植物中廣泛存在的金屬螯合劑［39］，對植物體中Fe2+、Fe3+、Cu2+、Zn2+、Mn2+、Ni3+、Co2+等金屬離子的穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要［40-41］。金屬離子只有與NA形成絡(luò)合物，才可以實現(xiàn)其在植物體內(nèi)的長距離運輸［42］。同時，NA 也是植物鐵載體的生物合成前體［43］，植物釋放鐵載體到根際土壤中，鐵載體能夠與Fe3+絡(luò)合，使Fe3+以絡(luò)合物的形式被植物體吸收［44］。煙草胺合酶（NA synthase，NAS）負責(zé)NA 的生物合成，NAS 利用了三分子SAM 的ACP 基團合成NA，相應(yīng)的生成三分子的MTA，其中一分子ACP 環(huán)化，形成氮雜環(huán)丁烷2?甲酸（AZC）結(jié)構(gòu)［8,45］（圖3?a）。與其他的ACP 轉(zhuǎn)移酶相比，NAS僅以SAM 作為底物，沒有其他額外的ACP 受體，而且能夠催化連續(xù)兩次的ACP 轉(zhuǎn)移反應(yīng)，并且NAS還兼有ACP 環(huán)化酶和ACP 轉(zhuǎn)移酶的特征。nas基因并非植物所獨有，在真菌和古細菌中同樣發(fā)現(xiàn)了nas的同源基因［46］。Dreyfus 等［9］研究了來源于熱自養(yǎng)甲烷嗜熱桿菌的NAS 同源蛋白MtNAS，然而，MtNAS 的催化產(chǎn)物并非NA，而是將NA 中AZC 部分替代為Glu 的NA 類似物，該化合物被稱作熱煙草胺（thermoNicotianamine，tNA）。tNA 由MtNAS 催化兩分子SAM 和一分子的Glu 合成。通過研究MtNAS 與底物復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，MtNAS 通過同一個活性位點（S1）催化兩次ACP 轉(zhuǎn)移反應(yīng)。首先Glu 與SAM 在S1 位點形成中間體Glu1?AP2，而后該中間體被自發(fā)地轉(zhuǎn)入更深的S2?S3 位點。第二分子SAM 進入S1 位點后發(fā)生第二次ACP 轉(zhuǎn)移反應(yīng)，生成最終產(chǎn)物tNA（Glu1?AP2?AP3）［47］（圖3?b）。

圖3 煙草胺合酶（a）、熱煙草胺合酶（b）與類煙草胺合酶（c）催化的反應(yīng)Fig. 3 Reactions catalyzed by NAS (a)、MtNAS (b) and CntL (c)

Ghssein 等［10］進一步在細菌中尋找NAS 同源基因，成功發(fā)現(xiàn)了來源于金黃色葡萄球菌的cntL。CntL 與NAS 僅有12%的序列相似性，親緣關(guān)系較遠，但CntL 與NAS 和MtNAS 具有相似的結(jié)構(gòu)。CntL參與staphylopine 的生物合成，其生物合成通路如下［10］：首先，組氨酸消旋酶CntK 催化L?His 轉(zhuǎn)化為D?His；然后CntL 催化SAM 的ACP 基團轉(zhuǎn)移到D?His 的α-氨基氮原子上，形成中間體xNA；最后，CntM 催化xNA 與丙酮酸（pyruvic acid, PA）的還原縮合，生成最終產(chǎn)物staphylopine 同時消耗一分子NADPH（圖3?c）。此后在銅綠假單胞菌和鼠疫桿菌中分別發(fā)現(xiàn)了CntL 的同源基因。在鼠疫桿菌中，CntL 參與yersinopine（L?His?ACP?PA） 的生物合成，該化合物與staphylopine（D?His?ACP?PA）的區(qū)別僅在于His 部分的構(gòu)型不同［48］。鼠疫桿菌中缺少CntK，故CntL 以L?His 作為ACP 基團受體。而在銅綠假單胞菌中，CntL 參與pseudopaline（L?His?ACP?KGA）的生物合成，pseudopaline 由L?His、ACP 和α-酮戊二酸（KGA）構(gòu)成［49］。Laffont 等隨后在膠凍樣類芽孢桿菌中發(fā)現(xiàn)了D?His?ACP?KGA 的存在，將其命名為bacillopaline［50］。這些化合物統(tǒng)稱為類NA 金屬載體。病原微生物侵染宿主后，宿主會通過營養(yǎng)免疫產(chǎn)生對病原微生物的營養(yǎng)脅迫，而銅綠假單胞菌等病原微生物，通過產(chǎn)生類NA 金屬載體恢復(fù)對Fe2+、Cu2+、Zn2+等金屬離子的吸收［51］，因此可以開發(fā)以CntL 為靶點的新型抗生素。

1.1.3 其他極性機理的ACP 轉(zhuǎn)移酶 Nocardicin A是由放線菌產(chǎn)生的單環(huán)β-內(nèi)酰胺類抗生素，SAM 依賴的ACP 轉(zhuǎn)移酶NAT 將SAM 的ACP 基團轉(zhuǎn)移到nocardicin E 的酚羥基上，得到isonocardicin A，然后再由異構(gòu)酶催化其ACP 側(cè)鏈中Cα異構(gòu)化，得到最終產(chǎn)物Nocardicin A［13］（圖4?a）。NAT 的ACP 受體在結(jié)構(gòu)類似于兒茶酚O?甲基轉(zhuǎn)移酶底物。NAT 與兒茶酚O?甲基轉(zhuǎn)移酶二者之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系和造成二者活性差異的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)還有待進一步研究。

圖4 其他極性機理的ACP 轉(zhuǎn)移酶Fig. 4 ACP transferases with polar mechanism

甜菜堿脂（betaine lipids）是磷脂酰膽堿的類似物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)為二酰基甘油?N,N,N?三甲基高絲氨酸（DTGS）。甜菜堿脂能夠幫助細菌、真菌和植物應(yīng)對環(huán)境中磷酸脅迫。其生物合成過程分為兩步［14］：首先BtaA 將SAM 中的ACP 基團轉(zhuǎn)移到二酰甘油（DAG）的羥基上，生成二酰甘油高絲氨酸（DGHS），而后甲基轉(zhuǎn)移酶BtaB 催化DGHS 高絲氨酸側(cè)鏈N 原子上連續(xù)三次的甲基轉(zhuǎn)移反應(yīng)，生成產(chǎn)物DTGS（圖4?b）。很多BtaA 同源蛋白的N 端都含有12-15 個堿性和疏水的氨基酸殘基，且C 端含有一段延展的寡肽。這兩個結(jié)構(gòu)域可能通過形成兩親性的α-螺旋將BtaA 錨定在細胞膜上，且N 端結(jié)構(gòu)域中的堿性氨基酸殘基能夠與帶負電荷的生物膜形成穩(wěn)定的靜電相互作用［14］?？紤]到甜菜堿脂的主要生理作用是在磷酸脅迫的環(huán)境下替換生物膜中的磷脂，BtaA 結(jié)合在生物膜上的特點也是與其功能相適應(yīng)的。

在香豌豆種子中，主要存在兩種異惡唑啉酮衍生物：2?（3?氨基?3?羧基丙基）?異惡唑啉?5?酮（ACI）和β-（異惡唑啉?5?酮?2?基）?L?丙氨酸（BIA），二者的區(qū)別僅在于側(cè)鏈上相差一個亞甲基。其中BIA 由胱氨酸合酶催化異惡唑啉?5?酮和O?乙酰?L?絲氨酸合成［52］，雖然ACI 與BIA 結(jié)構(gòu)相似，但二者的生物合成過程有很大區(qū)別。ACI 中的2?氨基丁酸側(cè)鏈來源于SAM 而非L?高絲氨酸（圖4?c）。利用從香豌豆種子的部分純化的粗酶，可以實現(xiàn)ACI 的體外生物合成，該過程依賴Mg2+和ATP 的存在［53］，目前已知的利用SAM 中ACP 基團的酶中，還沒有依賴Mg2+和ATP 的例子。但該酶的編碼基因還未知，其催化機理有待進一步的研究。

盤基網(wǎng)柄菌產(chǎn)生的化合物discadinine 中也含有來源于SAM 的ACP 側(cè)鏈。Discadinine 是一種腺嘌呤衍生物，能夠抑制盤基網(wǎng)柄菌自身孢子的萌發(fā)。盤基網(wǎng)柄菌的細胞提取物可以催化SAM 的ACP 基團轉(zhuǎn)移到N6?（Δ2?異戊烯基）?腺嘌呤的N3 上，生成產(chǎn)物discadinine［54］（圖4?d）。Discadinine 合酶的編碼基因也依然未知。

1.2 自由基機理的ACP轉(zhuǎn)移酶（非經(jīng)典SAM自由基酶）

白喉酰胺（diphthamide）是真核生物和古細菌蛋白質(zhì)翻譯延伸因子EF2 上特定組氨酸（histidine，His）殘基的翻譯后修飾［55］，EF2 參與核糖體蛋白的翻譯過程，通過水解GTP 催化核糖體在mRNA 上的移位［56］。白喉毒素能夠特異性識別白喉酰胺，并催化白喉酰胺N1 上的ADP?核糖化，該反應(yīng)導(dǎo)致EF2 失活，影響宿主細胞中蛋白質(zhì)的合成［57］。在古細菌中，Dph2 催化白喉酰胺生物合成的第一步反應(yīng)，Dph2 以SAM 作為ACP 供體，通過自由基機理催化EF2 組氨酸殘基ACP 烷基化［15］。Dph2 屬于SAM 自由基酶家族，SAM 自由基酶是迄今發(fā)現(xiàn)最大的酶家族之一。其分子中都含有至少一個［4Fe?4S］簇，通過還原態(tài)的［4Fe?4S］簇向SAM 中傳遞電子，使SAM 中C5'?dA?S 均裂，產(chǎn)生5'?脫氧腺苷自由基（5'?dA·），而5'?dA·進一步攫取底物上的氫原子，產(chǎn)生5'?dA和底物自由基，利用自由基機理實現(xiàn)底物的轉(zhuǎn)化［4］。由于Dph2 還原裂解SAM 的Cγ,Met?S 而不是C5'?dA?S，且序列中不含一般的SAM 自由基酶的保守半胱氨酸基序所以被稱為非經(jīng)典SAM 自由酶。

Dong 等［58］通過快速冷凍淬滅（RFQ）捕捉Dph2 的反應(yīng)中間體，并用電子順磁共振（EPR）和電子-核雙共振（ENDOR）對捕捉到的反應(yīng)中間體進行表征，提出了Dph2 催化EF2 的His 殘基C2 位ACP 烷基化反應(yīng)的酶學(xué)機理。首先，Dph2 鐵硫簇通過向SAM 中Cγ,Met傳遞兩個電子，形成MTA 和有機金屬中間體I，在底物EF2 存在下，有機金屬中間體I 中的Cγ,Met?Fe 均裂釋放ACP 自由基，ACP 自由基與EF2 上His 反應(yīng)，生成有機自由基中間體II。中間體II 失去一個質(zhì)子和一個電子后，最終形成ACP 修飾的His 殘基（圖5）。

圖5 非經(jīng)典SAM 自由基酶Dph2 的催化機理Fig. 5 Catalytic mechanism of noncanonical radical SAM enzymme Dph2

2 ACP 環(huán)化酶

目前發(fā)現(xiàn)的ACP 環(huán)化酶主要是催化SAM 的ACP 基團分子內(nèi)環(huán)化，生成ACC 和AZC 兩種小分子。PLP 依賴酶SbzP 雖然不能將ACP 基團環(huán)化為ACC或AZC，但能夠催化ACP 與β-NAD 的3+2 環(huán)化且SbzP 與ACC 合酶機理相近，故將SbzP 歸于此類討論。

2.1 ACP自身的環(huán)化反應(yīng)

2.1.1 植物及細菌ACC 合酶 氨基環(huán)丙基?1?甲酸（ACC）是植物激素乙烯的生物合成前體［59］，ACC由ACC 合酶（ACC synthase，ACS）以SAM 為前體催化合成［17］。ACC 氧化酶進一步將ACC 轉(zhuǎn)化生成乙烯［60］。因為乙烯能夠促進果實成熟、花瓣和葉片脫落，這也導(dǎo)致了果蔬、鮮花的儲運過程中的大量損失，所以開發(fā)ACC 合酶抑制劑能獲得更好的經(jīng)濟效益。ACS 是一種PLP 依賴酶，其催化機理如下［61］：（1）ACS 活性位點內(nèi)保守的賴氨酸（Lys）殘基的ε-氨基與PLP 的甲?；撍s合，此時PLP 通過C=N鏈接到酶上，形成“內(nèi)部醛亞胺”。（2）SAM 分子中甲硫氨酸（Met）的α-氨基的親核進攻“內(nèi)部醛亞胺”，使其與PLP 之間形成“外部醛亞胺”，而Lys ε-氨基重新游離出來。（3）Lys ε-氨基進攻SAM中Met 的α-碳原子，形成共振雜化的碳負離子中間體，即“醌型中間體”。（4）“醌型中間體”恢復(fù)到芳香結(jié)構(gòu)，引發(fā)一系列的電子傳遞，最終導(dǎo)致甲硫氨酸中Cγ?S 鍵的斷裂，MTA 釋放。（5）去質(zhì)子化的Lys ε-氨基進攻PLP 的C4'，重新生成“內(nèi)部醛亞胺”，產(chǎn)物ACC 被釋放出來，完成一個催化循環(huán)（圖6?a）。

圖6 ACC 合酶的催化機理及其他ACP 環(huán)化酶催化的反應(yīng)Fig. 6 Catalytic mechanism of ACS and reactions catalyzed by ACP cyclases

廣南霉素（guangnanmycins）由非核糖體肽合酶-聚酮合酶系統(tǒng)（NRPS?PKS）催化合成，其分子也含有ACC 結(jié)構(gòu)單元。雖然ACC 合酶在種子植物中廣泛存在，但在細菌中并無ACC 合酶同源基因發(fā)現(xiàn)。Pan 等［62］發(fā)現(xiàn)了廣南霉素生物合成基因簇中GnmY具有ACC 合酶的活性。序列分析表明，GnmY 屬于PLP 依賴的天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶超家族，與植物來源的ACC 合酶僅有較低的序列相似性。GnmY 是首次報道的細菌來源的ACC 合酶。

大腸桿菌素（colibactin）是一種由大腸桿菌產(chǎn)生的基因毒素，常見于結(jié)腸癌和腸炎患者的病理組織中［63］，其分子內(nèi)的環(huán)丙基是一種具有高反應(yīng)活性的DNA 烷化劑，能夠?qū)е翫NA 損傷［64］。大腸桿菌素的生物合成過程中同樣也利用到了SAM 的ACP基團形成ACC 結(jié)構(gòu)，但與廣南霉素生物合成中先利用SAM 生成ACC，再將ACC 作為結(jié)構(gòu)組件整合到廣南霉素骨架中的機理不同，參與大腸桿菌素生物合成的非核糖體肽合酶ClbH 能夠直接活化SAM 并將其整合到自身的肽酰載體蛋白（PCP）結(jié)構(gòu)域上［65］。Zha 等［65］證明了SAM 是ClbH?A2 結(jié)構(gòu)域的底物，并通過質(zhì)譜確認了SAM 能夠共價連接到ClbH 的PCP 結(jié)構(gòu)域上。連接在ClbH?PCP 上的SAM 利用其ACP 基團的氨基與來自上游的生物合成中間體形成酰胺鍵以后，由聚酮合酶ClbI 負責(zé)SAM 環(huán)化形成ACC 結(jié)構(gòu)（圖6?b）。同樣是利用SAM 在天然產(chǎn)物中引入ACC 結(jié)構(gòu)，廣南霉素和大腸桿菌素的生物合成分別代表了兩種不同的策略。不依賴PLP 的ClbI 如何催化ACP 環(huán)化的，它與ACC 合酶的催化機理有何不同，這些問題還有待深入研究。

2.1.2 AZC 合酶 Azetidomonamides（ADA）是一類來源于銅綠假單胞菌的生物堿，其分子中含有獨特的氮雜環(huán)丁烷的結(jié)構(gòu)。Hong 等［18］鑒定出ADA 的生物合成的基因簇，并發(fā)現(xiàn)SAM 依賴酶AzeJ 能夠催化SAM 中ACP 基團的分子內(nèi)環(huán)化反應(yīng)，生成MTA和氮雜環(huán)丁烷2?甲酸（AZC）（圖6?c）。AzeJ 的同源基因分布廣泛，根據(jù)AzeJ 的同源酶可能發(fā)現(xiàn)更多的含有AZC 結(jié)構(gòu)的天然產(chǎn)物。然而，AzeJ 同源基因在植物中并不存在，但多種植物中都存在AZC，植物中的AZC 起源還有待進一步研究［66］。

Vioprolides 是一種由紫色孢囊桿菌產(chǎn)生的非核糖體肽，由于具有很強的細胞毒性和抗真菌活性［67］。其中Vioprolides A 和Vioprolides C 中含有特殊的4?甲基氮雜環(huán)丁烷羧酸（MAZ）結(jié)構(gòu)。Yan 等［68］發(fā)現(xiàn)VioH 和VioG 負責(zé)MAZ 的生物合成。VioH 能夠催化SAM 發(fā)生分子內(nèi)環(huán)化，生成AZC，AZC 再被VioG 催化生成MAZ［18］。吲哚類生物堿okamarine B、okamarine D 中的氮雜環(huán)丁烷結(jié)構(gòu)，由α-酮戊二酸依賴的雙加氧酶OkaE 催化線性結(jié)構(gòu)的前體分子內(nèi)環(huán)化而來［69］。而多氧霉素中氮雜環(huán)丁烷結(jié)構(gòu)以異亮氨酸為前體合成［70］，VioH 和AzeJ 代表了一種新的氮雜環(huán)丁烷的生物合成策略。VioH 具有與I 類甲基轉(zhuǎn)移酶類似的結(jié)合SAM 的保守基序。VioH 與I 類甲基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)上有何區(qū)別與聯(lián)系，哪些關(guān)鍵的氨基酸殘基決定了VioH 獨特的催化活性，這些問題還有待進一步研究。

2.2 ACP參與的環(huán)化反應(yīng)

Altemicidin 是一種由鏈霉菌產(chǎn)生的具有抗腫瘤活性的化合物，其結(jié)構(gòu)中含有特殊的6?氮雜四氫茚骨架［71］。Barra 等［16］發(fā)現(xiàn)SbzP 可以利用β-NAD 和SAM 催化合成Altemicidin 中的6?氮雜四氫茚骨架結(jié)構(gòu)。與植物ACS 一樣，SbzP 也是一種PLP 依賴酶，且同樣利用了SAM 分子中的ACP 基團，并產(chǎn)生MTA。SbzP 的催化過程中同樣也包括，“內(nèi)部醛亞胺”和“外部醛亞胺的”和“醌型中間體”生成，與植物ACS 合酶不同，SbzP 隨后催化SAM 中Met的Cβ的去質(zhì)子化從而導(dǎo)致MTA 的釋放并形成β，γ-不飽和醌，該結(jié)構(gòu)中的Cγ由于共軛而具有良好的親核性，Cγ進攻β-NAD 中吡啶環(huán)的C4 位，形成中間體I。隨后活性位點內(nèi)Lys 殘基進攻PLP 的C4'位使中間體I 的Cβ重新質(zhì)子化，β-NAD 中吡啶環(huán)的C5進攻Cα合成第二個C?C 鍵，最后環(huán)化產(chǎn)物釋放，酶的活性口袋內(nèi)重新形成“內(nèi)部醛亞胺”（圖6?d）。酶促反應(yīng)動力學(xué)表明，SbzP 以乒乓機制催化SAM 和β-NAD 的反應(yīng)，即SbzP 先與SAM 結(jié)合，釋放第一個產(chǎn)物MTA，同時產(chǎn)生活化的酶復(fù)合物（β，γ-不飽和醌），再與第二個底物β-NAD 結(jié)合催化得到最終產(chǎn)物。Barra 等［16］捕捉到了沒有β-NAD 存在時SbzP 與ACP 所形成的β，γ-不飽和醌，支持了乒乓機制。通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)了更多的sbzP同源基因，這些同源基因存在于不同的生物合成基因簇中，對這些生物合成基因簇進行研究可能會發(fā)現(xiàn)更多由β-NAD 衍生而來的天然產(chǎn)物。SbzP 的發(fā)現(xiàn)不僅是對ACP 利用酶的重要補充也是對β-NAD 生理學(xué)功能的重要補充。

3 ACP 變體轉(zhuǎn)移酶

生物體除了直接利用SAM 的ACP 基團外，還會以ACP 變體的形式加以利用。這部分主要介紹向底物分子引入氨基丙基修飾的酶，其中亞精胺合酶、精胺合酶等利用脫羧基SAM 作為氨基丙基供體，直接向底物中轉(zhuǎn)移氨基丙基。而參與微菌素C 生物合成的MccD，則是先利用SAM 向底物引入ACP，底物中ACP 脫羧以后形成氨基丙基修飾。微菌素C 與多胺生物合成中，都涉及到了向底物中引入氨基丙基修飾，但采用了兩種不同的生物合成策略。

3.1 亞精胺、精胺和熱精胺合酶

多胺是一類帶正電荷的小分子脂肪胺，其分子中至少含有兩個氮原子［72］。多胺幾乎存在于所有的生物體中，其種類主要有：腐胺（putrescine，Put）、亞精胺（spermidine，SPD）和精胺（spermine，SPM）［73］。多胺在細胞增殖和分化過程中起到重要作用［74］，同時也有助于生物體適應(yīng)環(huán)境脅迫［75］。亞精胺合酶（SPDS）催化脫羧基SAM（dc?SAM）的氨基丙基轉(zhuǎn)移到腐胺上形成亞精胺同時生成副產(chǎn)物MTA，其中dc?SAM 由SAM 脫羧酶催化SAM 脫羧而生成［11］。精胺合酶（SPMS）繼續(xù)催化亞精胺上的氨基丙基轉(zhuǎn)移反應(yīng)，從而生成精胺，該反應(yīng)同樣以dc?SAM 作為氨基丙基供體［76］。在噬熱菌中還存在另外一種亞精胺的生物合成通路，該過程涉及到TAAPT 催化的胍丁胺上的氨基丙基轉(zhuǎn)移反應(yīng)，TAAPT 是一類不同于SPDS 和SPMS 的氨基丙基轉(zhuǎn)移酶［77-78］。精胺是一種對稱的多胺，其結(jié)構(gòu)可以表示為［343］（數(shù)字表示氮原子之間的亞甲基的個數(shù)），而某些植物和細菌中的熱精胺合酶（TSPS）可以將氨基丙基轉(zhuǎn)移到亞精胺另一端的氮原子上，生成不對稱多胺——熱精胺［433］［79］。

上述的腐胺、亞精胺、精胺和熱精胺等都是線性的直鏈多胺，此外噬熱菌中還含有支鏈多胺，如N4?二（氨基丙基）亞精胺［3（3）（3）4］和N4?氨基丙基亞精胺［3（3）4］［80］。這兩種支鏈多胺的生物合成過程中，涉及到一種特殊的氨基丙基轉(zhuǎn)移酶——BpsA［81］。BpsA 能夠催化底物亞精胺上連續(xù)兩次的氨基丙基轉(zhuǎn)移反應(yīng)，第一次氨基丙基轉(zhuǎn)移生成N4?氨基丙基亞精胺［3（3）4］，而后進一步以N4?氨基丙基亞精胺作為底物發(fā)生第二次氨基丙基轉(zhuǎn)移，得到最終產(chǎn)物N4?二（氨基丙基）亞精胺（圖7?a）。SPDS、SPMS、TSPS 等氨基丙基轉(zhuǎn)移酶催化反應(yīng)的機理都是SN2 取代反應(yīng)，而BpsA 則是通過乒乓機理催化反應(yīng)，即BpsA 先與一分子的dcSAM結(jié)合，釋放MTA，得到氨基丙基化的酶，修飾后的酶再與底物亞精胺（或N4?氨基丙基亞精胺）結(jié)合，釋放產(chǎn)物N4?氨基丙基亞精胺（或N4?二（氨基丙基）亞精胺），同時BpsA 恢復(fù)到最初狀態(tài)，完成一次催化循環(huán)［82］。

圖7 兩種不同的氨基丙基修飾策略Fig. 7 Two different strategies for aminopropyl modification

3.2 參與微菌素C生物合成的MccD

微菌素C（microcin C）是一種由大腸桿菌產(chǎn)生的肽酰核苷酸類抗生素［83］，微菌素C 進入細胞后被氨肽酶水解成天冬氨酰氨基丙基腺苷酸，該物質(zhì)可以抑制天冬氨酰?tRNA 合成酶的活性，從而影響蛋白質(zhì)的合成［84］。微菌素C 的化學(xué)結(jié)構(gòu)是一個翻譯后修飾的七肽，其中C 端天冬氨酸的α-羧基通過氨基磷酸酯鍵與腺苷相連，在磷酸基團上引入氨基丙基的修飾能夠極大地提高微菌素C 的生物學(xué)活性［85］。微菌素C 的生物合成過程如下：首先，核糖體肽MccA 在ATP 依賴酶MccB 的作用下形成氨基磷酸酯鍵與腺苷相連［86］，然后由ACP 轉(zhuǎn)移酶MccD 催化在磷酸基團上引入ACP，最后由MccE 催化ACP 側(cè)鏈脫酸［12］，從而最終形成氨基丙基修飾（圖7?b）。MccD 和MccE 都擁有良好的底物寬泛性，能夠向不同序列，不同長度的肽酰腺苷酸中引入氨基丙基修飾［12］。

4 總結(jié)與展望

綜上所述，可以發(fā)現(xiàn)不同種類的ACP 利用酶在系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系上距離較遠，例如其中既有PLP 依賴酶也有SAM 自由基酶。還有一些ACP 利用酶與SAM 依賴的甲基轉(zhuǎn)移酶序列相似性很高，都具有類似的結(jié)合SAM 的保守基序，僅是依靠活性口袋結(jié)構(gòu)上的細微差別實現(xiàn)了二者對SAM 中C?S 鍵的選擇性切斷。由于ACP 利用酶之間在序列上的共性較少，且部分ACP 利用酶與甲基轉(zhuǎn)移酶在序列上的差異并不顯著，導(dǎo)致對ACP 利用酶編碼基因的預(yù)測比較困難。深入地認識和理解ACP 轉(zhuǎn)移酶和甲基轉(zhuǎn)移酶對SAM 中C?S 鍵選擇性不同的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，有助于發(fā)現(xiàn)更多的ACP 利用酶。如果能夠?qū)崿F(xiàn)甲基轉(zhuǎn)移酶到相應(yīng)的ACP 轉(zhuǎn)移酶的理性設(shè)計，這將是對現(xiàn)有的酶工具的極大豐富。從目前發(fā)現(xiàn)的ACP 轉(zhuǎn)移反應(yīng)的底物來看，主要集中在以RNA 和小分子為底物，以蛋白質(zhì)為底物的翻譯后修飾僅有EF2 的白喉酰胺修飾一例。對照SAM 依賴的甲基轉(zhuǎn)移酶和SAM 自由基酶豐富的底物范圍，我們有理由相信有更多的ACP 相關(guān)的蛋白質(zhì)翻譯后修飾，甚至DNA 修飾的存在。同時，從C?S 鍵斷裂的酶反應(yīng)機制出發(fā)，目前發(fā)現(xiàn)的ACP 利用酶中大多以極性機制催化反應(yīng)轉(zhuǎn)移ACP。僅有Dph2 一例涉及ACP 自由基的產(chǎn)生。鑒于SAM自由基酶家族5'?dA·實現(xiàn)的多樣的反應(yīng)類型，我們預(yù)測有更多ACP 自由基參與的反應(yīng)存在。相信隨著對該領(lǐng)域的深入和研究手段的日益豐富，會有更多ACP 利用酶和新穎的酶機制被發(fā)現(xiàn)。