HPLC法測(cè)定抗骨髓炎片中綠原酸和秦皮乙素的含量

唐佳齊 何艷 王慶 黃琴 楊霞 張輝

基金項(xiàng)目：

湖南省教育廳科學(xué)研究?jī)?yōu)秀青年項(xiàng)目（20B543；20B542）；郴州市科技計(jì)劃項(xiàng)目重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目（zdnk202101）。

作者簡(jiǎn)介：唐佳齊（2002—），女，本科在讀，研究方向?yàn)橹兴庂|(zhì)量分析。 E-mail： 843922881@qq.com

通信作者：

何艷（1985—），女，碩士，副教授，研究方向?yàn)橹兴庂|(zhì)量分析。 E-mail： 526378710@qq.com

【摘? 要】

目的：建立高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定抗骨髓炎片中綠原酸、秦皮乙素含量的方法。方法：采用Thermo Hypersil Gold-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱，流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸溶液（9∶91），流速1.0 mL·min-1，柱溫30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為327 nm，進(jìn)樣量為10 μL。結(jié)果： 綠原酸、秦皮乙素分別在14.46～144.6 μg·mL-1（r=0.9999）、3.137～31.37 μg·mL-1（r=0.9999）范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好，平均回收率分別為98.65%（RSD=0.75%）、96.51%（RSD=1.58%）。結(jié)論：所建立的方法準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，可用于抗骨髓炎片中綠原酸和秦皮乙素含量的測(cè)定。

【關(guān)鍵詞】? 抗骨髓炎片；高效液相色譜；綠原酸；秦皮乙素；含量測(cè)定

【中圖分類(lèi)號(hào)】R284.1??? 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A??? 【文章編號(hào)】1007-8517（2023）22-0053-03

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2023.22.zgmzmjyyzz202322013

Determination of Chlorogenic Acid and Esculetin in Kanggusuiyan Tablets by HPLC

TANG Jiaqi? HE Yan*? WANG Qing? HUANG Qin? YANG Xia? ZHANG Hui

School of Pharmacy， Xiang Nan University， Chenzhou 423000， China

Abstract：

Objective To establish a method of determining chlorogenic acid and esculetin in Kanggusuiyan tablets by HPLC. Methods The samples was separated on the column Thermo Hypersil Gold-C18 （4.6 mm×250 mm， 5 μm）， which the mobile phase was consisted of acetonitrile and 0.1% phosphoric acid at 9∶91. The flow rate was 1.0 mL·min-1. The column temperature was set at 30 ℃，? the detection wavelength was 327 nm， and the injection volume was 10 μL. Results Good linear relationships were fund for chlorogenic acid and esculetin in the range of 14.46-144.6 μg·mL-1 （r=0.9999）， 3.137-31.37 μg·mL-1 （r=0.9999）， respectively. The average recoveries were 98.65%（RSD＝0.75%） for chlorogenic acid and 96.51%（RSD＝1.58%） for esculetin. Conclusion The method is accurate and reproducible， and can be applied in the content determination of chlorogenic acid and esculetin in Kanggusuiyan tablets．

Keywords：Kanggusuiyan Tablets; HPLC; Chlorogenic Acid; Esculetin; Content Determination

抗骨髓炎片收載在《中國(guó)藥典》2020年版一部中，由金銀花、蒲公英、紫花地丁、半枝蓮、白頭翁和白花蛇舌草組成的中藥復(fù)方制劑，具有清熱解毒、散瘀消腫之功效，用于熱毒血瘀所致附骨疽及骨髓炎等癥［1］?？构撬柩灼F(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅測(cè)定綠原酸的含量作為質(zhì)控指標(biāo)，相關(guān)文獻(xiàn)也僅有薄層掃描測(cè)定綠原酸［2］或HPLC測(cè)定白頭翁皂苷B4［3］的含量，質(zhì)控指標(biāo)單一，難以有效控制制劑質(zhì)量。方中金銀花清熱解毒、消炎退腫，蒲公英解熱涼血，兩者主要活性成分為綠原酸［4-5］；紫花地丁清熱解毒，治癰疽疔腫，其主要活性成分為秦皮乙素［6］。為此，為了更加全面地控制該制劑的質(zhì)量，本實(shí)驗(yàn)采用HPLC法測(cè)定抗骨髓炎片中綠原酸和秦皮乙素的含量，此法結(jié)果準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，為有效控制該制劑的質(zhì)量提供科學(xué)依據(jù)。

1? 儀器與材料

1.1? 儀器? Agilent 1260高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司），XSE-205電子天平（梅特勒-托利多公司，感量：0.01mg），DZKW-D電熱恒溫水浴鍋（北京市永明醫(yī)療儀器有限公司），KQ-500DE超聲清洗器（昆山超聲儀器有限公司）。

1.2? 材料? 綠原酸對(duì)照品（批號(hào)：110753-201817，含量：96.8%）、秦皮乙素對(duì)照品（批號(hào)：110741-201708，含量：99.9%）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品鑒定研究院?？构撬柩灼ㄈR陽(yáng)市江波制藥有限責(zé)任公司，批號(hào)：2111253、2203022、2203052），甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑、試藥均為分析純，水為超純水。

2? 方法與結(jié)果

2.1? 色譜條件? 色譜柱為T(mén)hermo Hypersil Gold-C18（4.6mm×250mm，5μm），流動(dòng)相為乙腈- 0.1%磷酸（9∶91），流速1.0mL·min-1，柱溫30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)327nm，進(jìn)樣量10μL。按上述色譜條件進(jìn)樣分析，綠原酸、秦皮乙素與其他色譜峰分離較好（分離度>1.5），且陰性樣品無(wú)干擾（如圖1）。

2.2? 對(duì)照品溶液的制備? 分別精密稱(chēng)取對(duì)照品綠原酸、秦皮乙素7.47mg、6.28mg，各置20mL量瓶中，用70%甲醇溶液定容至刻度。分別精密量取4mL、1mL置10mL量瓶中，得混合對(duì)照品儲(chǔ)備溶液（綠原酸144.6μg·mL-1、秦皮乙素31.37μg·mL-1）。

2.3? 供試品溶液的制備? 取抗骨髓炎片20片，除去糖衣，研細(xì)，精密稱(chēng)取0.8 g，置錐形瓶中，精密加入70%甲醇溶液50mL，稱(chēng)定重量，超聲（功率500W，頻率40kHz）提取30min，放冷至室溫，再稱(chēng)定重量，減失的重量用70%甲醇補(bǔ)足，搖勻，過(guò)0.45μm濾膜，即得。

2.4? 陰性樣品溶液的制備? 取按處方工藝制成不含蒲公英和金銀花、不含紫花地丁的陰性樣品，取適量研細(xì)，按“2.3”項(xiàng)下方法制成缺蒲公英和金銀花、缺紫花地丁的陰性樣品溶液。

2.5? 線(xiàn)性關(guān)系考察? 精密量取“2.2”項(xiàng)下的對(duì)照品溶液1.0mL、2.0mL、4.0mL、6.0mL、8.0mL、10mL，分別置于10mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，精密吸取10μL，注入高效液相色譜儀中，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定綠原酸和秦皮乙素的峰面積，以進(jìn)樣質(zhì)量濃度（μg·mL-1）為橫坐標(biāo)（X），峰面積（A）為縱坐標(biāo)（Y），進(jìn)行線(xiàn)性回歸。綠原酸、秦皮乙素分別在14.46～144.6μg·mL-1、3.137～31.37μg·mL-1范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好，回歸方程分別為Y=29.97X+0.0071（r=0.9999）、Y=28.59X－0.6687（r=0.9999）。

2.6? 精密度試驗(yàn)? 精密吸取混合對(duì)照品儲(chǔ)備溶液適量，用70%甲醇稀釋2倍，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，測(cè)定綠原酸、秦皮乙素的峰面積。結(jié)果綠原酸、秦皮乙素峰面積的RSD為0.15%、0.18% ，結(jié)果表明儀器的精密度良好。

2.7? 穩(wěn)定性試驗(yàn)? 精密吸取同一供試品（批號(hào)：2111253）溶液10 μL，分別在0h、3h、5h、7h、10h、12h依次進(jìn)樣，測(cè)定綠原酸、秦皮乙素的峰面積。結(jié)果綠原酸、秦皮乙素峰面積的RSD為0.43%、0.95% ，結(jié)果表明供試品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8? 重復(fù)性試驗(yàn)? 精密稱(chēng)取同一批樣品（批號(hào)：2111253）6份，照“2.3”項(xiàng)下制備，得6份供試品溶液，分別進(jìn)樣10μL，測(cè)定綠原酸、秦皮乙素的峰面積。結(jié)綠原酸、秦皮乙素含量分別為4.927mg·g-1、1.079mg·g-1，RSD分別為0.37%（n=6）、1.73%（n=6），表明該方法重復(fù)性較好。

2.9? 加樣回收率試驗(yàn)? 取已知含量的樣品（批號(hào)：2111253）6份，精密稱(chēng)取0.4 g，置具塞錐形瓶中，按1∶1的比例分別加入綠原酸、秦皮乙素對(duì)照品溶液（0.3833mg·mL-1綠原酸 5mL、0.4076mg·mL-1秦皮乙素1mL ），用70%甲醇補(bǔ)足至50mL，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品液，進(jìn)樣10μL，測(cè)定綠原酸、秦皮乙素峰面積，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算含量，并計(jì)算回收率，結(jié)果綠原酸、秦皮乙素平均回收率分別為98.65%（RSD= 0.75%）、96.51%（RSD= 1.58%），結(jié)果準(zhǔn)確度良好。見(jiàn)表1。

2.10? 含量測(cè)定? 取3個(gè)批次的抗骨髓炎片樣品，除去糖衣，研細(xì)，精密稱(chēng)取0.8g，按“2.3”項(xiàng)下方法各平行制備2份供試品溶液，分別吸取10μL，進(jìn)樣測(cè)定綠原酸、秦皮乙素峰面積，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算含量。見(jiàn)表2。

3? 討論

3.1? 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇? 采用二極管陣列檢測(cè)器在波長(zhǎng)190～400nm對(duì)綠原酸、秦皮乙素對(duì)照品溶液進(jìn)行紫外掃描，發(fā)現(xiàn)綠原酸在327nm、秦皮乙素在345nm具有最大吸收，綜合考慮故本文選用327nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.2? 色譜條件優(yōu)化? 依據(jù)文獻(xiàn)［7-8］方法，本文比較了甲醇-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.1%磷酸溶液作為流動(dòng)相，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用乙腈-0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相，綠原酸和秦皮乙素的分離效果較好，當(dāng)增加磷酸濃度時(shí)，2個(gè)成分色譜峰峰形無(wú)明顯變化，故選擇乙腈-0.1%磷酸作為流動(dòng)相。再考察了不同色譜柱［Agilent ZORBAX SB C18、SHIMADU Shim-pack-C18、Thermo Hypersil Gold-C18（250mm×4.6mm，5μm）］、不同儀器（Agilent 1260、SHIMADU LC-20AT ）對(duì)2個(gè)成分測(cè)定時(shí)分離效果的影響，結(jié)果均能實(shí)現(xiàn)較好的分離。

3.3? 供試品制備方法的選擇? 預(yù)實(shí)驗(yàn)采用不同溶劑（乙醇、70%乙醇、50%乙醇、甲醇、70%甲醇、50%甲醇）進(jìn)行超聲和加熱回流提取，結(jié)果顯示，采用70%甲醇超聲提取時(shí)，綠原酸和秦皮乙素提取率高，且峰形較佳，超聲提取能明顯縮短提取時(shí)間；再考察了超聲提取30min、40min、50min、60min，結(jié)果超聲提取40min時(shí)，綠原酸和秦皮乙素基本提取完全，故選擇超聲提取40min。

綜上所述，本研究采用HPLC法同時(shí)測(cè)定抗骨髓片中2種有效成分的含量，涵蓋了制劑中的君藥和臣藥，方法簡(jiǎn)單易行、專(zhuān)屬性好、準(zhǔn)確度高，為更為全面地控制抗骨髓炎片的質(zhì)量和完善其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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（收稿日期：2022-03-22? 編輯：劉? 斌）