復方蟾酥膠囊對小鼠Lewis肺癌移植瘤的藥效學研究

畢莉斯，謝春祥，趙榮華，劉樹民?

（1. 黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040；2. 黑龍江蟾寶生物科技發(fā)展有限公司，黑龍江 鶴崗 154100）

調(diào)查顯示，80%的肺癌患者就診時已是中晚期，其五年生存率不足14%［1］。大量研究表明，中醫(yī)藥在肺癌治療中具有多方面的優(yōu)勢和作用，不僅可以對腫瘤進行有效的控制，還能改善患者的免疫功能和生活質量，減輕藥物的毒副作用，提高治療效果和患者的生存率［2-4］。

復方蟾酥膠囊由蟾酥粉、蟾皮、龜甲、三棱、莪術和黃芪組成，具有解毒消腫、止痛、開竅醒神功效。以蟾酥為君藥進行組方，其中龜甲滋陰潛陽、退熱除蒸、軟堅散結，三棱和莪術破血行氣、消積止痛，黃芪補氣健脾、升陽舉陷、益衛(wèi)固表、利尿消腫、養(yǎng)血生津、行滯通痹、斂瘡生肌、托毒排膿，具有抑制肺癌腫瘤生長、遷移及一定程度的抗化療藥物耐藥的作用。因此，本實驗以C57BL/6J小鼠Lewis肺癌模型，采用不同劑量復方蟾酥膠囊（低、中、高劑量，分別為標準劑量的0.5、1、2倍）進行治療，采用ELISA 法、實時熒光定量PCR、蛋白免疫印跡技術（Western blot）、HE染色檢測小鼠腫瘤組織中TNF-α含量，Caspase-3、VEGF mRNA表達、蛋白表達及肺組織病理情況，明確復方蟾酥膠囊對抑制腫瘤生長的作用。

1 材料

1.1 藥物

復方蟾酥膠囊組成：蟾酥粉、蟾皮、龜甲、三棱、莪術和黃芪，由黑龍江蟾寶生物科技發(fā)展有限公司提供成方膠囊制劑，規(guī)格：0.35 g/粒，藥方來源和藥物含量暫屬保密階段。注射用順鉑粉（上海麥克林生化科技有限公司，批號：C14452924）。

1.2 動物

60 只SPF 級雄性C57BL/6J 小鼠，由遼寧長生生物技術股份有限公司提供，許可證號：SCXK（遼）2020-0001，鼠齡6～8 周，體質量（20 ± 2）g。均自由飲水及飲食，飼養(yǎng)環(huán)境溫度（20 ± 2）℃，相對濕度45%～70%。實驗動物及飼養(yǎng)條件符合《實驗動物管理條例》要求，適應性喂養(yǎng)1周后進行后續(xù)實驗。

1.3 細胞株

具有自發(fā)肺轉移潛能的高轉移小鼠Lewis 肺癌細胞株（LLC），移植率100%，購自賽百慷（上海）生物技術股份有限公司。

1.4 儀器

臺式低速離心機（安徽中科中佳科學儀器有限公司，型號：SC-04）；倒置顯微鏡（日本東京OLYMPUS，型號：CKX3-SLP）；游標卡尺（上海美耐特實業(yè)有限公司，型號：MNT-150）；超凈工作臺（上海力申科學儀器有限公司，型號：BIOsafe12）；細胞計數(shù)板（哈爾濱菲詩科技有限公司，型號：C10228）；二氧化碳培養(yǎng)箱（上海力申科學儀器有限公司，型號：HF90）；酶標儀（TECAN，型號：AP1603）；電泳儀（美國BIO-RAD，型號：Mini-Protean）；轉膜儀（美國BIO-RAD，型號：DYC-ZY2）；實 時 熒 光 定 量PCR（Themo Fisher Scientific，型號：Detecting System）；化學發(fā)光成像系統(tǒng)（上海勤翔科學儀器有限公司，型號：ChemiScope 6200）；石蠟包埋機（德國Leica，型號：EG1160）；病理組織切片機（德國Leica，型號：HS-2205）。

1.5 試劑

優(yōu)級胎牛血清（貨號：BL201A）、DMEM 培養(yǎng)液（貨號：BL304A）、胰酶細胞消化液（貨號：BL512A）、青霉素-鏈霉素溶液（貨號：BL505A）、1 × PBS 緩沖液（貨號：BL302A）均北京蘭杰柯科技有限公司。

小鼠腫瘤壞死因子-α（TNF-α）ELISA科研試劑盒（江蘇晶美生物科技有限公司，批號：202305）；Toyal RNA提取試劑（TAKARA，批號：910819109）；反轉錄試劑盒（TAKARA，批號：RR047A）、2 × SYBR Green（Selleck，批號：B21702）；蛋白裂解液（貨號：G2038-100 ML）、電泳液（貨號：CR2105176）、電轉液（貨號：G2057-1L）（武漢塞維爾生物科技有限公司）；BCA蛋白濃度測定試劑盒（碧云天生物技術有限公司，批號：P0010S）；Caspase-3 PIZ 兔抗（Selleck，批號：A5357），Anti-VEGF 兔抗（武漢塞維爾生物科技有限公司，批號：GB11034B），GAPDH兔抗（Selleck，批號：A5028），二抗羊抗兔IgG（H + L）-HRP（安諾倫生物科技有限公司，批號：BS13278）。

2 方法

2.1 模型小鼠的建立

復蘇培養(yǎng)LLC 細胞，當細胞生長狀態(tài)良好并處于對數(shù)生長期時收集細胞，使用PBS 稀釋細胞至2 × 106個/mL，吸取細胞懸液后，于C57BL/6J 小鼠右腋皮下進行注射（0.2 mL/只）。模型小鼠接種成功后，1周內(nèi)于小鼠右腋下可觸及腫塊。

2.2 分組及用藥方法

10 只空白組不予處理；腫瘤體積大于50 mm3時將50只小鼠隨機分為5組，每組10只。模型組灌胃生理鹽水；復方蟾酥膠囊組根據(jù)人的使用劑量（2.1 g/70 kg），按照體表面積折算法進行人和小鼠等效劑量換算，將小鼠中劑量代替人臨床劑量。經(jīng)前期預實驗研究探索，本研究將復方蟾酥膠囊用藥量分別定為低劑量0.136 5 g/（kg·d）、中 劑量0.273 g/（kg·d）、高 劑量0.546 g/（kg·d），將膠囊內(nèi)容物溶解于去離子水中灌胃給藥，0.2 mL/只；順鉑組給予順鉑隔日腹腔注射給藥，5 mg/（kg·d），0.2 mL/只。每日觀察精神狀態(tài)、活動度，隔2 日測體重、腫瘤體積及飲食飲水量，共給藥14 d。第15天，脫頸處死所有小鼠剝?nèi)∧[瘤及肺組織。

2.3 指標檢測

2.3.1 腫瘤抑制率

給藥14 d 后，各組小鼠脫頸處死，剝離腫瘤組織，稱質量。

2.3.2 ELISA法檢測TNF-α含量

按照1 mg 加入9 μL PBS 緩沖液的比例研磨腫瘤組織，提取上清液，根據(jù)ELISA 試劑盒說明書進行操作，在酶標儀中450 nm 處測定48 孔板各孔的OD 值，再計算TNF-α含量。

2.3.3 Real-time PCR 檢 測 Caspase-3、VEGF mRNA的表達

使用Trizol 試劑提取腫瘤細胞的總RNA。提取后，對RNA 進行濃度測量，并進行配平以確保實驗準確性。采用了熒光染料SYBR Green 進行實時熒光定量PCR 實驗。PCR 反應體系總共為20 μL，其中包括10 μL的SYBR Green熒光染料，每個上下游引物（濃度為10 μmol/L）各1 μL，稀釋后加入2 μL 的DNA 原液（初始濃度為2 μg），以及6 μL 的去離子水。PCR 反應條件設置如下：首先進行95 ℃的預變性步驟，時長為10 min；然后進行40 個循環(huán)的PCR 反應，每個循環(huán)包括95 ℃的變性步驟（15 s），60 ℃的退火步驟（30 s），以及72 ℃的擴增步驟（30 s）。在每個循環(huán)中同時讀取熒光數(shù)值。實驗完成后，進行熔解曲線分析。具體操作為：先進行一次95 ℃、15 s的變性步驟，并在60 ℃下保持1 min，然后從60 ℃至95 ℃，每增加0.5 ℃讀取一次吸光值，最后再進行一次95 ℃、15 s 的變性步驟，并讀取熒光數(shù)值。通過讀取Ct值，可以計算出ΔCt值（Ct目的基因-Ct 內(nèi)參GAPDH）、ΔΔCt 值（ΔΔCt 處理-ΔCt對照）和2-ΔΔCt值（相對表達量），并進行統(tǒng)計學分析。熒光定量PCR引物見表1。

表1 引物序列表

2.3.4 Western blot檢測Caspase-3、VEGF蛋白表達

取出瘤組織稱質量后放入玻璃勻漿器中，然后加入蛋白裂解液，將瘤組織樣本加入10 μL 的蛋白裂解液進行操作。通過這一步驟，成功提取了腫瘤組織中的總蛋白。為了確定提取到的蛋白質濃度，使用BCA法進行濃度測定。隨后，采用SDS-PAGE凝膠電泳技術對等量變性的蛋白樣品進行分離。電泳過程中分別設置了80 V、30 min 和120 V、60 min 的電流條件，以確保蛋白質在凝膠中得到充分分離。完成電泳后，采用半干法將蛋白轉移到膜上。然后使用含有5%脫脂奶粉的TBS/T 緩沖液對轉膜后的膜進行洗滌處理，搖床1.5 h。最后，將稀釋液稀釋的兔抗小鼠Caspase-3 抗體（1∶1 000）和VEGF 抗體（1∶500）分別加入處理后的膜中，孵育，4 ℃封閉過夜，用TBS/T 洗滌4 次，再加入HRP 標記的羊抗兔IgG（1∶10 000），搖床1 h，倒掉二抗，TBS/T 洗滌4 次，加入顯影液于暗室中顯影。膠片蛋白質條帶用化學發(fā)光成像系統(tǒng)分析。ImageJ軟件測定條帶灰度值并進行統(tǒng)計分析。

2.3.5 HE染色觀察各組肺組織病理變化

肺組織標本用生理鹽水清洗后，用4%多聚甲醛溶液浸泡固定，經(jīng)脫水、包埋后制成石蠟切片，常規(guī)脫蠟、水洗，采用蘇木素染色液浸染1.5 min后充分水洗，1%鹽酸乙醇褪色20 s，自來水沖洗使切片恢復藍色，伊紅染色10 min，自來水沖洗30 s，梯度乙醇脫水，二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ各浸泡10 min，中性樹膠封固，在20倍和200倍光學顯微鏡下觀察肺組織的形態(tài)并拍照保存。

2.4 統(tǒng)計學方法

應用SPSS 22.0 和Graph Pad Prism 8.0 統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料以±s表示，數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布及方差齊性后，應用歸一化及單因素方差分析進行數(shù)據(jù)處理，P＜ 0.05表明差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 小鼠一般情況比較

造模成功后給藥第4 天，模型組小鼠死亡1 只；給藥第6 天復方蟾酥膠囊低劑量組死亡1 只；給藥第11 天順鉑組死亡1 只、復方蟾酥膠囊低劑量組死亡2 只；給藥第13 天復方蟾酥膠囊中、高劑量組各死亡1 只。小鼠死亡前精神狀態(tài)差，全身顫抖，喘息樣呼吸，停止進食和飲水。取材結束后每組取6 個樣本進行實驗指標檢測。

3.2 各組小鼠瘤重和抑瘤率比較

與模型組比較，復方蟾酥膠囊中劑量組及順鉑組瘤重均顯著降低（P＜ 0.05），差異有統(tǒng)計學意義。見表2。

表2 各組小鼠瘤重和抑瘤率比較

3.3 各組小鼠肺癌組織TNF-α水平比較

與模型組比較，復方蟾酥膠囊中、高劑量組及順鉑組能降低TNF-α 含量（P＜ 0.05），差異有統(tǒng)計學意義。見表3。

表3 各組小鼠肺癌組織TNF-α水平比較（±s）

表3 各組小鼠肺癌組織TNF-α水平比較（±s）

注：與模型組比較，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01。

組別模型組順鉑組復方蟾酥膠囊低劑量組復方蟾酥膠囊中劑量組復方蟾酥膠囊高劑量組TNF-α/（ng/L）542.12 ± 21.67 358.20 ± 41.49**446.85 ± 108.37 369.34 ± 14.85*372.86 ± 31.21*n6 6 6 6 6

3.4 各組小鼠Caspase-3、VEGF mRNA 表達情況比較

與模型組比較，復方蟾酥膠囊中劑量組及順鉑組能顯著上調(diào)Caspase-3 mRNA 的表達（P＜ 0.05），顯著下調(diào)VEGF mRNA 的表達（P＜ 0.05），差異有統(tǒng)計學意義。見表4。

表4 各組小鼠Caspase-3、VEGF mRNA表達情況比較（±s）

表4 各組小鼠Caspase-3、VEGF mRNA表達情況比較（±s）

注：與模型組比較，**P ＜ 0.01，***P ＜ 0.001，****P ＜ 0.000 1。

組別模型組順鉑組復方蟾酥膠囊低劑量組復方蟾酥膠囊中劑量組復方蟾酥膠囊高劑量組VEGF 1.00 ± 0.36 0.47 ± 0.08***1.17 ± 0.08 0.57 ± 0.15**0.99 ± 0.14 n 6 6 6 6 6 Caspase-3 1.00 ± 0.44 2.23 ± 0.30****0.76 ± 0.14 1.78 ± 0.16**1.06 ± 0.18

3.5 各組小鼠Caspase-3、VEGF蛋白表達情況比較

與模型組比較，順鉑組Caspase-3 蛋白的表達顯著增高（P＜ 0.05），復方蟾酥膠囊中劑量組Caspase-3蛋白的表達增高（P＜ 0.05）；復方蟾酥膠囊中劑量組及順鉑組VEGF蛋白的表達顯著降低（P＜ 0.05），復方蟾酥膠囊低、高劑量組VEGF 蛋白的表達降低（P＜0.05），差異有統(tǒng)計學意義。見表5、圖1。

表5 各組小鼠Caspase-3、VEGF蛋白表達情況比較（±s）

表5 各組小鼠Caspase-3、VEGF蛋白表達情況比較（±s）

注：與模型組比較，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01，***P ＜ 0.001。

組別模型組順鉑組復方蟾酥膠囊低劑量組復方蟾酥膠囊中劑量組復方蟾酥膠囊高劑量組VEGF 1.00 0.47 ± 0.08***0.72 ± 0.20*0.55 ± 0.08**0.66 ± 0.09*n6 6 6 6 6 Caspase-3 1.00 1.94 ± 0.49**1.16 ± 0.28 1.79 ± 0.25*1.29 ± 0.23

圖1 各組小鼠Caspase-3、VEGF蛋白表達電泳圖

3.6 各組小鼠肺組織HE染色結果

空白組小鼠肺臟組織無明顯異常，未見明顯的炎性改變。模型組肺組織中多見肺泡壁增厚，伴有較多淋巴細胞與中性粒細胞浸潤，局部支氣管可見上皮細胞壞死，核碎裂，有明顯肺水腫及出血。順鉑組及復方蟾酥膠囊中劑量組肺組織中可見肺泡壁上有彌散的淋巴細胞與中性粒細胞浸潤，局部可見大量支氣管上皮細胞增生，可見較大量的肺泡腔擴張，肺水腫和出血情況大為減輕，肺泡腔內(nèi)有嗜酸性漿液樣物質滲出。復方蟾酥膠囊低、高劑量組肺組織中可見較多肺泡壁增厚，伴有彌散的淋巴細胞與中性粒細胞浸潤，多見肺泡腔擴張；少見支氣管上皮細胞壞死，核碎裂；局部組織邊緣可見肺水腫，肺泡腔內(nèi)有嗜酸性漿液樣物質滲出，周圍有較多水腫液及紅細胞，但較模型組少。見圖2。

圖2 小鼠肺組織HE染色結果

4 討論

肺癌是最復雜的疾病之一，其潛在機制尚不清楚。近年來中醫(yī)藥在肺癌的防治中發(fā)揮了很大作用，因此，進一步探究中藥復方抑制肺癌生長、轉移及作用機制意義重大。

蟾酥具有確切的抗腫瘤活性，能夠抑制腫瘤細胞的增殖、促進腫瘤細胞的分化、誘導腫瘤細胞的凋亡，還有逆轉耐藥性、抑制腫瘤血管形成、抑制腫瘤細胞侵襲轉移、阻滯細胞周期及增強免疫的作用［5］。炎癥反應貫穿于腫瘤疾病的始終，TNF-α的增多能夠增強腫瘤免疫活性，促進腫瘤細胞生長和遷移［6］。Caspase-3通過切割重要的細胞底物來執(zhí)行凋亡的下游執(zhí)行步驟，誘導腫瘤細胞凋亡，并導致細胞自噬死亡［7-9］。有實驗證明VEGF 可以促進血管活性分子產(chǎn)生，調(diào)節(jié)血管張力，免疫抑制腫瘤微環(huán)境，促進淋巴內(nèi)皮細胞生長和導致腫瘤細胞凋亡［10-14］。

本研究的復方蟾酥膠囊以蟾酥為君藥進行組方，研究結果顯示，受藥物濃度增加藥物溶解度降低及蟾酥毒性增強影響，高劑量組藥效低于中劑量組；與模型組比較，復方蟾酥膠囊中劑量組及順鉑組瘤質量顯著降低，能有效的抑制Lewis 肺癌腫瘤的生長。采用ELISA 法、PCR 與Western blot 檢測瘤組織中TNF-α含量，Caspase-3、VEGF 的表達，均顯示復方蟾酥膠囊中劑量組及順鉑組能降低TNF-α 含量，顯著上調(diào)Caspase-3 mRNA 及蛋白的表達，顯著下調(diào)VEGF mRNA及蛋白的表達。肺組織HE結果顯示，與模型組比較，復方蟾酥膠囊中劑量組及順鉑組局部支氣管可見上皮細胞增生，肺泡腔內(nèi)有嗜酸性漿液樣物質滲出。由此可見，復方蟾酥膠囊可以有效抑制Lewis肺癌的生長與轉移，可能與上調(diào)Caspase-3的水平，下調(diào)TNFα、VEGF的表達有關。