達(dá)原飲對(duì)RSV寒濕郁肺證小鼠肺部損傷和腸道菌群的影響Δ

張 茹 ，杜海濤 ，王曉雪 ，王 儀 ，周 倩 ，劉善新 ，王 平 #（.山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，濟(jì)南 50355；.山東省中醫(yī)藥研究院，濟(jì)南 5004）

呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）屬副黏病毒科，是引起嬰幼兒下呼吸道感染的常見(jiàn)病原體之一[1]。對(duì)于RSV 的防治，目前世界范圍內(nèi)尚無(wú)特異性藥物和疫苗。中醫(yī)藥治療病毒感染具有多成分、多途徑、多靶點(diǎn)的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，其不僅針對(duì)某一特定病毒，而且可就病因病機(jī)進(jìn)行辨證論治。RSV 感染屬中醫(yī)“疫病”范疇，有證據(jù)表明在寒濕環(huán)境下，機(jī)體對(duì)RSV 的易感性有所增加[2]。達(dá)原飲源自《溫疫論》，由檳榔、厚樸、草果、知母、芍藥、黃芩、甘草7味藥組成，可開(kāi)達(dá)膜原、辟穢化濁，治療瘧疾、瘟疫邪伏膜原等病證?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，達(dá)原飲具有抗病毒、解熱、抗炎等多種藥理作用，可用于治療呼吸道病毒感染導(dǎo)致的肺部損傷[3-5]。

“肺與大腸相表里”是中醫(yī)藏象學(xué)的經(jīng)典理論之一。臨床調(diào)查發(fā)現(xiàn)，呼吸道病毒在引發(fā)肺部損傷的同時(shí)，還會(huì)導(dǎo)致患者腸道菌群失衡，出現(xiàn)惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉等胃腸道癥狀[6]。益生菌混合物能通過(guò)調(diào)節(jié)腸道菌群的組成來(lái)調(diào)控肺泡巨噬細(xì)胞分泌干擾素β，從而有效防治RSV 引起的肺部病變[7]?？梢?jiàn)，腸道菌群的改變對(duì)呼吸道病毒感染的發(fā)生、發(fā)展和治療起重要作用。

為了更好地貼合RSV 流行時(shí)的氣候條件，符合“寒濕疫”的中醫(yī)證候表現(xiàn)，本研究擬采用“寒濕造模+RSV感染”的方式建立RSV 寒濕郁肺證小鼠模型，同時(shí)在前期藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)16S rDNA 技術(shù)探索達(dá)原飲對(duì)模型小鼠腸道菌群的影響，從而闡明其潛在作用機(jī)制，為中醫(yī)藥治療RSV感染提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括TC20TM型細(xì)胞計(jì)數(shù)儀、XJ-023型酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Rad公司），F(xiàn)ACSAria Ⅲ型流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD 公司），X-30R 型全能高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)Allegra公司），A200型基因擴(kuò)增儀（杭州朗基科學(xué)儀器有限公司），EPS300型電泳儀、Tanon-2500型凝膠成像儀（上海天能生命科學(xué)有限公司），NovaSeq 6000系統(tǒng)測(cè)序儀（美國(guó)Illumina公司），2100型生物分析儀（美國(guó)Agilent公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

檳榔、厚樸、草果、知母、白芍、黃芩、甘草飲片均購(gòu)自山東建聯(lián)盛嘉中藥有限公司，經(jīng)山東省中醫(yī)藥研究院周倩研究員鑒定，分別為棕櫚科植物檳榔ArecacatechuL.的干燥成熟種子，木蘭科植物厚樸MagnoliaofficinalisRehd.et Eils.的干燥干皮、根皮及枝皮，姜科植物草果AmomumtsaokoCrevost et Lemaire 的干燥成熟果實(shí)，百合科植物知母AnemarrhenaasphodeloidesBge.的干燥根莖，毛茛科植物芍藥PaeonialactifloraPall.的干燥根，唇形科植物黃芩ScutellariabaicalensisGeorgi 的干燥根，豆科植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.的干燥根和根莖。

利巴韋林原料藥（批號(hào)J1202A，純度≥99%）購(gòu)自大連美侖生物技術(shù)有限公司；異氟烷（批號(hào)20092202）購(gòu)自深圳市瑞沃德生命科技有限公司；小鼠白細(xì)胞介素6（interleukin-6，IL-6）、IL-1β 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（批號(hào)分別為A21020726、A201B20634）均購(gòu)自杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司；小鼠胃動(dòng)素（motilin，MTL）、胃泌素（gastrin，GAS）ELISA 試劑盒（批號(hào)分別為20220620、20220612）均購(gòu)自上海酶聯(lián)生物技術(shù)有限公司；蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色套裝（批號(hào)G1003）購(gòu)自武漢賽維爾生物科技有限公司；4%多聚甲醛通用性組織固定液、紅細(xì)胞裂解液（批號(hào)分別為22105339、22118166）均購(gòu)自北京蘭杰柯科技有限公司；藻紅蛋白標(biāo)記的抗小鼠CD45R/B220 抗體、別藻青蛋白標(biāo)記的抗小鼠CD8a 抗體、Alexa Fluor?700 標(biāo)記的抗小鼠CD3 抗體、異硫氰酸熒光素標(biāo)記的抗小鼠CD4 抗體、7-氨基放線菌素D 活性檢測(cè)染料（批號(hào)分別為B357370、B348049、B357069、B356714、B321733）均購(gòu)自美國(guó)Bio-Legend公司。

1.3 病毒毒株與細(xì)胞

RSV病毒液由山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所提供，于山東中醫(yī)藥大學(xué)BSL-2實(shí)驗(yàn)室傳代，置于-80 ℃冰箱保存，備用。人喉癌細(xì)胞HEP-2由山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所提供。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雌性BALB/c小鼠36只，體重13～15 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（京）2021-0006。所有小鼠均飼養(yǎng)于山東中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心ABSL-2實(shí)驗(yàn)室。本實(shí)驗(yàn)遵循3R 原則動(dòng)物福利，實(shí)驗(yàn)方案按山東中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理審查委員會(huì)相關(guān)規(guī)定執(zhí)行并獲批準(zhǔn)（批件號(hào)SDUTCM20230510001）。

2 方法

2.1 達(dá)原飲制備

取達(dá)原飲經(jīng)方組成中檳榔、厚樸、草果、知母、白芍、黃芩、甘草7味中藥飲片，加10倍量水浸泡30 min后，煎煮1 h，過(guò)濾；再加8倍量水煎煮45 min，過(guò)濾；合并2次濾液，濃縮至1 g/mL（按生藥總量計(jì)），于4 ℃保存，備用。

2.2 RSV擴(kuò)增

待HEP-2 細(xì)胞長(zhǎng)成單層后，加入RSV 病毒液200 μL，吸附1 h后，加入2% DMEM維持液培養(yǎng)。當(dāng)90%以上細(xì)胞出現(xiàn)致細(xì)胞病變效應(yīng)后，于-20 ℃與室溫之間反復(fù)凍融3 次，以4 000 r/min 離心5 min，取上清液于離心管中，于-80 ℃凍存，備用。

2.3 RSV半數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)物感染量的測(cè)定

將HEP-2細(xì)胞按1×108個(gè)/L接種至96孔板中，培養(yǎng)24 h；加入以10倍比稀釋12個(gè)滴度梯度的RSV病毒液，每孔100 μL，縱向重復(fù)3 孔；同時(shí)，設(shè)置正常細(xì)胞（加入等體積10% DMEM 維持液）作為對(duì)照。培養(yǎng)48 h，采用MTT 法以酶標(biāo)儀于490 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的光密度（optical density，OD）值，重復(fù)測(cè)定4 次。根據(jù)Reed-Muench 公式[8]計(jì)算RSV 半數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)物感染量（median tissue culture infective dose，TCID50）。

2.4 小鼠分組、給藥與造模

小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，按體重分為正常組（NC組，生理鹽水）、模型組（MC 組，生理鹽水）、陽(yáng)性對(duì)照組（LBM組，57.59 mg/kg利巴韋林，相當(dāng)于臨床等效劑量）和達(dá)原飲低、中、高劑量組（LDYY、MDYY、HDYY 組，劑量按生藥量計(jì)分別為1.67、3.34、6.68 g/kg，相當(dāng)于臨床等效劑量的0.5、1、2倍），每組6只。根據(jù)課題組前期研究方法[9]復(fù)制RSV寒濕郁肺證小鼠模型：除NC組外，其余各組小鼠均置于溫度（4±1）℃、相對(duì)濕度（90±5）%的人工氣候箱中，每天4 h，連續(xù)5 d，寒濕造模期間禁食、不禁水，刺激4 h后取出。第2次寒濕刺激結(jié)束后，除NC 組外的其余各組小鼠均吸入異氟烷麻醉，并鼻腔滴注50倍TCID50的RSV病毒液60 μL，每天1次，連續(xù)3 d；NC組小鼠同法滴鼻等體積生理鹽水。各藥物組小鼠每次滴鼻4 h后灌胃相應(yīng)藥液，NC組和MC組小鼠同法灌胃等體積的生理鹽水，每天1次，持續(xù)5 d。

2.5 標(biāo)本采集與處理

末次給藥后，所有小鼠禁食、不禁水12 h，摘眼球取血并置于乙二胺四乙酸抗凝采血管和普通采血管中。抗凝采血管中的血樣用于流式檢測(cè)；普通采血管中的血樣于室溫下靜置2 h后，以3 000 r/min離心15 min，收集上層血清，于-80 ℃保存，備用。取血后，收集小鼠結(jié)腸內(nèi)容物于無(wú)菌凍存管中，于-80 ℃保存，備用。然后，處死小鼠，開(kāi)胸剖取肺組織，將其左小葉用4%多聚甲醛浸潤(rùn)、固定；取其右肺最大葉稱(chēng)重后加入適量磷酸鹽緩沖液，勻漿后以3 000 r/min離心10 min，收集上清液，于-80 ℃保存，備用；其余肺組織于-80 ℃下保存，備用。

2.6 血清中胃腸激素水平和肺組織上清液中炎癥因子水平測(cè)定

取“2.5”項(xiàng)下各組小鼠血清和肺組織上清液，嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)其血清胃腸激素（MTL、GAS）水平和肺組織上清液中炎癥因子（IL-6、IL-1β）水平。

2.7 外周血淋巴細(xì)胞百分比檢測(cè)

取“2.5”項(xiàng)下各組小鼠外周血100 μL，加入CD8a、CD3、CD4抗體各1.25 μL，渦旋混勻，于4 ℃下避光染色20 min；加入7-氨基放線菌素D活性檢測(cè)染料適量，孵育10 min；加入紅細(xì)胞裂解液1 mL，渦旋混勻，于室溫下靜置15 min，以2 000 r/min離心5 min，棄去上清液；細(xì)胞加入磷酸鹽緩沖液2 mL，以2 000 r/min離心5 min，棄取上清液；細(xì)胞以磷酸鹽緩沖液200 μL重懸后轉(zhuǎn)移至流式管中，使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)其外周血淋巴細(xì)胞百分比。

2.8 肺組織病理形態(tài)觀察

取“2.5”項(xiàng)下各組小鼠經(jīng)固定的肺組織，進(jìn)行脫水、透明、浸蠟、包埋、切片，經(jīng)HE染色后，以中性樹(shù)膠封片。使用顯微鏡觀察其肺組織病理形態(tài)變化并拍照。

2.9 小鼠腸道菌群基因測(cè)序

以NC 組、MC 組、MDYY 組（前述藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示中劑量達(dá)原飲藥效最佳）小鼠的結(jié)腸內(nèi)容物為檢測(cè)樣本，采用十六烷基三甲基溴化銨法提取樣本的DNA，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)分別確定所提取DNA的質(zhì)量和數(shù)量。以該DNA為模板，對(duì)16S rDNA V3～V4 區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，引物序列為806R：GACTACHVGGGTATCTAATCC；341F：CCTACGGGNGGCWGCAG；序列方向長(zhǎng)度為806R-341F，產(chǎn)物長(zhǎng)度為465 bp[10]。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，并回收目標(biāo)片段；對(duì)純化后的PCR 產(chǎn)物進(jìn)行評(píng)估，將合格的測(cè)序文庫(kù)梯度稀釋?zhuān)鶕?jù)所需測(cè)序量按相應(yīng)比例混合，并經(jīng)NaOH 變性為單鏈后上機(jī)測(cè)序。得到原始下機(jī)數(shù)據(jù)后，利用Overlap軟件將雙端數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接，并進(jìn)行質(zhì)控、嵌合體過(guò)濾。測(cè)序數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)DADA2 去噪后，利用擴(kuò)增序列變體（amplicon sequence variants，ASVs）概念構(gòu)建操作分類(lèi)單元（operational taxonomic units，OTU）表，獲得最終的ASVs特征表及特征序列并進(jìn)行菌群α多樣性分析（Shannon、Simpson、Chao1、Goods_coverage 指數(shù)）、腸道結(jié)構(gòu)分析和線性判別分析（linear discriminant analysis effect size，LEfSe）。

2.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 8.0.2 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和作圖。數(shù)據(jù)以±s表示，對(duì)于符合正態(tài)分布且方差齊的數(shù)據(jù)，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；對(duì)于非正態(tài)分布或者方差不齊的數(shù)據(jù)，組間比較采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。

3 結(jié)果

3.1 達(dá)原飲對(duì)小鼠血清胃腸激素水平和肺組織上清液中炎癥因子水平的影響

與NC 組比較，MC 組小鼠血清中MTL 水平和肺組織上清液中IL-6、IL-1β水平均顯著升高，血清中GAS水平顯著降低（P＜0.01）。與MC組比較，各藥物組小鼠血清中MTL水平（HDYY組除外）和肺組織上清液中IL-6、IL-1β 水平均顯著降低，血清中GAS 水平（HDYY 組除外）均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠血清中胃腸激素水平和肺組織上清液中炎癥因子水平測(cè)定結(jié)果（±s，n＝6，pg/mL）

表1 各組小鼠血清中胃腸激素水平和肺組織上清液中炎癥因子水平測(cè)定結(jié)果（±s，n＝6，pg/mL）

a：與NC組比較，P＜0.01；b：與MC組比較P＜0.01；c：與MC組比較，P＜0.05。

IL-1β 102.02±9.30 297.80±12.06a 172.73±9.95b 214.12±7.42b 190.34±4.41b 262.40±9.73c組別NC組MC組LBM組LDYY組MDYY組HDYY組MTL 176.61±6.65 290.32±2.99a 248.81±9.99b 253.48±5.48c 250.91±5.90b 279.71±2.96 GAS 67.79±2.06 51.44±2.01a 60.57±1.99b 57.39±4.14c 59.14±4.67b 56.11±2.71 IL-6 44.63±3.36 97.37±3.72a 75.28±5.80b 89.30±2.81c 75.55±7.40b 88.95±4.62c

3.2 達(dá)原飲對(duì)小鼠外周血淋巴細(xì)胞百分比的影響

與NC 組比較，MC 組小鼠外周血中T、B 淋巴細(xì)胞百分比均顯著降低（P＜0.01）；與MC組比較，LBM組小鼠外周血中T、B 淋巴細(xì)胞百分比均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），LDYY 組小鼠外周血中T 淋巴細(xì)胞百分比和MDYY組小鼠外周血中T、B淋巴細(xì)胞百分比均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 各組小鼠外周血淋巴細(xì)胞百分比測(cè)定結(jié)果（±s，n＝6，%）

表2 各組小鼠外周血淋巴細(xì)胞百分比測(cè)定結(jié)果（±s，n＝6，%）

a：與NC組比較，P＜0.01；b：與MC組比較P＜0.01；c：與MC組比較，P＜0.05。

組別NC組MC組LBM組LDYY組MDYY組HDYY組CD4+ T淋巴細(xì)胞46.86±5.05 22.54±8.72a 38.68±4.66b 32.99±9.29c 37.28±5.67b 27.35±5.39 CD8+ T淋巴細(xì)胞22.70±6.25 9.88±4.46a 21.27±5.73b 19.35±7.17c 21.02±7.41c 15.94±4.74 B淋巴細(xì)胞17.34±2.63 10.76±3.30a 16.13±2.51c 14.01±3.25 16.01±2.62c 13.62±2.16

3.3 達(dá)原飲對(duì)小鼠肺組織病理形態(tài)的影響

NC 組小鼠肺部組織結(jié)構(gòu)完整，間質(zhì)未見(jiàn)明顯的炎癥細(xì)胞滲出和淤血等病理變化；MC 組小鼠肺組織有大面積出血片狀紅染，支氣管周?chē)醒装Y細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡壁明顯增厚。與MC組比較，各給藥組小鼠肺組織病理狀態(tài)均改善，尤以LBM 組和MDYY 組的改善效果更明顯。結(jié)果見(jiàn)圖1（LDYY組和HDYY組的圖片略）。

圖1 小鼠肺組織病理形態(tài)觀察的顯微圖（HE染色）

3.4 達(dá)原飲對(duì)小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)和組成的影響

3.4.1 α多樣性

3組樣本的Goods_coverage指數(shù)均接近1，表明檢測(cè)深度已經(jīng)基本涵蓋了樣品中的所有物種，能夠反映各樣本的微生物群落情況[10]。與NC 組比較，MC 組的Simpson、Shannon、Chao1 指數(shù)均有所增加；與MC 組比較，MDYY組上述指數(shù)均有所降低，提示達(dá)原飲干預(yù)后腸道菌群多樣性有回調(diào)趨勢(shì)。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 各組小鼠腸道菌群α多樣性分析結(jié)果（±s，n＝6）

表3 各組小鼠腸道菌群α多樣性分析結(jié)果（±s，n＝6）

組別NC組MC組MDYY組6.26±0.36 6.92±0.19 6.53±0.39 0.95±0.02 0.98±0.01 0.95±0.02 542.05±64.27 595.88±123.09 529.84±75.75 0.99 0.99 0.99 Shannon指數(shù)Simpson指數(shù)Chao1指數(shù)Goods_coverage指數(shù)

3.4.2 門(mén)水平下腸道菌群差異及相對(duì)豐度

在門(mén)水平上，BALB/c 小鼠的優(yōu)勢(shì)菌群主要有厚壁菌門(mén)Firmicutes、擬桿菌門(mén)Bacteroidetes、變形菌門(mén)Proteobacteria、放線菌門(mén)Actinobacteria等，其中厚壁菌門(mén)和擬桿菌門(mén)占比較大。與NC 組比較，MC 組厚壁菌門(mén)（P＜0.01）和變形菌門(mén)（P＞0.05）的相對(duì)豐度均有所減少，擬桿菌門(mén)（P＜0.01）和放線菌門(mén)（P＞0.05）的相對(duì)豐度均有所增加，MC 組小鼠擬桿菌門(mén)/厚壁菌門(mén)比值增大。與MC組比較，MDYY組擬桿菌門(mén)的相對(duì)豐度有所降低，厚壁菌門(mén)的相對(duì)豐度顯著增加（P＜0.01）；此外，放線菌門(mén)和變形菌門(mén)水平也有回調(diào)趨勢(shì)，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），提示達(dá)原飲可以改善模型小鼠的腸道菌群失調(diào)。結(jié)果見(jiàn)圖2。

3.4.3 屬水平下腸道菌群差異及相對(duì)豐度

在屬水平上，各組小鼠腸道菌群主要以毛螺菌屬NK4A136 組Lachnospiraceae_NK4A136_group、未分類(lèi)的Muribaculaceae、另枝菌屬Alistipes、未分類(lèi)的Clostridiales、未分類(lèi)梭菌屬UCG-014、擬普雷沃氏菌屬Alloprevotella、絲狀菌屬Kineothrix和擬桿菌屬Bacteroides等為主。與NC 組比較，MC 組小鼠毛螺菌屬NK4A136組、絲狀菌屬和未分類(lèi)Clostridiales的相對(duì)豐度均顯著減少（P＜0.01），擬桿菌屬、另枝菌屬、未分類(lèi)Muribaculaceae、擬普雷沃氏菌屬的相對(duì)豐度雖有所增加，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與MC 組比較，MDYY 組小鼠毛螺菌屬NK4A136組和絲狀菌屬相對(duì)豐度均顯著增加（P＜0.05 或P＜0.01），未分類(lèi)Muribaculaceae的相對(duì)豐度顯著降低（P＜0.01），此外未分類(lèi)的Clostridiales、擬桿菌屬、另枝菌屬、擬普雷沃氏菌屬水平也呈現(xiàn)回調(diào)趨勢(shì)，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 各組小鼠屬水平下腸道菌群結(jié)構(gòu)分析

3.4.4 LEfSe多級(jí)物種差異

LEfSe結(jié)果顯示，NC組對(duì)群落結(jié)構(gòu)影響較大的差異物種有厚壁菌門(mén)、梭菌目、毛螺菌科等[線性判別分析（linear discriminant analysis，LDA）值＞4[11]，下同]。MC組中對(duì)群落結(jié)構(gòu)影響較大的差異物種有擬桿菌綱、Muribaculaceae、Muribaculum、產(chǎn)酸擬桿菌等。MDYY組中對(duì)群落結(jié)構(gòu)影響較大的差異物種有Lachnospiraceae_UCG-006、瘤胃球菌屬Ruminococcus等。結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 LEfSe的LDA柱狀圖

4 討論

為了更加貼合RSV 流行時(shí)的氣候條件，符合“寒濕疫”的中醫(yī)證候表現(xiàn)，本研究采用了“寒濕造模+RSV 感染”的方式建立RSV 寒濕郁肺證小鼠模型。結(jié)果顯示，與NC 組比較，MC 組小鼠肺組織有明顯病變，血清中MTL 水平和肺組織上清液中IL-1β、IL-6 水平均顯著升高，血清中GAS 水平顯著降低。此外，模型小鼠外周血中CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞百分比和B淋巴細(xì)胞百分比均顯著降低，這些特征與文獻(xiàn)報(bào)道的“寒濕疫”動(dòng)物模型相吻合[12]。

本研究使用不同劑量的達(dá)原飲對(duì)模型小鼠進(jìn)行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)小鼠肺部病理、肺組織炎癥因子水平、血清中胃腸激素水平和T、B淋巴細(xì)胞百分比均得到顯著改善，有效緩解了RSV 感染引起的肺部損傷。但達(dá)原飲并沒(méi)有呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系，這可能是由于高劑量達(dá)原飲苦味較大，灌胃時(shí)小鼠比較抗拒，導(dǎo)致給藥量不達(dá)標(biāo)所致。

腸道菌群可調(diào)節(jié)宿主的免疫反應(yīng)，參與人體各系統(tǒng)重要的生理功能，影響多種疾病的發(fā)生發(fā)展，被稱(chēng)為“人類(lèi)第二基因組”。在正常情況下，宿主與腸道微生物維持著相對(duì)動(dòng)態(tài)平衡；當(dāng)腸道菌群失衡，會(huì)引發(fā)宿主屏障、免疫等功能喪失，從而加重甚至誘發(fā)疾病[13]。本研究運(yùn)用16S rDNA 技術(shù)發(fā)現(xiàn)，與NC 組比較，MC 組小鼠的腸道菌群豐度與多樣性均有所增加。經(jīng)中劑量達(dá)原飲干預(yù)后，小鼠腸道菌群的多樣性及豐度均明顯回調(diào)，表明該方能改善RSV 寒濕郁肺證小鼠的腸道菌群紊亂。BALB/c 小鼠的腸道菌群主要由四大菌門(mén)組成，其中以擬桿菌門(mén)和厚壁菌門(mén)為主，還包括變形菌門(mén)和放線菌門(mén)[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，MC 組小鼠腸道菌群的結(jié)構(gòu)及豐度發(fā)生了顯著變化。首先在門(mén)水平上，MC 組小鼠擬桿菌門(mén)/厚壁菌門(mén)比值增大，這與Groves 等[15]報(bào)道的RSV 感染小鼠體內(nèi)擬桿菌門(mén)相對(duì)豐度增加、厚壁菌門(mén)豐度相對(duì)減少的結(jié)果一致。厚壁門(mén)菌屬以抗性淀粉和膳食纖維為底物，產(chǎn)生短鏈脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFAs），SCFAs不僅是維持腸道黏膜細(xì)胞功能的主要能量來(lái)源，對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)也具有重要意義[16]。厚壁菌門(mén)產(chǎn)生的SCFAs以具有抗炎活性的丁酸鹽為主，從而影響免疫細(xì)胞的遷移和黏附、細(xì)胞因子表達(dá)等信號(hào)通路的激活[17]。因此，厚壁菌門(mén)豐度降低會(huì)造成腸道菌群失衡，影響機(jī)體免疫力，造成病原清除障礙，使炎癥持續(xù)存在，從而加重呼吸道病毒疾病的發(fā)展。

在屬水平上，中劑量達(dá)原飲能顯著回調(diào)有益菌毛螺菌屬NK4A136 組的相對(duì)豐度水平。既往研究發(fā)現(xiàn)，毛螺菌屬NK4A136組能夠保護(hù)顆粒物或病原微生物引起的肺損傷，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)免疫、減輕炎癥及氧化反應(yīng)有關(guān)[18]。毛螺菌科是丁酸鹽的主要生成者，丁酸可抑制炎癥反應(yīng)，保護(hù)腸黏膜。毛螺菌屬NK4A136 組的增加與亞精胺介導(dǎo)的腸道屏障功能增強(qiáng)相關(guān)[18]，其在MC組小鼠體內(nèi)呈低豐度表達(dá)，可能與模型小鼠的炎癥狀態(tài)有關(guān)。本研究認(rèn)為，毛螺菌屬NK4A136 組可能在減輕RSV引起的肺損傷中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。

本研究進(jìn)一步分析了NC 組、MC 組和MDYY 組腸道菌群的多級(jí)物種差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MDYY 組的主要差異物種有Lachnospiraceae_UCG-006和瘤胃球菌屬。有研究報(bào)道，Lachnospiraceae_UCG-006相對(duì)豐度與肺部疾病密切相關(guān)，肺癌患者和小鼠糞便中Lachnospiraceae_UCG-006、瘤胃球菌屬的相對(duì)豐度和SCFAs 的含量均明顯減少[19-20]。

綜上所述，達(dá)原飲可能通過(guò)改善小鼠肺組織損傷、減輕炎癥、調(diào)節(jié)胃腸激素水平和淋巴細(xì)胞百分比來(lái)減輕RSV 感染引起的肺部損傷；同時(shí)，達(dá)原飲還可能通過(guò)優(yōu)化腸道菌群結(jié)構(gòu)、調(diào)節(jié)有益菌和有害菌的相對(duì)豐度來(lái)改善肺部損傷。