不同吸氧濃度對(duì)慢性阻塞性肺疾病大鼠環(huán)加氧酶2/前列腺素/E-前列腺素類激素信號(hào)通路及上皮細(xì)胞活性的作用機(jī)制*

鄭立風(fēng) 張 露 趙紅霞 李芳圓 梁金排

（1 衡水市人民醫(yī)院呼吸與危重癥科，衡水 053000；2 深州市醫(yī)院呼吸與危重癥科，深州 053000）

慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）的主要特征為持續(xù)性氣流受限且呈進(jìn)行性發(fā)展[1-2]。由于目前治療COPD的藥物療效并不十分理想，因此探究有效治療COPD的方法是目前臨床亟需解決的難題。研究表明[3]，氧氣的吸入可確保COPD患者重要臟器的氧氣供應(yīng)，但高濃度的氧氣吸入會(huì)通過在肺部的氣體交換而造成肺部損傷。但目前關(guān)于不同吸氧濃度對(duì)COPD大鼠的作用機(jī)制未見報(bào)道。COPD的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道氣道炎癥是導(dǎo)致COPD的主要機(jī)制，COPD的發(fā)病率和死亡率會(huì)隨著炎癥加重而增加[4]。環(huán)加氧酶2（cyclooxygenase-2，COX-2）是近年來研究較廣泛的炎癥相關(guān)分子之一，其表達(dá)會(huì)隨著炎癥信號(hào)刺激而增加[5-6]。前列腺素E2（prostaglandin E2，PEG2）作為一種炎癥介質(zhì)可結(jié)合E-前列腺素類激素（E-prostanoid，EP）受體，進(jìn)而啟動(dòng)下游多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[7]。有研究顯示[8]，COX-2/PEG2信號(hào)通路可促進(jìn)煙霧暴露導(dǎo)致的氣道炎癥，但目前關(guān)于不同吸氧濃度對(duì)COPD大鼠模型中COX-2/PEG2/EP信號(hào)通路的變化尚不清楚。因此，本研究旨在探究不同吸氧濃度對(duì)COPD大鼠COX-2/PEG2/EP信號(hào)通路及上皮細(xì)胞活性的影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

50只6～8周齡健康雄性SD大鼠均購(gòu)自山東省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，合格證號(hào)：SCXK2019-0003。大鼠體質(zhì)量200～220 g，SPF級(jí)。將大鼠飼養(yǎng)在統(tǒng)一的動(dòng)物房?jī)?nèi)，溫度恒定20℃～24℃，相對(duì)濕度為40%～60%，光照12 h一循環(huán)晝夜交替，適應(yīng)性喂養(yǎng)大鼠1周。實(shí)驗(yàn)過程中遵循“3R”原則。

1.2 試劑和儀器

白細(xì)胞介素（interleukin，IL）6（IL-6）、IL-8、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA試劑盒（武漢基因美科技有限公司）；PGE2 ELISA試劑盒（中國(guó)聯(lián)科生物公司）；COX-2抗體、EP1抗體、EP4抗體、GAPDH抗體（美國(guó)Abcam公司）；人支氣管上皮細(xì)胞BEAS-2B（上海雅吉生物科技有限公司）；有機(jī)玻璃吸氧艙、煙熏箱自制；黃果樹香煙（貴州中煙工業(yè)公司）；電熱恒溫箱（廈門鷺基有限公司）；小動(dòng)物肺功能儀（上海玉研科學(xué)儀器有限公司）。

1.3 模型制備和分組

將實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、COPD組、50% O2組、70% O2組、90% O2組，每組10只。本研究根據(jù)參考文獻(xiàn)[9]制備COPD大鼠模型。除正常對(duì)照組外，其余各組大鼠均置于動(dòng)物煙熏箱中，恒定煙熏箱中煙霧濃度為450～500 bpm，煙熏時(shí)間每次30 min，3 h煙熏1次，煙盒12 h更換1次；同時(shí)經(jīng)煙熏大鼠氣管內(nèi)滴注脂多糖，每次0.2 mg/kg，連續(xù)干預(yù)12周。通過檢測(cè)大鼠肺功能指標(biāo)判定COPD模型是否成功。

造模成功后，將5組大鼠均置于自制的有機(jī)玻璃吸氧艙內(nèi)，并控制氧氣流量調(diào)節(jié)艙內(nèi)氧氣濃度，正常對(duì)照組和COPD組大鼠吸入氧濃度（FiO2）為21%，50% O2組、70% O2組、90% O2組大鼠FiO2分別為50%、70%、90%，吸氧時(shí)間均為40 min[10]。

1.4 肺功能檢測(cè)

氧療干預(yù)結(jié)束后，各組大鼠均經(jīng)腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉，消毒頸部皮膚并沿正中位切開，將肌肉組織鈍性分離暴露氣管，插入連接有三通開關(guān)的氣管插管并結(jié)扎，將大鼠仰臥位置于密閉體積描計(jì)器內(nèi)，和肺功能儀相結(jié)合，進(jìn)行機(jī)械通氣。分別記錄各組大鼠吸氣阻力（RI）、肺總量（TLC）、用力肺活量（FVC）、50 ms用力呼氣量（FEV50）。

1.5 肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）的采集

肺功能檢測(cè)結(jié)束后，繼續(xù)向下剪開各組大鼠頸部皮膚，打開胸腔并充分暴露肺組織，結(jié)扎右主支氣管，將灌胃針插入到左支氣管中1 cm并將末端結(jié)扎，經(jīng)灌胃針注入4℃生理鹽水5 mL于左肺，30 s后抽出左肺中3～4 mL的生理鹽水后再注入，重復(fù)3次，最后一次抽取液體并置于離心管中。在4℃環(huán)境中以3 000 r/min的速度離心液體20 min，收集上清液，用ELISA法檢測(cè)BALF中PGE2、IL-6、IL-8、TNF-α水平。將離心管中的細(xì)胞沉淀在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞分類計(jì)數(shù)，分別統(tǒng)計(jì)各組巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的百分比。

1.6 肺組織病理學(xué)變化檢測(cè)

采集BALF后分離各組大鼠右肺上葉，用4%多聚甲醛溶液固定肺組織，48 h后取出肺組織用石蠟包埋，用切片機(jī)將肺組織切成厚度為5 μm的組織薄片，用蘇木精-伊紅（H-E）染色肺組織，顯微鏡下觀察肺組織病理學(xué)變化。

1.7 免疫印跡檢測(cè)肺組織中COX-2、EP1、EP4蛋白表達(dá)

取各小鼠50 mg肺組織，于冰上裂解組織至組織勻漿，離心組織勻漿，用DAB法檢測(cè)上清液中蛋白濃度。分別配置濃縮和分離膠，濃度分別為5%和8%，在膠孔中分別加入樣品蛋白，電泳10 min后轉(zhuǎn)膜。孵育2 h后，將5%封閉液加入到樣品中，激活后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，封閉PVDF膜1 h。分別加入一抗COX-2、EP1、EP4過夜，繼續(xù)加入HRP標(biāo)記的二抗，繼續(xù)孵育2 h。用ECL檢測(cè)細(xì)胞PVDF膜并成像。

1.8 香煙煙霧提取物（CSE）制備

取30 mL的RPMI-1640培養(yǎng)液，點(diǎn)燃10根黃果樹香煙后和培養(yǎng)液共同培養(yǎng)，過濾所得懸浮液為CSE溶液，用RPMI-1640稀釋CSE溶液濃度為2.5%，于-80℃的冰箱中保存。

1.9 BEAS-2B細(xì)胞培養(yǎng)和處理

將BEAS-2B培養(yǎng)于RPMI-1640培養(yǎng)基中，加入10%胎牛血清，后于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱進(jìn)行貼壁培養(yǎng)，每隔2～3 d更換1次培養(yǎng)液。當(dāng)細(xì)胞融合生長(zhǎng)達(dá)到80%～90%時(shí)，取處于對(duì)數(shù)期的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將BEAS-2B細(xì)胞分為對(duì)照組（將BEAS-2B細(xì)胞培養(yǎng)于正常培養(yǎng)基中，置于常規(guī)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)）、CSE組（將BEAS-2B細(xì)胞培養(yǎng)于含2.5% CSE溶液的培養(yǎng)基中，置于常規(guī)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)）、50%組（將BEAS-2B細(xì)胞培養(yǎng)于含2.5% CSE溶液的培養(yǎng)基中，置于含50% O2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)）、70%組（將BEAS-2B細(xì)胞培養(yǎng)于含2.5% CSE溶液的培養(yǎng)基中，置于含70% O2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)）、90%組（將BEAS-2B細(xì)胞培養(yǎng)于含2.5% CSE溶液的培養(yǎng)基中，置于含90% O2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)），各組細(xì)胞均培養(yǎng)48 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.10 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活力

取各組BEAS-2B細(xì)胞，離心并消化細(xì)胞成為細(xì)胞懸液，稀釋細(xì)胞濃度為2×105個(gè)/mL，接種細(xì)胞于96孔板內(nèi)，每孔100 μL，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)。培養(yǎng)48 h后棄掉培養(yǎng)液，在孔板內(nèi)加入CCK-8溶液100 μL，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞2 h，將上清液棄掉，在酶標(biāo)儀450 nm處測(cè)定各孔的吸光度值（A）。

1.11 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

取各組BEAS-2B細(xì)胞并消化，接種細(xì)胞于6孔板中，當(dāng)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后，更換孔板的培養(yǎng)基。培養(yǎng)48 h后常規(guī)消化細(xì)胞，離心5 min，棄上清液，用PBS洗滌細(xì)胞，將提前預(yù)冷的70%乙醇加入到細(xì)胞中，在4℃環(huán)境下固定細(xì)胞，12 h后再次離心細(xì)胞5 min，后再次用PBS洗滌細(xì)胞，將含有0.01%的RNase PI染液加入到細(xì)胞中，在避光的環(huán)境中染色細(xì)胞30 min，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Graphpad Priam 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料均用±s表示。不同組間數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肺功能比較

與正常對(duì)照組相比，COPD組大鼠肺功能指標(biāo)TLC、RI均明顯增加，F(xiàn)EV50/FVC比值明顯降低（P＜0.05）；與COPD組相比，50% O2組和70% O2組大鼠肺功能指標(biāo)TLC、RI均明顯降低，F(xiàn)EV50/FVC比值明顯升高，且70% O2組肺功能指標(biāo)變化最顯著（P＜0.05）；與COPD組相比，90% O2組大鼠肺功能指標(biāo)TLC、RI均明顯增加，F(xiàn)EV50/FVC比值明顯降低（P＜0.05）（表1）。

表1 各組大鼠肺功能指標(biāo)TLC、RI及FEV50/FVC比值比較（n=10，±s）

*P＜0.05 vs正常對(duì)照組 ；△P＜0.05 vs COPD組；#P＜0.05 vs 50% O2組

組別TLC（mL）RI（cmH2O·s/mL）FEV50/FVC正常對(duì)照組18.62±0.870.11±0.0149.21±1.05 COPD組25.41±1.26*0.18±0.02*35.46±0.82*50%O2組23.47±1.03*△0.15±0.02*△40.17±0.91*△70%O2組20.15±0.92*△#0.13±0.01*△#45.39±0.98*△#90%O2組29.84±1.31*△0.26±0.02*△38.92±0.93*△

2.2 各組大鼠BALF中IL-6、IL-8、TNF-α、PGE2水平比較

與正常對(duì)照組相比，COPD組大鼠BALF中IL-6、IL-8、TNF-α、PGE2水平均明顯升高（P＜0.05）；與COPD組相比，50% O2組和70% O2組大鼠BALF中IL-6、IL-8、TNF-α、PGE2水平均明顯降低，且70% O2組降低最顯著（P＜0.05）；與COPD組相比，90% O2組大鼠BALF中IL-6、IL-8、TNF-α、PGE2水平明顯升高（P＜0.05）（圖1）。

圖1 各組大鼠BALF中IL-6、IL-8、TNF-α、PGE2水平比較。A：IL-6水平比較；B：IL-8水平比較；C：TNF-α水平比較；E：PGE2水平比較。*P＜0.05 vs 正常對(duì)照組；△P＜0.05 vs COPD組；#P＜0.05 vs 50% O2組.

2.3 各組大鼠BALF中白細(xì)胞總數(shù)和炎癥細(xì)胞比例比較

COPD組大鼠BALF中白細(xì)胞總數(shù)及單核-巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞比例明顯高于正常對(duì)照組（P＜0.05）；50% O2組和70% O2組大鼠BALF中白細(xì)胞總數(shù)及單核-巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞比例均明顯低于COPD組，且70% O2組變化最顯著（P＜0.05）；90% O2組大鼠BALF中白細(xì)胞總數(shù)及單核-巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞比例均明顯高于COPD組（P＜0.05）（表2）。

表2 各組大鼠BALF中白細(xì)胞總數(shù)、單核-巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞比例比較（n=10，±s）

表2 各組大鼠BALF中白細(xì)胞總數(shù)、單核-巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞比例比較（n=10，±s）

*P＜0.05 vs 正常對(duì)照組；△P＜0.05 vs COPD組；#P＜0.05 vs 50% O2組

組別白細(xì)胞總數(shù)/（108/L）單核-巨噬細(xì)胞（%）淋巴細(xì)胞（%）中性粒細(xì)胞（%）正常對(duì)照組1.35±0.2465.41±2.16 8.11±1.4210.46±2.31 COPD組6.18±0.51*86.25±4.07*16.45±3.56*25.47±4.09*50%O2組4.27±0.42*△81.53±3.62*△13.28±3.11*△19.34±3.26*△70%O2組3.06±0.34*△#72.61±2.82*△#10.31±2.52*△#13.41±2.68*△#90%O2組8.45±0.53*△ 90.14±4.25*△19.26±3.81*△29.65±3.11*△

2.4 各組大鼠肺組織病理學(xué)變化比較

與正常對(duì)照組相比，COPD組大鼠肺組織損傷明顯，肺泡間隔增厚，且間隔損壞嚴(yán)重，在支氣管有大量的粘液腺增生，且大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)到肺間質(zhì)，明顯可見肺泡萎縮，管腔變窄，符合COPD的病理學(xué)變化；與COPD組相比，50% O2組和70% O2組大鼠肺泡間隔均區(qū)域正常，萎縮肺泡及氣管壁粘液腺增生得到明顯改善，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少，70% O2組大鼠肺組織病理學(xué)改善最顯著；與COPD組相比，90% O2組大鼠肺組織明顯損傷，與COPD組相似（圖2）。

圖2 各組大鼠肺組織H-E染色，×200，標(biāo)尺=50 μm。A：正常對(duì)照組；B：COPD組；C：50% O2組；D：70% O2組；E：90% O2組.

2.5 各組大鼠肺組織中COX-2、EP1、EP4蛋白表達(dá)

COPD組大鼠肺組織中COX-2、EP1、EP4蛋白表達(dá)均明顯高于正常對(duì)照組（P＜0.05）；與COPD組相比，50% O2組和70% O2組大鼠肺組織中COX-2、EP1、EP4蛋白表達(dá)均明顯降低（P＜0.05）；90% O2組大鼠肺組織中COX-2、EP1、EP4蛋白表達(dá)均明顯高于COPD組（P＜0.05）（圖3）。

2.6 各組BEAS-2B細(xì)胞活力和凋亡比較

CSE組BEAS-2B細(xì)胞活力明顯低于對(duì)照組，細(xì)胞凋亡率高于對(duì)照組（P＜0.05）；與CSE組相比，50%組和70%組BEAS-2B細(xì)胞活力均明顯增加，細(xì)胞凋亡率明顯降低（P＜0.05）；與CSE組相比，90%組BEAS-2B細(xì)胞活力明顯降低，細(xì)胞凋亡率明顯增加（P＜0.05）（圖4）。

3 討論

近年研究發(fā)現(xiàn)[11-13]，一定濃度的氧療對(duì)COPD疾病可發(fā)揮治療作用。氧療可通過提高吸入氣體中氧的濃度而增加機(jī)體的氧分壓及氧含量，有效降低無(wú)氧代謝和乳酸生成，有效緩解患者肺動(dòng)脈高壓，同時(shí)能使急性加重期的患者達(dá)到較為滿意的氧合水平[14]。目前臨床上認(rèn)為，吸入氧濃度為50%以上時(shí)為高濃度氧療，當(dāng)患者進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間的高濃度氧療時(shí)可導(dǎo)致患者出現(xiàn)多種不良反應(yīng)，包括呼吸抑制、吸收性肺不張、氧中毒等。因此眾多學(xué)者提出，在給予COPD患者進(jìn)行氧療時(shí)應(yīng)控制吸氧的濃度，避免以上情況發(fā)生。但目前關(guān)于COPD患者氧療濃度的控制上尚未見相關(guān)報(bào)道。

目前臨床上通常使COPD患者先吸入支氣管擴(kuò)張劑后，再對(duì)患者的肺功能指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，當(dāng)發(fā)現(xiàn)FEV1/FVC＜0.7時(shí)則說明患者存在持續(xù)性氣流受限，即確診為COPD。本研究結(jié)果顯示，COPD組大鼠肺功能參數(shù)TLC及RI參數(shù)明顯上升，呼氣流速指標(biāo)FEV50/FVC比值顯著降低，提示COPD大鼠模型制備成功。50% O2組和70% O2組大鼠FEV50/FVC比值明顯高于COPD組，但90% O2組大鼠FEV50/FVC比值明顯低于50% O2組，提示50%和70%濃度的氧療可明顯改善COPD大鼠氣流受限，但90%濃度的氧療可明顯加重COPD大鼠的氣流受限。Schmidt等[15]研究證實(shí)，高濃度的吸氧（FiO2＞90%）可引起肺組織損傷。

研究表明[16]，炎癥反應(yīng)可涉及慢阻肺患者整個(gè)肺及全身，且局部較重的炎癥反應(yīng)可升高IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α等炎癥因子水平，通過破壞肺組織結(jié)構(gòu)和功能而影響肺通氣和換氣，進(jìn)而降低肺功能并加重疾病進(jìn)程。相關(guān)文獻(xiàn)顯示[17]，IL-6、IL-8可通過誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞聚集、淋巴細(xì)胞黏附而釋放炎癥介質(zhì)，激活氧化應(yīng)激反應(yīng)，通過損傷肺實(shí)質(zhì)和肺血管而加重COPD的氣道炎癥反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示，50% O2組和70% O2組大鼠BALF中炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯低于COPD組，但90% O2組大鼠BALF中炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯高于COPD組，提示50%和70%濃度的氧療可改善COPD大鼠炎癥水平，但90%濃度的氧療可明顯加重COPD大鼠炎癥水平并加重肺損傷。朱張求等[18]研究證實(shí)，可通過下調(diào)COPD大鼠肺部炎癥浸潤(rùn)而改善大鼠肺部炎癥，減輕COPD疾病進(jìn)展。

Santini等[19]通過檢測(cè)COPD患者呼出氣冷凝物顯示，PGE2含量明顯高于正常對(duì)照組，且隨著PGE2含量增高導(dǎo)致COPD病情加重，導(dǎo)致FEV1/FVC值降低。相關(guān)研究表明[20]，COX-2、EP4 可顯著降低炎癥中PGE2的含量，因此提示COX-2-EP4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑可能通過PGE2介導(dǎo)多種組織損傷。本研究結(jié)果顯示，50% O2組和70% O2組大鼠BALF中PGE2含量明顯降低，肺組織中COX-2、EP1、EP4蛋白表達(dá)也明顯減少，90% O2組PGE2含量和肺組織中COX-2、EP1、EP4蛋白表達(dá)明顯高于COPD組，提示50%和70%濃度的氧療可抑制COX-2/PEG2/EP信號(hào)通路的激活，從而抑制氣道炎癥反應(yīng)的發(fā)生，但90%濃度的氧療可促進(jìn)COX-2/PEG2/EP信號(hào)通路的激活。李德富等[21]研究發(fā)現(xiàn)，MVE誘導(dǎo)大鼠COPD氣道上皮細(xì)胞中COX-2/PEG2/EP信號(hào)通路成員明顯增加，同時(shí)伴隨NF-κB信號(hào)通路的活化。

為證實(shí)50%和70%濃度的氧療對(duì)COPD大鼠的改善作用，本研究通過體外實(shí)驗(yàn)研究BEAS-2B細(xì)胞活性和凋亡率。結(jié)果顯示CSE組細(xì)胞活力明顯降低，凋亡率明顯增加，50%組和70%組細(xì)胞活力明顯高于CSE組，凋亡率明顯低于CSE組，但90%組較CSE組細(xì)胞活力明顯降低，凋亡率明顯增加。從體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了50%和70%濃度的氧療可改善COPD，當(dāng)氧療濃度到90%時(shí)反而會(huì)加重COPD帶來的損傷。

綜上所述，COPD大鼠在氧療濃度為50%和70%時(shí)可抑制COX-2/PEG2/EP信號(hào)通路的激活，改善COPD大鼠肺功能，減輕肺部炎癥浸潤(rùn)，增加上皮細(xì)胞活性，且70%濃度氧療效果最好；但氧療濃度為90%時(shí)會(huì)加重COPD大鼠肺部炎癥浸潤(rùn)，降低上皮細(xì)胞活性，促進(jìn)COX-2/PEG2/EP信號(hào)通路的激活。