核苷（酸）類似物聯(lián)合聚乙二醇干擾素對慢性乙型肝炎大鼠法尼醇X受體-成纖維細(xì)胞生長因子19通路、枯否細(xì)胞極化的影響*

顏成果 閃海霞 吳玉卓 盧瑞杰 溫 泉

（南陽市中心醫(yī)院感染性疾病科，南陽 473000）

慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）存在腸道屏障功能異常的情況，久而久之就會導(dǎo)致膽汁酸淤積，而這也是肝損傷的主要誘因。此外，乙型肝炎病毒感染也會導(dǎo)致慢性炎癥，促進(jìn)肝損傷及肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展。因此，如何改善腸道屏障功能、遏制膽汁酸淤積，抑制炎癥反應(yīng)是目前臨床關(guān)注的焦點(diǎn)之一[1-3]。法尼醇X受體（farnesol X receptor，F(xiàn)XR）是一種高度表達(dá)于腸、肝組織的核受體，可與靶基因成纖維細(xì)胞生長因子19（fibroblast growth factor 19，F(xiàn)GF19）相互作用抑制膽汁酸的合成，抑制炎癥反應(yīng)，從而對肝損傷具有一定保護(hù)作用，故FXR-FGF19通路將有望成為慢性乙型肝炎的新型治療靶點(diǎn)[4]。枯否細(xì)胞是一種特殊非實(shí)質(zhì)肝巨噬細(xì)胞，可通過分泌炎癥因子在肝纖維化中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，因此枯否細(xì)胞已經(jīng)成為肝纖維化防治研究的一個關(guān)鍵靶點(diǎn)[5]。目前，臨床對于慢性乙型肝炎治療在抗病毒方面有單藥和聯(lián)合治療2種方案，抗病毒藥物主要為核苷（酸）類似物和聚乙二醇干擾素，這2種藥物單藥治療均有各自的局限，因此研究人員將2種藥物進(jìn)行聯(lián)合應(yīng)用，以探索最佳的治療方案[6]。目前大量研究已經(jīng)證實(shí)，核苷（酸）類似物和聚乙二醇干擾素聯(lián)合應(yīng)用效果比單藥更佳，但其作用機(jī)制尚未明確。因此，本研究就其聯(lián)合用藥對慢性乙型肝炎大鼠FXR-FGF19通路、枯否細(xì)胞極化的影響進(jìn)行探討，以期為臨床治療提供理論基礎(chǔ)[7]。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及分組

本實(shí)驗(yàn)選取南京金萊暢生物科技有限公司提供的60只SPF級SD雄性大鼠[合格證書為：SCXK（蘇）2019-0015]，體質(zhì)量210～270 g，室溫生長，單籠喂養(yǎng)，模仿12 h晝夜交替，在常溫下進(jìn)行無菌自由進(jìn)食、飲水2周，按照《實(shí)驗(yàn)動物管理?xiàng)l例》規(guī)定進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。隨機(jī)選取建模成功的大鼠40只，將其隨機(jī)分為模型組、核苷（酸）類似物（核苷酸）組、聚乙二醇干擾素（干擾素）組、聯(lián)合組，每組10只，取剩余10只健康大鼠作為正常組。對核苷酸組灌胃10 mg/kg的拉米夫定（貨號：H20103481，湖南千金湘江藥業(yè)股份有限公司），對干擾素組皮下注射5 μg/kg的聚乙二醇干擾素（上海羅氏制藥有限公司），對聯(lián)合組灌胃10 mg/kg的拉米夫定后皮下注射5 μg/kg的聚乙二醇干擾素，3組均1次/天，治療28 d。正常組、模型組同期灌胃同體積生理鹽水。

1.2 乙型肝炎建模

隨機(jī)選取50只大鼠，固定好后腹腔注射10 mL/kg的1×106/mL的乙肝病毒（上海酶聯(lián)有限公司），每周1次，連續(xù)4周，然后檢測大鼠血清中天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）、乙型肝炎表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）、乙型肝炎E抗原（hepatitis B E antigen，HBeAg），若其水平明顯上升，則視為建模成功。造模過程中大鼠無死亡，建模失敗3只，其余均建模成功。

1.3 標(biāo)本采集

實(shí)驗(yàn)完成后，腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉處死大鼠，從眼球后靜脈叢取血，離心、取上清液置于冰箱中密封保存，同時取肝組織固定48 h后，用生理鹽水漂洗干凈，放入冰箱中密封保存。

1.4 ELISA法檢測血清病毒相關(guān)指標(biāo)

取各組大鼠血清，酶聯(lián)免疫吸附試劑盒（深圳市健竹有限公司）檢測HBsAg、HBeAg水平，實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)完成后，立即用酶標(biāo)儀在波長450 nm處，測定每孔吸光度，計(jì)算血清中HBsAg、HBeAg含量。

1.5 全自動生化分析儀檢測血清肝功能指標(biāo)

取各組大鼠血清，采用全自動血清生化儀（上海玉研有限公司）檢測大鼠血清中 ALT、AST、總膽紅素（total bilirubin，TBIL）水平，實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照儀器說明書進(jìn)行。

1.6 H-E染色觀察肝組織

取各組肝組織，梯度乙醇依次脫水，二甲苯透明后將其浸于軟蠟中60 min，石蠟包埋40 min，切片后經(jīng)60℃烤箱烤片2 h，二甲苯脫蠟2次，梯度乙醇洗脫后，蘇木素染色，流水沖洗，鹽酸乙醇分色10 s，伊紅染色1 min，染色完成后除去多余染液，進(jìn)行梯度乙醇脫水、二甲苯透明和中性樹膠封片處理，光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行組織病理學(xué)觀察。

1.7 免疫印跡檢測FXR-FGF19通路蛋白表達(dá)

取各組肝組織，加入200 μL RAPI裂解液（西安赫特有限公司）后用組織勻漿機(jī)進(jìn)行充分勻漿，然后離心取上清液，用 BCA法測定蛋白樣品含量，加入1×PBS和Simple Loading Buffer混勻，將其置于 95℃干式恒溫器中加熱 5 min，冷卻后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳完成后用半干電轉(zhuǎn)移法恒流轉(zhuǎn)膜1 h，然后5%脫脂牛奶封閉1 h，PBS洗滌，加入稀釋的FXR、FGF19一抗（均為1∶1 000），4℃過夜孵育，PBS洗滌后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶5 000），室溫孵育1 h，滴加顯色液顯色，在暗室中進(jìn)行電化學(xué)發(fā)光、曝光、X射線膠片顯影后用Quantity One軟件進(jìn)行灰度值分析，以同一樣本中GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算比值求得FXR、FGF19蛋白表達(dá)量。

1.8 免疫組織化學(xué)顯色檢測枯否細(xì)胞極化相關(guān)指標(biāo)

取各組肝組織，進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋、切片、脫蠟、水化后，PBS洗滌，加入3%過氧化氫孵育10 min，加入pH 6.0的枸櫞酸鈉抗原修復(fù)液高壓熱修復(fù)5 min，冷卻后PBS洗滌，加入非特異性血清孵育30 min，PBS洗滌，加入稀釋的iNOS、CD163一抗（1∶500），4℃過夜孵育，PBS洗滌，加入生物素標(biāo)記的二抗（1∶2 000），37℃孵育20 min，PBS洗滌，鏈霉菌抗生素蛋白-過氧化物酶，室溫孵育10 min，DAB顯色3 min，PBS洗滌，進(jìn)行蘇木精復(fù)染、脫水、透明、封片、顯微鏡下觀察，用Image-Pro Plus 6.0 圖像分析系統(tǒng)計(jì)算陽性細(xì)胞個數(shù)及其均值，陽性細(xì)胞呈棕黃色。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用GraphPad Prism 8.0對各組大鼠FXRFGF19通路、枯否細(xì)胞極化相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布采用±s表示，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清病毒相關(guān)指標(biāo)

與正常組相比，模型組血清HBsAg、HBeAg含量顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，核苷酸組、干擾素組、聯(lián)合組血清HBsAg、HBeAg含量顯著降低（P＜0.05），核苷酸組、干擾素組對比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），聯(lián)合組比干擾素組顯著降低（P＜0.05）（表1）。

表1 各組大鼠血清HBsAg、HBeAg水平（n=10，±s）

表1 各組大鼠血清HBsAg、HBeAg水平（n=10，±s）

*P＜0.05 vs正常組；#P＜0.05 vs模型組；△P＜0.05 vs干擾素組

組別HBsAg（IU/mL）HBeAg（IU/mL）正常組1.33±0.22 8.67±1.06模型組4.33±0.74*50.88±3.12*核苷酸組3.25±0.68*#40.44±2.01*#干擾素組3.37±0.71*#40.60±2.03*#聯(lián)合組2.59±0.31*#△24.32±1.86*#△

2.2 各組大鼠血清肝功能相關(guān)指標(biāo)

與正常組相比，模型組血清ALT、AST、TBIL水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，核苷酸組、干擾素組、聯(lián)合組血清ALT、AST、TBIL水平顯著降低（P＜0.05），核苷酸組、干擾素組對比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），聯(lián)合組比干擾素組顯著降低（P＜0.05）（表2）。

表2 各組大鼠血清中ALT、AST、TBIL水平（n=10，±s）

表2 各組大鼠血清中ALT、AST、TBIL水平（n=10，±s）

*P＜0.05 vs正常組；#P＜0.05 vs模型組；△P＜0.05 vs干擾素組

組別ALT（U/L） AST（U/L）TBIL（μmoL/L）正常組 50.66±2.89155.85±6.26 3.69±0.88模型組540.26±8.59*630.94±12.58*15.25±2.02*核苷酸組329.51±6.77*#595.66±8.74*#13.47±1.79*#干擾素組336.55±6.78*#586.47±8.71*#13.55±1.81*#聯(lián)合組280.39±4.54*#△396.44±7.01*#△10.28±1.06*#△

2.3 各組肝組織形態(tài)

各組H-E染色結(jié)果顯示，正常組肝組織結(jié)構(gòu)正常，肝小葉完整，肝細(xì)胞排列整齊、有序，未見明顯炎癥細(xì)胞浸潤；模型組肝小葉結(jié)構(gòu)遭到破壞，肝細(xì)胞排列紊亂并出現(xiàn)空泡化，可見大量細(xì)胞壞死，肝竇擴(kuò)張，出現(xiàn)大量炎癥細(xì)胞及纖維化細(xì)胞浸潤。與模型組比較，核苷酸組、干擾素組、聯(lián)合組病理結(jié)構(gòu)明顯改善，炎癥細(xì)胞及壞死細(xì)胞明減少（圖1）。

圖1 各組大鼠肺組織H-E染色，標(biāo)尺=25 μm。A：正常組；B：模型組；C：核苷酸組；D：干擾素組；E：聯(lián)合組.

2.4 各組大鼠肝組織FXR-FGF19通路蛋白表達(dá)結(jié)果

與正常組相比，模型組大鼠肝組織FXR、FGF19蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05）；與模型組相比，核苷酸組、干擾素組、聯(lián)合組大鼠肝組織FXR、FGF19蛋白升高，核苷酸組、干擾素組對比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），聯(lián)合組比干擾素組顯著升高（P＜0.05）（圖2）。

圖2 各組大鼠肝組織FXR、FGF19蛋白表達(dá)電泳圖及相對表達(dá)量。*P＜0.05 vs正常組；#P＜0.05 vs模型組；△P＜0.05 vs干擾素組.

2.5 各組大鼠血清腫瘤標(biāo)志物

與正常組相比，模型組肝組織iNOS、CD163陽性表達(dá)率顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，核苷酸組肝組織iNOS陽性表達(dá)率顯著降低（P＜0.05），CD163陽性表達(dá)率顯著升高（P＜0.05）；與核苷酸組相比，干擾素組肝組織iNOS、CD163陽性表達(dá)率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與干擾素組相比，聯(lián)合組肝組織iNOS陽性表達(dá)率顯著降低（P＜0.05），CD163陽性表達(dá)率顯著升高（P＜0.05）（表3，圖3）。

圖3 各組大鼠肝組織iNOS（A1～E1）、CD163（A2～E2）的表達(dá)（箭頭所指為陽性細(xì)胞），免疫組織化學(xué)顯色，標(biāo)尺=20 μm。A：正常組；B：模型組；C：核苷酸組；D：干擾素組；E：聯(lián)合組.

表3 各組大鼠肝組織iNOS、CD163陽性表達(dá)率（n=10，±s，%）

表3 各組大鼠肝組織iNOS、CD163陽性表達(dá)率（n=10，±s，%）

*P＜0.05 vs正常組；#P＜0.05 vs模型組；△P＜0.05 vs干擾素組

組別iNOS（%）CD163（%）正常組10.66±1.53 9.85±1.46模型組35.88±1.89*30.94±1.68*核苷酸組29.33±1.77*#45.66±1.76*#干擾素組29.56±1.81*#45.98±1.79*#聯(lián)合組20.79±1.64*#△56.25±2.01*#△

3 討論

慢性乙型肝炎是一個全球性嚴(yán)重公共衛(wèi)生問題，探尋一種有效的治療手段勢在必行[8-9]。故就核苷（酸）類似物聯(lián)合聚乙二醇干擾素對慢性乙型肝炎大鼠FXR-FGF19通路、枯否細(xì)胞極化的影響進(jìn)行研究探討，為聯(lián)合治療提供理論基礎(chǔ)。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，聚乙二醇干擾素與拉米夫定等核苷（酸）類似物互補(bǔ)，故諸多學(xué)者對二者進(jìn)行了聯(lián)合治療的研究，且取得了喜人的成果，因此核苷（酸）類似物聯(lián)合聚乙二醇干擾素治療慢性乙型肝炎越來越受到醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的關(guān)注及重視[10-12]。本研究結(jié)果顯示，核苷（酸）類似物聯(lián)合聚乙二醇干擾素可有效減輕乙型肝炎病毒感染，并改善大鼠肝功能。分析原因可能是，核苷（酸）類似物聯(lián)合聚乙二醇干擾素在清除病毒的同時，保證機(jī)體免疫功能不受影響，從而抑制機(jī)體免疫炎癥反應(yīng)，改善肝組織炎癥和壞死，進(jìn)而抑制成纖維細(xì)胞活化、增殖，抑制細(xì)胞外基質(zhì)的沉積，最終有效改善肝組織炎癥損傷及肝纖維化。何衛(wèi)美等研究表明[13]，對于乙型肝炎感染大鼠，拉米夫定聯(lián)合苦參堿可顯著降低血清ALT、AST、TBIL水平，降低乙型肝炎感染引起的肝損傷，這與本文結(jié)果類似。

近年研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)XR-FGF19通路可能在肝炎癥、損傷、纖維化中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，因此該通路目前已經(jīng)成為臨床研究的重點(diǎn)之一[14-15]。本研究結(jié)果表明，核苷（酸）類似物聯(lián)合聚乙二醇干擾素可顯著激活FXR-FGF19通路。分析原因可能是，核苷（酸）類似物聯(lián)合聚乙二醇干擾素通過調(diào)控相關(guān)信號，來激活FXR，從而促進(jìn)FXR與FGF19結(jié)合，激活FXR-FGF19通路，進(jìn)而調(diào)控下游靶基因的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)，抑制肝細(xì)胞的凋亡、拮抗促纖維化細(xì)胞因子表達(dá)等，最終有效改善肝損傷及纖維化。夏恩蕊等研究發(fā)現(xiàn)[16]，在非酒精性脂肪性肝炎大鼠中FXR-FGF19通路蛋白呈低表達(dá)，給予治療后FXRFGF19通路被激活，疾病癥狀得到顯著改善，這與本研究結(jié)果類似。

研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞可通過極化參與肝纖維化的調(diào)控，而枯否細(xì)胞是體內(nèi)最大的巨噬細(xì)胞群，其M1/M2表型失衡是慢性乙型肝炎等慢性炎癥性疾病發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[17-19]。本研究結(jié)果顯示，核苷（酸）類似物聯(lián)合聚乙二醇干擾素可抑制枯否細(xì)胞M1極化，促進(jìn)枯否細(xì)胞M2極化。分析原因可能是，核苷（酸）類似物聯(lián)合聚乙二醇干擾素通過抑制免疫炎癥反應(yīng)，來抑制枯否細(xì)胞聚集、浸潤，從而抑制其向M1型極化，促進(jìn)M2極化，進(jìn)而抑制炎癥細(xì)胞募集，抑制促炎癥細(xì)胞因子的分泌，促進(jìn)抑炎因子的分泌等，最終達(dá)到抑制肝纖維化的形成，改善疾病癥狀的目的。蘇思標(biāo)研究發(fā)現(xiàn)[20]，抑制枯否細(xì)胞M1極化，促進(jìn)枯否細(xì)胞M2極化，維持M1/M2的極化平衡，可顯著減少促炎癥因子的產(chǎn)生，抑制肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展，這與本文結(jié)果類似。

綜上所述，核苷（酸）類似物聯(lián)合聚乙二醇干擾素可顯著激活FXR-FGF19通路，并抑制枯否細(xì)胞M1極化，促進(jìn)枯否細(xì)胞M2極化，對慢性乙型肝炎大鼠具有改善作用。