糖膠樹果莢非生物堿化學(xué)成分研究

張 濤，陳 鵬，秦鵬飛，汪 豪

（中國藥科大學(xué) 中藥學(xué)院，江蘇 南京 210009）

糖膠樹Alstonia scholaris為夾竹桃科雞骨常山屬植物，為多年生喬木，主要分布于我國云南、廣西、臺灣等地，南亞、東南亞、澳洲地區(qū)也有分布[1]。糖膠樹葉是云南傣族傳統(tǒng)藥物，稱為“買擔(dān)別”，適用于治療咳嗽、胃痛、痰多等?！蛾懘ū静荨穂2]記載糖膠樹皮、葉均入藥，可用以鎮(zhèn)咳、退熱，及治療哮喘、氣管炎等病癥。目前，糖膠樹的化學(xué)成分研究主要報道糖膠樹葉、莖及根的生物堿等化學(xué)成分[3-5]，糖膠樹果莢的化學(xué)成分未見報道。為了尋找糖膠樹抗炎活性成分，本文采用色譜及波譜技術(shù)對糖膠樹果莢非生物堿萃取部位進行了分離鑒定，得到9 個化合物。其中，高根二醇(1)，鈍雞蛋花素(2)，(24S)-9, 19-cycloart-25-ene-3β, 24-diol(3)，2, 2' - 氧 代雙(1, 4)-二叔丁苯(5)，熊竹素(6)，腺苷(7)，橙黃胡椒酰胺乙酸酯(8)，橙黃胡椒酰胺(9)為首次從糖膠樹中分離得到。

1 材料與儀器

1.1 儀器與試劑

Avance 300 及 500 核磁共振儀（瑞士Bruker 公司）；Agilent 1260 高效液相色譜儀（美國安捷倫科技公司）；LC-MS 2020 質(zhì)譜儀、LC-8A 型制備HPLC（日本島津公司）；柱色譜硅膠（200 ～ 300 目，青島海洋化工研究所）；ODS 色譜填料（50 μm，日本YMC公司）；Sephadex LH-20 色譜填料（美國GE 公司）；島津Inertsil ODS-3 C18分析色譜柱 (4.6 mm×250 mm,5 μm)；島津Shim-pcak PRC-ODS C18制備色譜柱(20 mm×250 mm, 15 μm)；試劑均為市售分析純，高效液相用試劑為色譜純。

1.2 材料

糖膠樹果莢樣品于2020 年9 月采自中國云南省，經(jīng)暨南大學(xué)張曉琦教授鑒定為糖膠樹Alstonia scholaris果莢，標(biāo)本存放于中國藥科大學(xué)天然藥物化學(xué)研究室。

2 提取分離

取糖膠樹干燥果莢10 kg，粉碎成粗粉，用95%乙醇滲漉提取，共15 d，減壓濃縮合并的乙醇提取液。濃縮液加入2 mol/ L 鹽酸調(diào)至pH = 2 ～ 3，混懸液加入乙酸乙酯進行3 次萃取，萃取液合并，減壓回收得到非生物堿萃取部分。非生物堿萃取部位上樣于硅膠柱，石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫（100 : 0 ～ 0 : 100），經(jīng)薄層色譜（TLC）檢識，合并相同流分，得到Frs.1 ～ 6，取Fr.4（78.5 g） 經(jīng) 硅 膠 柱 色 譜 分 離， 二 氯 甲烷-甲醇梯度洗脫（100 : 0 ～ 85 : 15）得到5 個流分Frs.4-1 ～ 4-5，F(xiàn)r.4-1（21.3 g） 經(jīng)ODS 中 壓 色譜分離，甲醇- 水梯度洗脫（20 : 80 ～ 90 : 10）得 到4 個 流 分Frs.4-1-1 ～ 4-1-4， 取Fr.4-1-3（9.7 g）經(jīng)制備HPLC（85%甲醇- 水，流速：10 mL/ min）制備得化合物1 (4.3 mg,tR= 33.7 min)，2 (5.5 mg,tR= 33.9 min)，3 (5.4 mg,tR= 47.2 min)， 取Fr.4-1-4（3.1 g）經(jīng)制備HPLC（90%甲醇-水，流速：10 mL /min）制備得化合物4 (21.3 mg,tR= 35.5 min)，5 (4.1 mg,tR= 54.9 min)。Fr.4-4（10.4 g）經(jīng)ODS 中壓色譜分離,甲醇-水梯度洗脫（10 : 90 ～ 100 : 0）得到6 個流分Frs.4-4-1 ～ 4-4-6。取Fr.4-4-2（2.7 g）經(jīng)Sephadex LH-20 分離，甲醇-水（60 : 40）得到2 個流分Fr.4-4-2-1 ～ 4-4-2-2，取Fr.4-4-2-1（1.1 g）經(jīng)制備HPLC（80%甲醇-水，流速：10 mL/ min）得到化合物6 (4.3 mg,tR= 8.2 min)，取Fr.4-4-2-2（330.7 mg）經(jīng)制備HPLC（10%甲醇-水，流速：10 mL/ min）得到化合物7 (5.5 mg,tR= 21.1 min)。Fr.4-4-3（1.3 g）經(jīng)Sephadex LH-20 分離，三氯甲烷-甲醇（1 : 1）得到2 個 流 分Fr.4-4-3-1 ～ 4-4-3-2， 取Fr.4-4-3-1（700.4 mg）經(jīng)制備HPLC（85%甲醇-水，流速：10 mL/ min）制備得化合物8 (26.1 mg,tR= 7.9 min)，取Fr.4-4-3-2（131.6 mg）經(jīng)制備HPLC（80%甲醇-水，流速：10 mL/ min）制備得化合物9 (7.6 mg,tR= 21.3 min)。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：白色無定形粉末， 分子式為C30H50O2，香草醛濃硫酸顯紫色。1H-NMR (500 MHz,CDCl3) δ: 5.19 (1H, t,J=3.9 Hz, H-12), 3.55 (1H, d,J=10.9 Hz, H-28a), 3.23 (1H, m, H-3), 3.21 (1H, d,J=10.9 Hz, H-28b), 1.17, 0.99, 0.94, 0.93, 0.89, 0.88, 0.79(3H×7, s, CH3×7)。13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ: 144.4(C-13), 122.5 (C-12), 79.2 (C-3), 69.9 (C-28), 53.4 (C-5),47.8 (C-9, 17), 46.6 (C-19), 42.5 (C-18), 41.9 (C-14), 39.9(C-8), 39.0 (C-4), 38.8 (C-1), 37.1 (C-10), 34.3 (C-21), 33.3(C-29), 32.7 (C-7), 31.2 (C-22), 31.1 (C-20), 28.3 (C-23),27.4 (C-2), 26.1 (C-27), 25.7 (C-15), 23.8 (C-11), 23.7 (C-30), 22.2 (C-16), 18.4 (C-6), 16.9 (C-26), 15.7 (C-24), 15.6(C-25)。以上數(shù)據(jù)與文獻[6]基本一致，鑒定為高根二醇（erythrodiol）。

化合物2：白色粉末，分子式為C30H50O2，ESIMSm/z: 465 [M+Na]+，香草醛濃硫酸顯紫色。1H-NMR(500 MHz, CDCl3) δ: 5.14 (1H, t,J=3.3 Hz, H-12), 3.52(1H, d,J=11.0 Hz, H-27a), 3.22 (1H, dd,J=5.1, 11.2 Hz, H-3), 3.19 (1H, d,J=10.9 Hz, H-27b), 1.78 (1H, td,J=4.7, 13.8 Hz, H-11), 1.56 (1H, m, H-7b), 1.33 (1H, m,H-7a), 1.1 (3H, s, H-28), 0.99 (3H, s, H-23), 0.98 (3H, s,H-24), 0.93 ～ 0.95 (7H, s, H-26, 29), 0.81 (1H, m, H-20),0.80 (3H, d,J=5.7 Hz, H-30), 0.79 (3H, s, H-25), 0.73(1H, d,J=12.1 Hz, H-5)。13C-NMR (125 MHz, CDCl3)δ: 138.9 (C-13), 125.1 (C-12), 79.2 (C-3), 70.0 (C-27),55.3 (C-5), 54.2 (C-18), 47.8 (C-9), 42.2 (C-14), 40.2(C-8), 39.6(C-19), 39.5(C-20), 38.9 (C-1), 38.9 (C-17), 38.2(C-4), 37.0 (C-10), 35.3 (C-22), 32.9 (C-7), 30.8 (C-21),28.3 (C-23), 27.4 (C-2), 26.2 (C-16), 23.5 (C-11, 15),23.5 (C-28), 21.5 (C-29), 18.5 (C-6), 17.5 (C-30), 16.9(C-24), 15.8 (C-26), 15.7 (C-25)。以上數(shù)據(jù)與文獻[7]基本一致，鑒定為鈍雞蛋花素(obtusalin)。

化合物3：白色無定形粉末， 分子式為C30H50O2，ESI-MSm/z: 465 [M+Na]+，香草醛濃硫酸顯 藍 色。1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ: 4.92 (1H, s,H-26a), 4.84 (1H, s, H-26b), 4.03 (1H, t,J=5.9 Hz, H-24),3.28 (1H, m, H-3), 1.72 (3H, s, H-27), 0.96 (6H, s, H-18,29), 0.88 (6H, m, H-21, 28), 0.80 (3H, s, H-30), 0.55 (1H,d,J=3.4 Hz, H-19a), 0.32 (1H, d,J=2.8 Hz, H-19b)。13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ: 147.6 (C-25), 111.6 (C-26), 79.0 (C-3, 24), 52.3 (C-17), 49.0 (C-14), 48.1 (C-6), 47.2 (C-5), 45.4 (C-13), 40.6 (C-4), 36.1 (C-20), 35.7(C-12), 33.0 (C-15), 32.1 (C-1), 32.0 (C-22), 31.6 (C-23),30.5 (C-2), 30.1 (C-19), 28.2 (C-7), 26.6 (C-16), 26.2(C-11), 26.2 (C-10), 25.6 (C-30), 21.3 (C-6), 20.1 (C-9),19.5 (C-28), 18.5 (C-21), 18.2 (C-18), 17.4 (C-27), 14.1(C-29)。以上數(shù)據(jù)與文獻[8]基本一致，鑒定為(24S)-9,19-cycloart-25-ene-3β, 24-diol。

化合物4：白色無定形粉末，分子式C30H50O2，ESI-MSm/z: 465 [M+Na]+，香草醛濃硫酸顯紫色。1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ: 5.59 (2H, m, H-23, 24),3.28 (1H, m, H-3), 1.31 (6H, s, H-26, 27), 0.96 (6H, s,H-28, 29), 0.88 (3H, s, H-18), 0.85 (3H, d,J=10.6 Hz,H-20), 0.80 (3H, s, H-30), 0.54 (1H, d,J=3.8 Hz, H-19a),0.32 (1H, d,J=4.1 Hz, H-19b)。13C-NMR (125 MHz,CDCl3) δ: 139.5 (C-24), 125.7 (C-23), 78.9(C-3), 70.9(C-25), 52.2 (C-17), 48.9 (C-14), 48.1 (C-8), 47.2 (C-5),45.4 (C-13), 40.6 (C-4), 39.2 (C-22), 36.5 (C-20), 35.7(C-12), 32.9 (C-15), 32.1 (C-1), 30.5 (C-2), 30.1 (C-19),30.0 (C-26), 30.0 (C-27), 28.2 (C-7), 26.6 (C-16), 26.2(C-11), 26.1 (C-10), 25.6 (C-30), 21.3 (C-6), 20.1 (C-9),19.4 (C-28), 18.4 (C-21), 18.2 (C-18), 14.2 (C-29)。以上數(shù)據(jù)與文獻[9]基本一致，鑒定為cycloart-23-ene-3β, 25-diol。

化合物5：白色簇晶，分子式為C28H42O，ESIMSm/z: 417 [M+Na]+。1H-NMR (300 MHz, DMSO-d6)δ: 7.41 (2H, d,J=8.7 Hz, H-6, 6' ), 7.36 (2H, t,J=2.1 Hz,H-3, 3' ), 7.26 (2H, dd,J=2.4, 8.6 Hz, H-5, 5' ), 1.29 (18H,s, H-8, 9, 10, 8' , 9' , 10' ), 1.26 (18H, s, H-12, 13, 14,12' , 13' , 14' )。13C-NMR (75 MHz, DMSO-d6) δ: 147.3(C-2), 147.2 (C-2' ), 147.1 (C-1, 1' ), 138.1 (C-4), 138.1(C-4' ), 124.4 (C-3, 3' ), 124.3 (C-5, 5' ), 118.6 (C-6, 6' ),34.5 (C-7, 7' ), 34.4 (C-11, 11' ), 31.2 (C-8, 9, 10, 8' , 9' ,10' ), 29.9 (C-12, 13, 14, 12' , 13' , 14' )。以上數(shù)據(jù)與文獻[10]基本一致，鑒定為2, 2' -氧代雙(1, 4)-二叔丁苯[2, 2' -oxybis(1, 4)-di-tert-butybenzene]。

化合物6：淡黃色粉末，分子式為C17H14O6，ESIMSm/z: 313 [M-H]-，三氯化鋁噴霧顯色。1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ: 12.66 (1H, s, OH-5), 10.60 (1H, s,OH-4' ), 7.97 (2H, d,J=8.6 Hz, H-2' , 6' ), 6.95 (2H, d,J=8.6 Hz, H-3' , 5' ), 6.74 (1H, d,J=2.4 Hz, H-8), 6.36(1H, d,J=2.4 Hz, H-6), 3.86 (3H, s, OMe), 3.80 (3H, s,OMe)。13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6) δ: 178.0 (C-4), 165.1 (C-7), 161.0(C-5), 160.0 (C-4' ), 156.3 (C-9), 155.9 (C-2), 137.8 (C-3), 130.1 (C-2' , 6' ), 120.3(C-1' ), 115.6 (C-3' , 5' ), 105.2 (C-10), 97.7 (C-6),92.3 (C-8), 59.7 (OMe), 56.0 (OMe)。 以 上 數(shù) 據(jù) 與 文獻[11]基本一致，鑒定為熊竹素(kumatakenin)。

化合物7：白色粉末，分子式為C10H13N5O4，ESI-MSm/z: 290 [M+Na]+。1H-NMR (500 MHz,DMSO-d6) δ: 8.33 (1H, s, H-2), 8.12 (1H, s, H-8), 7.30(2H, s, H2N-6), 5.86 (1H, d,J=6.2 Hz, H-1' ), 5.37(2H, m, OH-2' , OH-5' ), 5.16 (1H, d,J=4.2 Hz, OH-3' ), 4.59 (1H, q,J=5.4, 10.8 Hz, H-2' ), 4.13 (1H, q,J=3.4,7.1 Hz, H-3' ), 3.96 (1H, q,J=3.5, 6.7 Hz, H-4' ), 3.66(1H, m, H-5a' ), 3.55 (1H, m, H-5b' )。13C- NMR (125 MHz, DMSO-d6) δ: 156.1(C-6), 152.3(C-2), 149.0 (C-4),139.8 (C-8), 119.3 (C-5), 87.9 (C-1' ), 85.9 (C-4' ), 73.4 (C-2' ), 70.6 (C-3' ), 61.6 (C-5' )。以上數(shù)據(jù)與文獻[12]基本一致，鑒定為腺苷(adenosine)。

化合物8：白色針晶，分子式為C27H28N2O4，ESI-MSm/z: 443 [M-H]-。1H-NMR (500 MHz,DMSO-d6) δ: 8.48 (1H, d,J=8.5 Hz, NH-β), 8.11 (1H,d,J=8.4 Hz, NH-α), 7.82 (2H, m, H-3', 7'), 7.53 (1H, m,H-5'), 7.46 (2H, m, H-4', 6'), 7.17-7.33 (10H, m, H-5 ～9, 4" ～ 8"), 4.69 (1H, m, H-2), 4.18 (1H, m, H-1"), 4.02(1H, dd,J=4.8, 11.0 Hz, H-9"a), 3.89 (1H, dd,J=6.7,11.0 Hz, H-9"b), 3.02 (2H, m, H-3), 2.81 (2H, m, H-2''),1.99 (3H, s, -OAc)。13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6) δ:171.1 (-OAc), 170.2 (C-1), 166.1 (C-1'), 138.3 (C-3''),137.9 (C-4), 134.0 (C-2'), 131.2 (C-5'), 129.1 (C-6, 8,5'', 7''), 128.1 (C-4'', 8''), 128.1 (C-5, 9), 128.0 (C-3', 7'),127.4 (C-4', 6), 126.1 (C-7, 6''), 64.6 (C-9''), 54.8 (C-2),49.1 (C-1''), 37.2 (C-2''), 36.3 (C-3), 20.6 (OCOCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻[13]基本一致，鑒定為橙黃胡椒酰胺乙酸酯(aurantiamide acetate)。

化合物9： 白色粉末，分子式為C25H26N2O3，ESIMSm/z: 401 [M-H]-。1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ:8.47 (1H, d,J=8.2 Hz, 6-NH), 7.86 (1H, d,J=8.0 Hz, 3-NH),7.1-7.24 (15H, m, Ar-H), 4.69 (1H, m, H-5) 3.92(1H, m,H-2), 3.31(2H, m, H-1), 3.02(1H, dd,J=4.5, 13.8 Hz, H-8a),2.95 (1H, dd,J=3.2, 13.4 Hz, H-8b), 2.87 (1H, dd,J=5.6,13.6 Hz, H-9a), 2.68 (1H, dd,J=5.6, 13.6 Hz, H-9b)。13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6) δ: 170.8 (C-4), 166.1 (C-7), 138.9 (C-1'''), 138.5 (C-1''), 134.1 (C-1'), 131.2 (C-4'),129.1 (C-2'', 6'', 2''', 6'''), 128.1 (C-3', 5'), 128.0 (C-3'', 5'',3''', 5'''), 127.9 (C-2'), 127.3 (C-6'), 126.1 (C-4''), 125.8 (C-4'''), 62.2 (C-1), 54.8 (C-5), 52.5 (C-2), 37.2 (C-8), 36.4 (C-9)。以上數(shù)據(jù)與文獻[14]基本一致，鑒定為橙黃胡椒酰胺(aurantiamide)。

4 討論

糖膠樹作為傣族的民間藥物，具有止咳平喘、抗炎、鎮(zhèn)痛、抗氧化等多種藥理活性。目前，對糖膠樹的化學(xué)成分及藥理活性研究主要集中在單萜吲哚生物堿類成分，糖膠樹中的吲哚生物堿具有抑制LPS-誘導(dǎo)的氣道炎癥以及舒張支氣管和心血管的作用，是發(fā)揮止咳平喘和抗炎的主要藥效活性成分[15-16]。然而，隨著糖膠樹化學(xué)成分以及藥理研究的不斷深入，相關(guān)研究表明糖膠樹的三萜類成分結(jié)構(gòu)豐富，具有較好的抗腫瘤、抗炎及增強免疫力的作用[17-18]，黃酮類成分具有較強的平喘和抗急性炎癥的作用[19]，因此有必要對糖膠樹非生物堿成分進行研究。本研究對糖膠樹果莢非生物堿部位化學(xué)成分進行了分離及結(jié)構(gòu)鑒定，其中，4 個三萜類、1 個黃酮類和2 個酰胺類化合物，三萜類化合物具有抗腫瘤、抗炎、抗菌、降血糖等活性[20-21]，以上研究為進一步研究糖膠樹抗炎活性提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

5 結(jié)論

本研究運用制備HPLC 等色譜技術(shù)對糖膠樹果莢的非生物堿部分進行化合物的分離和純化，通過NMR，ESI-MS 等波譜技術(shù)鑒定化合物結(jié)構(gòu)，共分離鑒定出9 個化合物，分別為：高根二醇(1)、鈍雞蛋 花 素(2)、(24S)-9, 19-cycloart-25-ene-3β, 24-diol (3)、cycloart-23-ene-3β, 25-diol(4)、2, 2' -氧代雙(1, 4)-二叔丁苯(5)、熊竹素(6)、腺苷(7)、橙黃胡椒酰胺乙酸酯(8)、橙黃胡椒酰胺(9)?；衔? ～3，5 ～9 均為首次在糖膠樹中分離得到，豐富了糖膠樹化合物組分信息庫，為糖膠樹綜合開發(fā)利用提供科學(xué)數(shù)據(jù)。