基于Plackett-Burman 和Box-Behnken 設計優(yōu)化艾葉揮發(fā)油的提取工藝

王 萍，許 剛，廖予菲*，張瑞瑞，李 騰

（1.陜西國際商貿學院 醫(yī)藥學院，陜西 西安 712046；2.陜西省中藥綠色制造技術協同創(chuàng)新中心，陜西西安 712046；3.陜西步長制藥有限公司，陜西 西安 710075）

艾葉為菊科植物艾Artemisia argyiLevl.et Vant.的干燥葉，為我國傳統中藥,性溫，味辛、苦，具有溫經止血、散寒止痛、外用祛濕止癢等功效，主要用于治療吐血、衄血、崩漏、月經過多、胎漏下血、少腹冷痛、經寒不調、宮冷不孕等癥；外治皮膚瘙癢。醋艾炭溫經止血，用于虛寒性出血[1]。艾葉揮發(fā)油含量較為豐富，是其主要活性成分之一，具有抑菌、平喘、鎮(zhèn)咳等作用[2-5]，已逐漸應用到醫(yī)藥、香料、化妝品等多個領域。

目前，關于植物揮發(fā)油提取方法的研究報道較多，如：水蒸氣蒸餾法、超臨界流體萃取法、微波萃取法等[6-9]方法，其中，水蒸氣蒸餾法具有操作簡便、成本低、污染小等優(yōu)點，在生產上應用廣泛。為此，本試驗以艾葉為研究對象，以揮發(fā)油得率為考察指標，研究水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油的工藝參數，從而確定最佳提取條件。

1 材料

1.1 藥物與試劑

艾葉采自陜西國際商貿學院校區(qū)，由陜西國際商貿學院生藥教研室雷國蓮教授鑒定為菊科植物艾Artemisia argyiLevl.et Vant.的葉，陰干后粉碎。

石油醚（批號：20210628，分析純，上海凌峰化學試劑有限公司）；無水硫酸鈉（批號：20210819，分析純）、氯化鈉（批號：20200105，分析純），均購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 主要儀器

BT125D 型電子天平[賽多利斯科學儀器（北京）有限公司]；ZNHW 型智能恒溫電熱套(上海科興儀器有限公司)；FW-100 型高速萬能粉碎機（北京科偉永興儀器有限公司）。

2 方法

2.1 揮發(fā)油提取方法

取過40 目的艾葉粉末100 g，精密稱定，根據2020 年版《中國藥典》（四部）揮發(fā)油測定法[10]，在加熱前于揮發(fā)油提取器中加入2.5 mL 石油醚，按照一定試驗條件提取，收集石油醚液體，用無水硫酸鈉除去水分，置干燥至恒重的燒杯中，揮干石油醚，稱定重量，計算揮發(fā)油得率。

2.2 單因素試驗考察揮發(fā)油提取工藝

稱取艾葉100 g，按“2.1”項下方法提取，考察藥材粒度（＜10 目、10 目、20 目、30 目、＞30 目）、液料比（5 : 1、10 : 1、15 : 1、20 : 1、25 : 1）、浸泡時間（1、2、3、4、5 h）、提取時間（3、4、5、6、7 h）及氯化鈉濃度（0、0.5%、1%、3%、5%、7%）對艾葉揮發(fā)油得率的影響。

2.3 Plackett-Burman 試驗設計篩選主要因素

參照單因素試驗結果，以艾葉揮發(fā)油得率為考察指標，運用 Design-Expert 軟件對影響揮發(fā)油得率的5 個因素進行Plackett-Burman 試驗設計，篩選出主要因素，因素水平設計見表1。

表1 Plackett-Burman 試驗因素水平表Tab.1 Factors and levels for Plackett-Burman test design

2.4 響應面試驗

結合單因素試驗和Plackett-Burman 試驗設計結果，以藥材粒度、液料比、浸泡時間、提取時間為自變量，以揮發(fā)油得率為響應值，采用 Box-Behnken試驗優(yōu)化其提取工藝，因素水平表見表2。

表2 響應面試驗因素水平表Tab.2 Factors and levels for response surface test

2.5 統計學方法

所有試驗重復三次，取平均值，用SPSS 20.0 軟件對試驗數據進行統計分析，Plackett-Burman 試驗設計和響應面試驗設計及分析采用 Design Expert 8.0.6。

3 結果

3.1 單因素試驗結果

3.1.1 藥材粒度的考察 不同粒度藥材在液料比為15 : 1 的3%氯化鈉中浸泡4 h，提取4 h，考察藥材粒度對揮發(fā)油得率的影響，結果見圖1A。結果表明，隨著粉碎度的增加，揮發(fā)油得率出現先增加后降低的趨勢，這可能是粉碎度越大，藥材粉末越小，揮發(fā)油損失的越多，由此可見，藥材粒度為＜10 目、10 目、20 目，揮發(fā)油得率有最大值。

圖1 單因素實驗結果Fig.1 Results of single factors test

3.1.2 液料比的考察 取艾葉粉末（10 目），加入不同液料比的3% 氯化鈉中浸泡4 h，提取4 h，考察液料比對揮發(fā)油得率的影響，結果見圖1B。結果表明，隨著液料比的增加，揮發(fā)油得率出現先增加后降低的趨勢，當液料比為15 : 1 時，揮發(fā)油得率最大，由此可見，液料比在10 ～ 20倍，揮發(fā)油得率有最高值。

3.1.3 浸泡時間的考察 取艾葉粉末（10 目），加入液料比為15 : 1 的3%氯化鈉中提取4 h，考察浸泡時間對揮發(fā)油得率的影響，結果見圖1C。結果表明，浸泡時間低于4 h，揮發(fā)油得率明顯增加，高于4 h，揮發(fā)油得率有所下降，因此，浸泡時間在3 ～ 5 h，揮發(fā)油得率有最高值。

3.1.4 提取時間的考察 取艾葉粉末（10 目），加入液料比為15 : 1 的3%氯化鈉中浸泡4 h，考察不同提取時間對揮發(fā)油得率的影響，結果見圖1D。結果表明，提取時間大于4 h，揮發(fā)油得率增加趨于平緩，說明提取4 h，基本上已將艾葉中的揮發(fā)油提取完全，因此，提取時間在3 ～ 5 h，揮發(fā)油得率有最高值。

3.1.5 氯化鈉濃度的考察 取艾葉粉末（10 目），加入液料比為15 : 1 氯化鈉中浸泡4 h，提取4 h，考察不同濃度氯化鈉濃度對揮發(fā)油得率的影響，結果見圖1E。結果表明，加入氯化鈉揮發(fā)油的得率明顯高于不加氯化鈉揮發(fā)油的得率，且氯化鈉濃度高于3%，揮發(fā)油得率增加趨于平緩，因此，氯化鈉濃度在1% ～ 5%，揮發(fā)油得率有最高值。

3.2 Plackett-Burman 試驗設計結果及方差分析

依據Plackett-Burman 試驗設計，篩選對揮發(fā)油影響的主要因素，每組試驗重復三次，取平均值，結果見表3，方差分析見表4。

表3 Plackett-Burman 試驗設計及結果表Tab.3 Experimental design and results of Plackett-Burman design

表4 Plackett-Burman 模型方差分析表Tab.4 Analysis of variance of Plackett-Burman model

由表4 可以看出，藥材粒度、液料比、浸泡時間、提取時間對揮發(fā)油得率有顯著性影響，其中浸泡時間和提取時間對揮發(fā)油得率的影響極顯著，而氯化鈉濃度對揮發(fā)油得率無顯著性影響，故而氯化鈉濃度選擇3%，藥材粒度、液料比、浸泡時間、提取時間為響應面試驗中的考察因素。

3.3 Box-Behnken 響應面試驗

3.3.1 試驗設計結果 應用 Box-Behnken 試驗設計，試驗結果見表5。

表5 響應面試驗設計及結果表Tab.5 Design and results of response surface test

3.3.2 模型擬合與方差分析 運用Design -Expert8.0.6 軟件表5 中的試驗結果進行回歸分析，得到多元回歸擬合方程Y= 0.67 + 0.005A+ 0.53B+0.24C+ 0.063D- 0.33AB- 0.015AC- 0.0025AD+0.035BC+ 0.005BD+ 0.067CD- 0.13A2- 0.086B2-0.061C2- 0.080D2，由回歸方程可知，影響因素的順序為B ＞C ＞D ＞A，對其進行方差分析，結果見表6。

表6 響應面試驗方差分析表Tab.6 Analysis of variance of response surface test

由表6 可知，模型P＜0.00 1，失擬項為0.708，說明本試驗方法可靠，未知因素對本試驗的結果影響較?。挥钟蓻Q定系數R2= 0.985 0，R2= 0.970 0，模型的變異系數CV= 3.31%，說明該模型的擬合程度比較好，試驗誤差小，用此模型方程能很好地反映真實的試驗值。此外，表6 反映出，因素B、C、D、AB、BC、CD、A2、B2、C2、D2對揮發(fā)油得率有極顯著的影響，其他因素對綜合得分無顯著性影響。為進一步研究相關變量的交互作用和確定最佳工藝提供可視化分析，利用Design-Expert 軟件對回歸模型進行響應面分析，得到響應立體分析圖譜見圖2。

圖2 各因素交互作用的響應面圖和等高線圖Fig.2 Response Surface and contour map of the interaction of various factors

由圖2 可知，各因素對艾葉揮發(fā)油得率均呈現先增大后降低的趨勢，其中，浸泡時間與提取時間的響應面圖最為陡峭，等高線圖呈明顯的橢圓形，表明浸泡時間與提取時間的交互作用最為顯著，這與表6的分析結果一致。

由Design-Expert 8.0.6 軟件得出的艾葉揮發(fā)油最佳提取工藝參數為藥材粒度為9.10 目，液料比為17.48 倍，浸泡時間為4.75 h，提取時間為4.73 h；考慮到操作的實際性，調整最優(yōu)條件為藥材粒度過10 目，液料比為17.5 : 1，浸泡時間為4.5 h，提取時間為4.5 h。

3.4 驗證試驗

在氯化鈉濃度為3%的條件下，按照優(yōu)化的條件進行三次平行實驗，得到揮發(fā)油得率分別為0.72%、0.68%、0.71%，平均值為0.70%，RSD 為2.42%，與預測值相差0.02%，表明所選工藝穩(wěn)定性好。

4 討論

水蒸氣蒸餾法是揮發(fā)油提取的常用方法之一，但得率往往較低。由單因素實驗結果可知，艾葉水蒸氣蒸餾液中加入氯化鈉后，揮發(fā)油的得率明顯提高，這是因為無機小分子鹽的加入，改變了溶劑的極性，降低揮發(fā)油在水中的溶解度，從而提高了揮發(fā)油的得率，這與閆璽鎂等[11]研究結果一致，由此可知鹽析輔助提取揮發(fā)油的方法確實可行。

在前期實驗研究中還發(fā)現，藥材粒度、液料比、浸泡時間、提取時間對揮發(fā)油得率也有影響，因為藥材粉碎后，其比表面積增大，有利于提取，但粉碎度過大，粉末粒徑過于細小，造成溶液的黏稠性增大，不利于成分的擴散，進而提取率降低。藥材中揮發(fā)油的含量是一定的，提取溶劑太少，沒有足夠的水蒸氣，不足以將揮發(fā)油提取完全，溶劑太多，造成溶劑的浪費。浸泡時間過短，植物細胞沒有得到充分膨脹，在短時間內無法提取完全，浸泡時間過長，可能會造成化學成分改變；提取時間延長，有利于揮發(fā)油的提取完全，但提取時間過長，難以保證揮發(fā)油純度，從而降低揮發(fā)油得率，需要找到兩者之間的結合點。

Plackett-Burman 試驗是一種從多因素中篩選對響應值有顯著性影響因素的試驗設計方法，可以避免在后期的優(yōu)化試驗中由于因素數太多或部分因素不顯著而浪費試驗資源[12-16]。本研究中，采用該方法對影響艾葉揮發(fā)油的5 個因素進行篩選，結果顯示氯化鈉濃度在這5 個因素中對揮發(fā)油得率影響最小，因而在響應面試驗設計考察藥材粒度、液料比、浸泡時間、提取時間等對揮發(fā)油得率的影響，進而進行工藝優(yōu)化。

5 結論

本研究在單因素試驗的基礎上，采用 Plackett-Burman 設計篩選出對艾葉揮發(fā)油得率有明顯影響的因素及水平范圍，運用Box-Behnken 進行試驗設計，確定最佳提取工藝參數，即優(yōu)化的最佳工藝為藥材粒度為10 目、液料比為17.5 : 1、氯化鈉濃度為3%、浸泡時間為4.5 h、提取時間為4.5 h。然而在本研究中，只考察了氯化鈉對揮發(fā)油得率的影響，而其他鹽對揮發(fā)油的提取是否有同樣的影響及是否對揮發(fā)油中的化學成分有影響，還需進一步考察。