瑤藥紅牛膝質(zhì)量控制方法研究

DOI： 10.11931/guihaia.gxzw202301032

陳松， 雷沛霖， 黃瑞松， 等， 2024.

瑤藥紅牛膝質(zhì)量控制方法研究 ［Ｊ］.

廣西植物， 44（6）： 1007-1016.

CHEN S， LEI PL， HUANG RS， et al.， 2024.

Quality control method for Yao medicine Hongniuxi ［J］.

Guihaia， 44（6）： 1007-1016.

摘" 要：" 瑤藥紅牛膝為莧科植物柳葉牛膝（Achyranthes longifolia）的根及根莖，為瑤族地區(qū)習(xí)用藥材，目前僅有個(gè)別省區(qū)收載了其質(zhì)量控制方法。該文對(duì)廣西壯族自治區(qū)區(qū)內(nèi)采集的14批紅牛膝藥材進(jìn)行了性狀鑒別、顯微鑒別和薄層色譜鑒別，并采用飛諾美Gemini-NX C18色譜柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm），以乙腈-水溶液（15∶85）進(jìn)行等度洗脫，柱溫25 ℃，流速1.0 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)243 nm，建立紅牛膝中β-蛻皮甾酮的HPLC含量測(cè)定方法。結(jié)果表明：（1）紅牛膝藥材性狀、顯微鑒別特征明顯，顯微鑒別可見栓內(nèi)層、維管束、異常維管束、導(dǎo)管、射線細(xì)胞、草酸鈣砂晶或方晶等。（2）薄層色譜分離好，β-蛻皮甾酮和人參皂苷RO對(duì)應(yīng)的斑點(diǎn)清晰。（3）含量測(cè)定中，β-蛻皮甾酮在5.606～224.224 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r＝0.999 9），平均加樣回收率為97.68%，RSD為1.37%（n=6）。（4）14批樣品中β-蛻皮甾酮含量為0.005%～0.158%，平均含量為0.095%。該研究建立了完整的顯微鑒別、薄層鑒別及含量測(cè)定方法，為合理評(píng)價(jià)紅牛膝質(zhì)量和臨床合理用藥提供科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞： 柳葉牛膝， 性狀， 顯微鑒別， 薄層鑒別， 含量測(cè)定

中圖分類號(hào)：" Q946

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：" A

文章編號(hào)：" 1000-3142（2024）06-1007-10

收稿日期：" 2023-06-02" 接受日期： 2023-07-05

基金項(xiàng)目：" 廣西科技廳重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（桂科AB18221099）； 《廣西壯族自治區(qū)瑤藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（第二卷）》質(zhì)量評(píng)價(jià)與標(biāo)準(zhǔn)研究項(xiàng)目（MZY2017004）； 黃瑞松全國(guó)名老中醫(yī)藥專家傳承工作室項(xiàng)目。

第一作者： 陳松（1983—），副主任藥師，主要從事藥物質(zhì)量研究及民族藥制劑研發(fā)，（E-mail）84946936@qq.com。

*通信作者：" 黃瑞松，主任藥師，主要從事民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究及民族藥制劑研發(fā)，（E-mail）hrs3130064@163.com。

Quality control method for Yao medicine Hongniuxi

CHEN Song1， LEI Peilin1， HUANG Ruisong1*， LI Yunrong1， QU Xincheng2

（ 1. Guangxi International Zhuang Medicine Hospital， Nanning 530201， China; 2. Guangxi Institute of

Chinese Medicine amp; Pharmaceutical Science， Nanning 530022， China ）

Abstract：

Yao medicine Hongniuxi is the root and rhizome of Achyranthes longifolia， which is a commonly used medicinal herb in Yao ethnic areas. Currently， only a few provinces and regions have recorded the method for quality control of Hongniuxi. Microscopic method and thin layer chromatography （TLC） were qualitatively identified on the roots and rhizomes of 14 batches of Yao Medicine Hongniuxi collected in Guangxi Zhuang Autonomous Region in the study. The content of β-ecdysterone was determined by high performance liquid chromatography （HPLC）. The Phenomenex column （250 mm × 4.6 mm， 5 μm） was used， the mobile phase was acetonitrile-water （15∶85） ， the column temperature was 25 ℃， the flow rate was 1.0 mL·min-1， and the detection wavelength was at 243 nm. The results were as follows： （1） The character and microscopic identification methods of Hongniuxi were obvious. Microscopic identification showed the inner layer of thrombus， vascular bundle， abnormal vascular bundle， duct， ray cell， calcium oxalate sand crystal or square crystal， etc. （2） The TLC identification spots of β-ecdysterone and ginsenoside RO were clear， and the separation effect was good. （3） The β-ecdysterone showed a good linear relationship within the range of 5.606-224.224 μg （r＝0.999 9）， whose average recovery （n=6） was 97.68%， with the RSD of 1.37%. （4） Among 14 batches of samples， the contents of β-ecdysterone ranged from 0.005% to 0.158%， with an average content of 0.095%. This study establishes a complete method for microscopic identification， thin layer identification， and content determination， providing a scientific basis for rational evaluation of the quality of Hongniuxi and clinical rational drug use.

Key words： Achyranthes longifolia， character， microscopic identification， TLC identification， content determination

瑤藥紅牛膝為莧科植物柳葉牛膝（Achyranthes longifolia）的根及根莖，始見成書于公元1436年的《滇南本草》（蘭茂，1959）。近代本草《中藥大辭典》（南京中醫(yī)藥大學(xué)，2006）、《中華本草》（國(guó)家中醫(yī)藥管理局中華本草編委會(huì)，1999）將“柳葉牛膝”收載于“土牛膝”項(xiàng)下，作為土牛膝的一個(gè)基原。

紅牛膝在廣西各地及我國(guó)南北各省均有分布，生于山坡、溝谷、村旁，庭園亦有栽培，恭城藥市上常有交易（林春蕊等，2016），在廣西瑤族地區(qū)使用廣泛，瑤語(yǔ)稱之為“照腦咪”?！缎戮幹兴幹尽罚ㄐづ喔?， 2002）、《廣西恭城瑤族端午藥市藥用植物資源》（林春蕊等，2016）、《廣西植物名錄》（覃海寧和劉演，2010）等均對(duì)紅牛膝有記載。廣西恭城瑤族地區(qū)的瑤醫(yī)多以根入藥，瑤醫(yī)認(rèn)為其味苦、酸，性平，具有活血散瘀，祛風(fēng)除濕，清熱解毒，利尿功效，常用于治小兒感冒高熱、肺炎咳嗽、尿路感染、腎炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腰膝酸痛、腳氣水腫、閉經(jīng)、產(chǎn)后腹痛、跌打損傷、雞骨鯁喉、竹木刺傷、蜂蜇傷（覃迅云等，2002），其療效良好，具有較好的開發(fā)前景。

紅牛膝現(xiàn)收載于地方標(biāo)準(zhǔn)《江西省中藥飲片炮制規(guī)范》（江西省食品藥品監(jiān)督管理局，2009）中，其標(biāo)準(zhǔn)指標(biāo)有性狀、鑒別（粉末顯微鑒別）、檢查檢驗(yàn)項(xiàng)目（水分、總灰分、酸不溶性灰分），但缺少藥材橫切面、薄層色譜鑒別、含量測(cè)定等重要的定性定量檢測(cè)指標(biāo)。同時(shí)，柳葉牛膝與同屬植物土牛膝（A.bidentata）、粗毛牛膝（A. aspera）、鈍葉土牛膝（A. aspera var. indica）的原植物形態(tài)相似，生長(zhǎng)環(huán)境相同，各地存在混用情況（南京中醫(yī)藥大學(xué)，2006）。為區(qū)分鑒別藥材真?zhèn)?，正確評(píng)價(jià)藥材質(zhì)量?jī)?yōu)劣，確保臨床用藥安全有效，有必要制訂可有效控制瑤藥紅牛膝藥材質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)，為紅牛膝藥材的真?zhèn)舞b別和質(zhì)量評(píng)價(jià)提供法定依據(jù)。

紅牛膝主要含有皂苷、生物堿、強(qiáng)心苷、三萜類化合物、甾體化合物、揮發(fā)油及有機(jī)酸等化學(xué)成分（國(guó)家中醫(yī)藥管理局中華本草編委會(huì)，1999）。其中，β-蛻皮甾酮是其主要活性成分之一，具有促進(jìn)蛋白質(zhì)合成（Gorelick-Feldman et al.，2008），抗心律失常（吳旭等，2002），抑制上皮細(xì)胞凋亡保護(hù)心?。▍切?，2006；夏西超等，2013），抑制血糖上升（張慶遠(yuǎn)等，2015），通經(jīng)活絡(luò)、除濕鎮(zhèn)痛等作用（王景富，2017），可治療骨質(zhì)疏松癥（于大永等，2011；湯樣華等，2019；趙強(qiáng)，2021；章喻等，2022）。對(duì)紅牛膝中β-蛻皮甾酮進(jìn)行含量測(cè)定，可作為紅牛膝內(nèi)在質(zhì)量的控制方法。本研究采集廣西不同產(chǎn)地紅牛膝樣品，完善紅牛膝的性狀鑒別，顯微特征鑒別，TLC采用對(duì)照藥材、化學(xué)對(duì)照品定性鑒別，通過HPLC法定量分析β-蛻皮甾酮的含量，為其藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高奠定基礎(chǔ)，以便更加系統(tǒng)、科學(xué)地評(píng)價(jià)該藥材的品質(zhì)。

1" 材料與方法

1.1 儀器和試劑

儀器： LC-20AT高效液相色譜儀（島津公司），1260 高效液相色譜儀（Agilent科技公司）；KQ-300DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；XS205電子分析天平 （精度：十萬分之一）（METTLER TOLEDO）；Master-S15超純水機(jī)（上海和泰儀器有限公司）；Olympus BH-2 生物顯微鏡、Olympus DP20 照相系統(tǒng)（日本奧林巴斯株式會(huì)社）；YOKO-ZS薄層色譜成像儀（武漢藥科新技術(shù)開發(fā)有限公司）。

試劑： β-蛻皮甾酮對(duì)照品（來源于中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)為111638-201907，含量為98.3%）；人參皂苷R0對(duì)照品（來源于中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)為111638-201907，含量為98.3%）；乙腈（色譜純，德國(guó)Merck公司）；硅膠G板［默克化工技術(shù)（上海）有限公司，批號(hào)為HC39961356；青島海洋化工有限公司，批號(hào)為20150312；煙臺(tái)市化學(xué)工業(yè)研究所，批號(hào)為120829］；其余試劑為分析純。

1.2 藥材

在廣西各地共收集14批不同產(chǎn)地的紅牛膝藥材樣品（表1）。其中，8號(hào)樣品制成臘葉標(biāo)本（圖1），經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)韋松基教授、廣西中醫(yī)藥研究院黃云峰副研究員鑒定，為莧科植物柳葉牛膝（Achyranthes longifolia），取8號(hào)樣品作為本研究的對(duì)照藥材。

1.3 方法

1.3.1 紅牛膝的性狀鑒別" 對(duì)紅牛膝的根及根莖的大小、形狀、表面、質(zhì)地、斷面及氣味等特征進(jìn)行觀察與描述。

1.3.2 紅牛膝的顯微鑒別" 將紅牛膝根經(jīng)固定液固定后按石蠟切片法切片染色制片，在生物顯微鏡下觀察紅牛膝根橫切面的顯微特征；將紅牛膝根經(jīng)干燥、粉碎，過藥典四號(hào)篩，取粉末少許置載玻片上，用水合氯醛透化、裝片，觀察粉末的顯微特征。

1.3.3 紅牛膝的薄層色譜鑒別 "取紅牛膝藥材粉末4 g，加乙醇50 mL，加熱回流3 h，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)铀?5 mL，微熱使其溶解，加在D101型大孔吸附樹脂柱（內(nèi)徑1.5 cm，柱高15 cm）上，用水100 mL洗脫，棄去水液，再用20%乙醇100 mL洗脫，棄去洗脫液，繼續(xù)用80%乙醇100 mL洗脫，收集該洗脫液，蒸干，殘?jiān)?0%甲醇溶解定容至1 mL，作為供試品溶液；另取紅牛膝對(duì)照藥材4 g，同上面的方法制成對(duì)照藥材溶液；再取β-蛻皮甾酮對(duì)照品、人參皂苷RO對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL含1 mg的混合溶液，作為對(duì)照品溶液。對(duì)照薄層色譜法（《中國(guó)藥典》2015年版四部通則 0502）試驗(yàn)，吸取供試品溶液和對(duì)照藥材溶液各2 μL、對(duì)照品溶液1 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲醇-水-甲酸（8∶2∶1∶0.2）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃下加熱至斑點(diǎn)清晰，置紫外光燈（365 nm）下檢視。

1.3.4 β-蛻皮甾酮含量測(cè)定" 色譜條件如下：色譜柱為飛諾美Gemini-NX C18色譜柱；流動(dòng)相為乙腈-水溶液（15∶85）；柱溫為25 ℃；流速為1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)為243 nm；進(jìn)樣量為10 μL。理論板數(shù)按β-蛻皮甾酮計(jì)算值不低于2 000。

對(duì)照品溶液的制備： 取β-蛻皮甾酮對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含50 μg的溶液，作為對(duì)照品溶液。

供試品溶液的制備： 采用 L9（34）正交試驗(yàn)表，考察提取溶劑用量（10、20、30 mL）、加熱回流提取時(shí)間（30、60、90 min）及甲醇濃度（60%、80%、100%）對(duì)紅牛膝藥材中β-蛻皮甾酮含量提取得率的影響。取紅牛膝藥材粉末（過二號(hào)篩）1 g，精密稱定，按表2進(jìn)行供試品制備，放置室溫，稱重，用相應(yīng)濃度的甲醇補(bǔ)足減少的重量，搖勻，用微孔濾膜濾過，棄去初濾液，取續(xù)濾液，進(jìn)樣分析。根據(jù)正交結(jié)果篩選最合適的供試品溶液制備方法。

專屬性試驗(yàn)" 分別精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，待測(cè)定。同時(shí)做溶劑空白。

線性關(guān)系考察" 取β-蛻皮甾酮對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成濃度為560.6 μg·mL-1的溶液。分別精密吸取以上對(duì)照品溶液0.1、0.2、1、2、4 mL置于10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，作為標(biāo)準(zhǔn)曲線的系列溶液，按上述色譜條件進(jìn)行分析，以對(duì)照品的進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

精密度試驗(yàn)" 精密稱取紅牛膝樣品（編號(hào)：10），制成供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄β-蛻皮甾酮峰面積并計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）。

重復(fù)性試驗(yàn)" 精密稱取紅牛膝樣品（編號(hào)：10）粉末6份，制成供試品溶液，測(cè)定β-蛻皮甾酮含量。

穩(wěn)定性試驗(yàn)" 取同一份供試品溶液（編號(hào)：10），在0、1、6、12、18、24 h下進(jìn)樣測(cè)定，記錄β-蛻皮甾酮峰面積并計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。

加樣回收率試驗(yàn)" 取已知含量的紅牛膝樣品（編號(hào)：10）粉末6份，各0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，各精密加入上述β-蛻皮甾酮對(duì)照品溶液560.6 μg·mL-1 1 mL，另精密加入甲醇19 mL，制成供試品溶液，測(cè)定β-蛻皮甾酮含量，計(jì)算回收率及RSD值。

耐用性試驗(yàn)" 分別采用Gemini-NX C18、Amethyst C18-H和依利特C18 3根不同品牌的色譜柱（規(guī)格均為 5 μm，4.6 mm × 250 mm）測(cè)定樣品（編號(hào)：10）中β-蛻皮甾酮的含量，計(jì)算RSD值。采用Agilent 1260和島津LC 20AT兩個(gè)不同品牌的色譜儀，測(cè)定樣品（編號(hào)：10）中β-蛻皮甾酮的含量，計(jì)算相對(duì)平均偏差（relative average deviation，RAD）值。

14批紅牛膝藥材樣品含量測(cè)定： 根據(jù)上述供試品溶液制備條件項(xiàng)下正交試驗(yàn)結(jié)果確定的方法，制備14批紅牛膝藥材樣品的供試品溶液；根據(jù)上述色譜條件及測(cè)定方法測(cè)定14批紅牛膝藥材樣品的β-蛻皮甾酮含量（以藥材干燥品計(jì)算）。

2" 結(jié)果與分析

2.1 性狀鑒別

經(jīng)對(duì)不同產(chǎn)地紅牛膝藥材性狀進(jìn)行觀察，歸納總結(jié)出其藥材性狀如下：根莖短粗，長(zhǎng)2～6 cm，直徑1～1.5 cm，上部有數(shù)個(gè)凹窩狀莖痕或殘留莖基，下部簇生根 4～9 條或更多；根呈圓柱形，常扭曲，長(zhǎng)10～20 cm，直徑0.4～1.2 cm，向下漸細(xì)；表面灰黃褐色至棕褐色，具細(xì)密的縱皺紋及須根除去后的痕跡；質(zhì)硬而稍有彈性，易折斷，斷面皮部淡灰褐色，略光亮，可見多數(shù)點(diǎn)狀散布的維管束；氣微，味微甜、微澀（圖2）。

2.2 顯微鑒別

經(jīng)對(duì)不同產(chǎn)地紅牛膝藥材橫切面和粉末的顯微結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，歸納總結(jié)出其藥材顯微特征如下。

2.2.1 根橫切面特征" 木栓層細(xì)胞2～5列，部分已經(jīng)脫落。栓內(nèi)層細(xì)胞數(shù)列，類圓形。維管束外韌型，束間形成層不明顯；異型維管束斷續(xù)排列成3～5輪同心環(huán)，外部的維管束較小，木質(zhì)部導(dǎo)管1～5個(gè)，向內(nèi)維管束較大，導(dǎo)管較多；中央正常維管束，初生木質(zhì)部二原型，導(dǎo)管單個(gè)或幾個(gè)相連呈放射狀分布，直徑30～185 μm，射線細(xì)胞5～10列。薄壁細(xì)胞中含草酸鈣砂晶或方晶，直徑3～28 μm（圖3）。

2.2.2 根的粉末鑒別" 紅牛膝根粉末呈灰黃色。木纖維較長(zhǎng)，壁微木化，胞腔大，有的具斜形單紋孔，纖維直徑12～28 μm；導(dǎo)管為網(wǎng)紋或梯紋導(dǎo)管，直徑25～58 μm；草酸鈣砂晶或方晶多散在，直徑3～15 μm；木栓細(xì)胞多角形或類方形，灰黃色（圖4）。

2.3 薄層色譜鑒別

供試品TLC色譜中，在對(duì)照藥材色譜和對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。見圖5。

2.4 方法學(xué)考察和含量測(cè)定

2.4.1供試品溶液制備方法的確定" 試驗(yàn)結(jié)果表明，溶劑用量（A）、加熱回流提取時(shí)間（B）、甲醇濃度（C） 3個(gè)因素對(duì)β-蛻皮甾酮得率的差異均無統(tǒng)

計(jì)學(xué)意義（P均大于0.05），其中D為空白列（表3，表4）。經(jīng)高效液相色譜分析發(fā)現(xiàn)，甲醇濃度為60%和80%時(shí)，樣品檢出的色譜峰較多，容易干擾到β-蛻皮甾酮的分離測(cè)定；溶劑用量少，過濾時(shí)揮發(fā)易造成測(cè)定結(jié)果誤差變大；提取時(shí)間過短，測(cè)得結(jié)果稍低， 提取時(shí)間過長(zhǎng)，易導(dǎo)致效率低。綜合以上因素，最終選擇A2B2C3作為提取工藝，即取紅牛膝藥材粉末（過二號(hào)篩）1 g，精密稱定，精密加入甲醇20 mL，稱定重量，加熱回流60 min，放至室溫，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減少的重量，搖勻，用微孔濾膜濾過，棄去初濾液，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。結(jié)果見表3和表4。

前期預(yù)實(shí)驗(yàn)在C因素水平不變的情況下，因素A與因素B不同水平間的交互作用曲線趨于平行，沒有相交；在A因素水平不變的情況下，因素B與因素C不同水平間的交互作用曲線趨于平行，沒有相交。因此，本研究沒有考慮不同因素間的交互作用。

2.4.2專屬性試驗(yàn)" 空白溶劑、對(duì)照品溶液和供試品溶液色譜圖見圖6。供試品溶液色譜圖中欲測(cè)成分β-蛻皮甾酮色譜峰與其他雜質(zhì)峰分離較好，分離度大于1.5；二極管陣列檢測(cè)器純度分析顯示，欲測(cè)成分β-蛻皮甾酮峰的純度均大于0.999且均大于其單點(diǎn)閾值，說明該色譜峰純度較高；空白溶劑無干擾。表明專屬性良好。

2.4.3線性關(guān)系考察" β-蛻皮甾酮對(duì)照品進(jìn)樣量在5.606～224.224 μg范圍時(shí)，進(jìn)樣量與峰面積呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為y=13.462 1x+5.237 7，r=0.999 9。

2.4.4 精密度試驗(yàn)" 連續(xù)測(cè)定6次β-蛻皮甾酮峰面積平均值為747，RSD＝0.41%，表明儀器的精密度良好。

2.4.5 重復(fù)性試驗(yàn)" 6份供試品測(cè)得β-蛻皮甾酮含量的平均值為0.119%，RSD＝2.14％，表明供試品的制備方法重復(fù)性良好。

2.4.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)" 24 h內(nèi)同一供試品溶液的β-蛻皮甾酮峰面積的RSD為1.27%，表明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.7 加樣回收率試驗(yàn)" 6份樣品測(cè)得β-蛻皮甾酮平均加樣回收率為97.68%，RSD=1.37%（n=6），表明方法準(zhǔn)確度好（表5）。

2.4.8 耐用性試驗(yàn)" 3根色譜柱測(cè)得含量平均值為0.120%，RSD=1.02%（n=3）；2臺(tái)色譜儀測(cè)得含量平均值為0.121%，RAD=0.50%（n=2）。結(jié)果表明，該方法對(duì)不同品牌的色譜柱和液相色譜儀均具有良好的耐用性，說明該方法對(duì)不同色譜柱和不同儀器的適用性強(qiáng)。

2.4.9 14批樣品含量測(cè)定結(jié)果" β-蛻皮甾酮含量范圍為0.005%～0.158%，平均值為0.095%（表6）。根據(jù)測(cè)定結(jié)果，并考慮不同產(chǎn)地藥材來源差異情況，擬定紅牛膝藥材中β-蛻皮甾酮含量限度為≥0.050%。

3" 討論與結(jié)論

民族藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)是民族藥發(fā)展的重要因素，標(biāo)準(zhǔn)化是民族藥發(fā)展的趨勢(shì)。由于歷史原因，過去民族藥標(biāo)準(zhǔn)化工作雖然取得了一定的成績(jī)，但是整體水平偏低，無法滿足臨床用藥的質(zhì)量安全和民族藥產(chǎn)品的開發(fā)需求。因此，開展和提高民族藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究，對(duì)于規(guī)范民族藥資源的開發(fā)、生產(chǎn)、流通，民族藥產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定以及臨床用藥具有重要意義，也為藥材監(jiān)管提供了技術(shù)依據(jù)。

薄層色譜鑒別研究中發(fā)現(xiàn)，β-蛻皮甾酮、人參皂苷RO在樣品中含量較高、專屬性強(qiáng)，可作為特征性成分。選用不同的薄層板，即硅膠Ｈ薄層板、高效硅膠Ｈ薄層板、硅膠Ｇ薄層板、高效硅膠Ｇ薄層板，經(jīng)過比較發(fā)現(xiàn)硅膠G薄層板展開效果較好，特征成分斑點(diǎn)分離效果較好，條帶比較清晰，所以采用硅膠G薄層板；展開劑比較了乙酸乙酯-甲醇-水-甲酸（8∶2∶1∶0.2）、正丁醇-乙酸乙酯-甲酸-水（6∶4∶1∶5）的上層溶液，發(fā)現(xiàn)采用乙酸乙酯-甲醇-水-甲酸（8∶2∶1∶0.2）作為展開劑，分離效果良好，樣品在對(duì)照藥材和β-蛻皮甾酮、人參皂苷RO相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，重復(fù)性良好，專屬性強(qiáng)。同時(shí)考察了不同品牌的硅膠G薄層板，并在不同溫度（4 ℃和30 ℃）和不同濕度（相對(duì)濕度55%和88%）下試驗(yàn)，特征成分斑點(diǎn)分離效果均較好，方法耐用性好。上述方法可作為紅牛膝鑒別的主要依據(jù)。

β-蛻皮甾酮為紅牛膝主要有效成分之一，為更全面地反映飲片質(zhì)量，本研究測(cè)定了β-蛻皮甾酮含量。在用HPLC進(jìn)行含量測(cè)定方法的研究中，筆者曾對(duì)加熱回流提取和超聲提取制備供試液β-蛻皮甾酮含量進(jìn)行比較，結(jié)果表明加熱回流提取液測(cè)得的β-蛻皮甾酮含量高于超聲提?。贿€分別對(duì)甲醇和乙醇作為提取溶劑加熱回流提取制備供試液β-蛻皮甾酮含量進(jìn)行比較，結(jié)果表明甲醇提取液β-蛻皮甾酮含量較乙醇提取液高。故本方法采用甲醇加熱回流的方法制備供試品溶液。方法學(xué)研究表明，本文建立的紅牛膝中β-蛻皮甾酮測(cè)定方法專屬性強(qiáng)，無溶劑干擾，精密度和準(zhǔn)確度高，具有良好的重復(fù)性和重現(xiàn)性，可用于評(píng)價(jià)瑤藥紅牛膝質(zhì)量的優(yōu)劣。

本研究考察了紅牛膝的性狀鑒別、顯微鑒別、薄層鑒別、含量等檢查項(xiàng)目，并建立了紅牛膝中β-蛻皮甾酮HPLC含量測(cè)定方法，可為紅牛膝質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的完善與提高提供依據(jù)，為紅牛膝的質(zhì)量控制和開發(fā)應(yīng)用提供參考。

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