廣熱帶睡蓮的揮發(fā)態(tài)氣味物質(zhì)檢測及優(yōu)良芳香品種篩選

關(guān)鍵詞 睡蓮； 揮發(fā)物； 氣味活性成分； HS-SPME-GC-MS； 品種篩選

中圖分類號 S682.32 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 1000-2421（2024）03-0230-10

中國芳香植物種質(zhì)資源豐富，應(yīng)用歷史悠久［1］。近年來，芳香植物的產(chǎn)業(yè)價值凸顯［2］，中國芳香保健產(chǎn)業(yè)僅精油市場份額就達(dá)57.11 億元，可供挖掘的市場空間達(dá)500 億元［3］。各類芳香物質(zhì)如紫羅蘭酮［4］、芳樟醇及其氧化物［5］、金合歡烯［6-7］等對人體生理和心理健康效用已被逐步驗證，并在康養(yǎng)產(chǎn)業(yè)中推廣應(yīng)用。值得一提的是，梅花［8］、桂花［9］、菊花［10-11］等中國傳統(tǒng)芳香植物的研究不斷深化，為其康養(yǎng)功效發(fā)掘和應(yīng)用形式創(chuàng)新奠定了理論基礎(chǔ)。

芳香植物品種間的香氣物質(zhì)差異顯著，優(yōu)良品種篩選是開展芳香產(chǎn)品研發(fā)的前提。如在梅花（Prunus mume）的研究中發(fā)現(xiàn)肉桂醇是其重要香氣成分之一，不同品種肉桂醇脫氫酶活性差異導(dǎo)致其合成量差異，進而導(dǎo)致梅花品種間的香氣差異［8］。朱琳琳等［9］研究表明，丹桂品種群富含芳樟醇及其氧化物，呈現(xiàn)花香、木香，而金桂、銀桂品種群富含β-紫羅蘭酮、α-紫羅蘭酮，呈現(xiàn)甜香；特色品種‘日香桂’不僅富含β-紫羅蘭酮、γ-癸內(nèi)酯和芳樟醇等香氣成分，且花期長、花量大，是優(yōu)良的加工品種。依蘭（Cananga odorata）是重要的熱帶香料作物，科摩羅依蘭香氣成分以酯類為主，而斯里蘭卡依蘭以烯烴類物質(zhì)為主，適合不同類型依蘭精油產(chǎn)品的開發(fā)［12］。

植物合成的芳香物質(zhì)主要以揮發(fā)態(tài)、游離態(tài)和糖苷態(tài)3 種形式存在，其中揮發(fā)態(tài)香氣物質(zhì)分子質(zhì)量小、揮發(fā)性強，可以為人的嗅覺直接感知，是決定香味品質(zhì)的關(guān)鍵因素［13］；游離態(tài)與糖苷態(tài)香氣物質(zhì)則儲存在植物組織內(nèi)，部分香氣物質(zhì)可與揮發(fā)態(tài)香氣物質(zhì)相互轉(zhuǎn)化，是加工產(chǎn)品的重要組分［14-15］。在揮發(fā)態(tài)香氣物質(zhì)中，僅有部分香氣活性物質(zhì)可被人嗅聞感知，他們在決定芳香植物的香型和香味濃郁度方面發(fā)揮重要作用［16］。氣味活性值（odor activityvalue， OAV）是氣味物質(zhì)含量與氣味感知閾值的比值，是衡量氣味活性物質(zhì)感知度的關(guān)鍵指標(biāo)。通常收稿認(rèn)為OAV 值大于1 的香氣物質(zhì)對嗅覺感官有貢獻(xiàn)，屬于特征香氣物質(zhì)［17］。

睡蓮為睡蓮科（Nymphaeaceae）睡蓮屬（Nym?phaea）植物，花色豐富，花香宜人，是少有的芳香水生植物［18］。睡蓮早在3 000 多年前就被作為芳香圣品應(yīng)用于古埃及的皇家園林和宗教活動［19］，我國新疆有將雪白睡蓮入藥的傳統(tǒng)，是一味重要的維吾爾族藥材［20］。根據(jù)產(chǎn)地和生物學(xué)特性差異分類，睡蓮屬包括新熱帶睡蓮（Hydrocallis）、古熱帶睡蓮（Lotos）、廣熱帶睡蓮（Brachyceras）、澳大利亞睡蓮（Anec?phya）、廣溫帶睡蓮（Nymphaea）5 個亞屬［20］。其中新熱帶亞屬和古熱帶亞屬為夜開型，園林應(yīng)用受到制約；澳洲睡蓮品種較少且養(yǎng)護難度較高，推廣程度低；廣溫帶亞屬和廣熱帶亞屬品種具有易繁殖、花量大、花色豐富、養(yǎng)護簡易等優(yōu)點，是目前市場主推品種。前人研究表明，睡蓮品種間氣味物質(zhì)差異較大，熱帶睡蓮揮發(fā)物種類與含量均顯著多于耐寒睡蓮［21-22］，在睡蓮花茶中也呈現(xiàn)相似的規(guī)律［23］。睡蓮揮發(fā)態(tài)成分中烯烴、烷烴種類較多，占比分別達(dá)到30.36%、17.86%。乙酸芐酯、順式-羅勒烯、苯甲醇、金合歡烯等萜類、脂肪酸衍生物、苯環(huán)類化合物是睡蓮中的主要香氣成分［24］。前期研究主要集中在睡蓮揮發(fā)物的種類鑒定和含量檢測，基于揮發(fā)物檢測進行優(yōu)良品種篩選的工作尚未開展。同時，睡蓮揮發(fā)物中含有大量不具備氣味特征的烷烴類物質(zhì)，這類非氣味活性物質(zhì)對睡蓮香氣構(gòu)成相關(guān)研究存在一定干擾。通過OAV 值計算進行氣味活性物質(zhì)篩選是植物香氣、食品風(fēng)味研究的有效手段。本研究通過頂空固相微萃取結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（headspacesolid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPEM-GC-MS）［25］對30個廣熱帶睡蓮主栽品種的揮發(fā)態(tài)成分進行檢測，采用內(nèi)標(biāo)法進行準(zhǔn)確定量，并根據(jù)OAV 值解析睡蓮特征氣味成分，篩選優(yōu)良芳香品種，以期為睡蓮的芳香產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為睡蓮香氛產(chǎn)品的研發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試材及取樣

30 個品種睡蓮花試驗材料（圖1）定植于浙江人文園林股份有限公司杭州睡蓮基地，采用盆栽沉水法種植，株行距3 m，水深70 cm。2022 年10 月10 日至17 日11：00 至13：00 采集首日開放、柱頭液尚未干涸的整花，每個品種取5 朵，液氮速凍后置于―80 ℃超低溫冰箱保存。取花朵質(zhì)量、花徑一致的3 朵凍存樣品在液氮冷凍下混合研磨成粉末，取0.5 g 混合均勻的粉末加入到20 mL 頂空瓶中，采用甲基叔丁基醚（MTBE，Mreda，USA）稀釋100 倍的壬酸甲酯（Sigma，USA）作為內(nèi)標(biāo)，終質(zhì)量濃度為8.75 μg/mL。取2 μL 加入到頂空瓶壁，密封平衡10 min，55 ℃水浴萃取30 min 上樣，3 次生物學(xué)重復(fù)。進樣口溫度為230 ℃，解吸附時間為5 min。

1.2 檢測條件

采用DB-5MS 色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25μm，Themo Scientific，Bellefonte，PA，USA），載氣為高純氦氣（99.999%），分流比50∶1，流速為1 mL/min。離子源和進樣口的溫度分別為280 ℃和230 ℃，傳輸線的溫度為250 ℃。色譜條件：40 ℃保持5 min，以5 ℃/min 速率升溫至120 ℃并保留2 min，以3 ℃/min速率升溫至160 ℃并保留2 min，以5 ℃/min 速率升溫至200 ℃并保留4 min。質(zhì)譜條件：EI（電子轟擊）離子源，電子轟擊能量70 eV，正離子掃描模式，質(zhì)量掃描范圍 m/z 40～450 amu。

1.3 物質(zhì)含量測定指標(biāo)

GC-MS 原始數(shù)據(jù)用Xcalibur 軟件處理并導(dǎo)出。在相同升溫程序下用正構(gòu)烷烴標(biāo)準(zhǔn)樣品（C8～C30）計算得到的科瓦茨保留指數(shù)（‘Kovats’ retention index，RI）。揮發(fā)物鑒定基于NIST 質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫（NIST 2017）結(jié)合RI 進行定性。采用內(nèi)標(biāo)定量法，計算公式如下：

各組分含量=各組分峰面積／內(nèi)標(biāo)物峰面積×內(nèi)標(biāo)物含量／樣品量

1.4 香氣活性成分分析

OAV 是客觀估計氣味物質(zhì)對樣品整體氣味貢獻(xiàn)程度的方法，OAV 值是氣味物質(zhì)在樣品氣味中的濃度（concentration，C）與其閾值（odor threshold，OT）的比值。當(dāng)OAVgt;1 時，該氣味物質(zhì)對整體氣味具有貢獻(xiàn)作用，OAV 值越大，對樣品整體氣味的貢獻(xiàn)度越高。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用 SPSS 軟件的單因素方差分析（one-wayANOVA）統(tǒng)計品種間的數(shù)據(jù)差異，熱圖和柱狀圖分別由TBtools 和Origin2021 繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同廣熱帶睡蓮品種的揮發(fā)態(tài)物質(zhì)的定性和定量分析

通過HS-SPME-GC-MS 技術(shù)進行揮發(fā)物檢測，根據(jù)保留時間和保留指數(shù)進行物質(zhì)鑒定。在30 個廣熱帶睡蓮品種中共檢測出7 類60 種揮發(fā)態(tài)成分（表1），包括萜類22 種、烷烴10 種、醛類8 種、酯類6 種、烯烴類5 種、芳香族5 種、醇類4 種。所有品種共有的揮發(fā)物為十四烷、十五烷、十六烷、十七烷、十九烷、6，9-十七碳二烯。此外，2-己烯醛、苯甲醇、反式-α-香檸檬烯、金合歡烯、β-倍半水芹烯也在多數(shù)品種中檢出（27 個及以上品種）。部分品種含有特殊物質(zhì)，如十一烷、γ-木犀烯僅在‘粉藍(lán)星’中檢出，十五烯僅在‘藍(lán)星’中檢出。

由圖2A 可知，30 個廣熱帶睡蓮品種的揮發(fā)物含量存在明顯差異，其中‘粉鉆’揮發(fā)物總含量最高（2 308.63 ng/g），是含量最低的‘紫外線’品種（23.80ng/g）的49.12 倍。揮發(fā)物含量較高的品種（gt;1 000ng/g）有‘粉鉆’‘魯比’‘藍(lán)鳥’等9 個品種；‘紫喬伊’‘紫外線’‘狐火’‘銀河系’4 個大型藍(lán)紫色重瓣品種揮發(fā)物含量最低。由圖2B 可知，30 個廣熱帶睡蓮品種平均檢出28 種揮發(fā)物，‘魯比’揮發(fā)物種類豐富度最高，達(dá)到35 種，‘狐火’揮發(fā)物種類較少，僅15 種。

由圖3 可知，烷烴、烯烴、萜類化合物是所有品種中含量相對豐富的種類，其中烷烴占比最高，平均可達(dá)38.69%，但烷烴、烯烴類物質(zhì)不具有氣味特征或微具氣味的部分物質(zhì)香味閾值極高，因此這2 類物質(zhì)并不是睡蓮的特征氣味物質(zhì)。萜類化合物雖然相對含量偏低，但多數(shù)物質(zhì)氣味閾值低，且具有濃郁而獨特的芳香［26］，是廣熱帶睡蓮品種主要貢獻(xiàn)成分。由表1可知，本研究在睡蓮不同品種中共檢測出萜類化合物22 種（表1），占全部物質(zhì)種類的1/3 以上。其中，金合歡烯（平均含量111.00 ng/g）、順式-β-金合歡烯（平均含量18.98 ng/g）、β-倍半水芹烯（平均含量35.54 ng/g）、反式-α-香檸檬烯（平均含量19.60 ng/g）、姜烯（平均含量10.9 ng/g）等含量較高，且在大多數(shù)品種中廣泛存在。α-蒎烯、胡蘿卜烯、γ-木犀烯僅在少數(shù)品種中檢測到。由圖3 可知，‘粉鉆’較其他品種含有更為豐富的萜類化合物，約含有760.23 ng/g，占其揮發(fā)物總含量1/3 以上。

2.2 不同廣熱帶睡蓮品種香氣活性成分分析及優(yōu)良芳香品種篩選

為明確廣熱帶睡蓮的特征氣味物質(zhì)，進一步計算氣味活性值，共篩選獲得19 個氣味活性物質(zhì)（表2），包括8 種萜類、6 種醛類、3 種醇類和2 種酯類化合物。其中OAV 值大于1 的特征氣味物質(zhì)有4 種，從高到低依次為β-紫羅蘭酮、反式-β-紫羅蘭酮、α-紫羅蘭酮和金合歡烯。其中，α-紫羅蘭酮在25 個品種中均有檢測到，金合歡烯在28 個品種中檢測到，是多數(shù)睡蓮品種的主要氣味貢獻(xiàn)物質(zhì)。紫羅蘭酮類物質(zhì)呈現(xiàn)甜香、木香，而金合歡烯呈現(xiàn)蘋果香及典型的花香，因此睡蓮總體呈現(xiàn)淡雅的甜香特征。此外，反式-2-癸烯醛（柑橘香）、苯乙醛（果香）、二氫-β-紫羅蘭酮（甜香、木香）、辛醛（柑橘香）、α-蒎烯（草香）的平均OAV 值小于1，但在部分品種中有氣味貢獻(xiàn)。揮發(fā)物中含量較高的烷烴、烯烴類化合物由于缺乏氣味特征或氣味閾值較高，對睡蓮香氣的貢獻(xiàn)度極低。

氣味物質(zhì)的種類和含量決定了睡蓮的香氣類型和香氣濃郁程度。通過OAV 值計算，α-紫羅蘭酮、β-紫羅蘭酮、反式-β-紫羅蘭酮和金合歡烯被篩選為主要的氣味貢獻(xiàn)成分。通過比較，篩選以上4 種物質(zhì)OAV 值相對較高的品種，定義為優(yōu)良的芳香睡蓮品種。選取每種物質(zhì)含量前3 名的品種進行比較分析，結(jié)果如圖4 所示，‘卡拉陽光’有3 種物質(zhì)的OAV 值較高，總體香氣濃郁程度相比其他品種更為突出。‘黃金國’‘林賽伍德’‘巴拿馬太平洋’β-紫羅蘭酮或反式-β-紫羅蘭酮OAV 值高，具有較為明顯的甜香特征?！坫@’所含金合歡烯OAV 值在所有品種中最大，相對其他品種具有更加明顯的蘋果和花瓣的香氣。金合歡烯是睡蓮精油中含量較高的主要成分之一。‘粉鉆’‘卡拉陽光’‘藍(lán)鳥’3 個品種的金合歡烯含量均大于200 ng/g，相對其他品種較為突出，是用于精油提取的潛在優(yōu)良品種。

3 討論

睡蓮是優(yōu)良的水生芳香植物，既可用于芳香水景營建，也是花茶、精油、純露等新興產(chǎn)品的主要原料。睡蓮精油具有抗菌、抗氧化的功效，在芳香療法中極具應(yīng)用潛力［27-28］。與玫瑰、薰衣草、薄荷等常見的芳香植物相比，睡蓮的芳香研究基礎(chǔ)薄弱，優(yōu)良品種的培育和篩選剛剛起步，極大制約了睡蓮香氛產(chǎn)品的開發(fā)。

本研究以香味濃郁、栽培廣泛的廣熱帶睡蓮亞屬不同品種為材料，采用HS-SPME-GC-MS 技術(shù)檢測鑒定出60 種揮發(fā)物，其中十五烷、6，9-十七碳二烯、金合歡烯等含量較高，是睡蓮的主要揮發(fā)物成分，與袁茹玉［21］、蘇群等［22］采用頂空固相微萃取實驗結(jié)果一致性較高。黃秋偉等［29］對二氧化碳超臨界萃取的睡蓮精油進行檢測，結(jié)果也顯示十五烷、6，9-十七碳二烯、金合歡烯是睡蓮精油的主要成分。

通過計算OAV 值，本研究明確了睡蓮的特征氣味物質(zhì)包括α-紫羅蘭酮、β-紫羅蘭酮、反式-β-紫羅蘭酮和金合歡烯。紫羅蘭酮類物質(zhì)OAV 值在桂花［9］、玫瑰［30］中分別高達(dá)2 222 857、4 942，是這類濃香型花卉的主要香氣活性物質(zhì)之一。與濃香型花卉相比，睡蓮中的氣味活性成分種類、含量均相對較少，OAV 值更低，因此睡蓮的總體香氣特征偏于溫和。同時，OAV 值顯示，乙酸芐酯（茉莉香味）、苯甲醇（清香）、苯甲醛（苦杏仁、堅果、櫻桃的香味）等前人研究鑒定的睡蓮香氣物質(zhì)［21-22］在本試驗中香氣活性值過低，可能對睡蓮香氣產(chǎn)生貢獻(xiàn)較小。

本研究通過OAV 值比較品種間差異，篩選出‘卡拉陽光’‘粉鉆’‘魯比’‘藍(lán)鳥’‘黃金國’5 個優(yōu)良芳香品種。其中‘卡拉陽光’氣味活性成分含量高，香氣濃郁；‘魯比’‘藍(lán)鳥’‘黃金國’3 個品種紫羅蘭酮類物質(zhì)豐富，甜香特征明顯；‘粉鉆’‘卡拉陽光’‘藍(lán)鳥’3 個品種金合歡烯含量相對較高，為精油提取的優(yōu)良品種。由于本研究采樣量較大，采用了低溫冷凍法保存樣品，樣品香氣物質(zhì)可能存在損失，導(dǎo)致部分香氣活性物質(zhì)OAV 值偏低，影響睡蓮香氣活性物質(zhì)的鑒別，后續(xù)在條件許可的情況下可采用鮮樣和精油進一步檢測鑒定。此外，采用頂空固相微萃取技術(shù)對睡蓮的主要特征香氣物質(zhì)進行鑒定存在一定的局限性，后續(xù)可以通過GC-O 嗅辨、香氣重構(gòu)與缺失等方法進行驗證，獲取更精確的睡蓮香氣構(gòu)成數(shù)據(jù)。

（責(zé)任編輯：葛曉霞）