貴州蕎麥重要種質(zhì)的遺傳多樣性分析及分子身份證構(gòu)建

關(guān)鍵詞 蕎麥； SSR 標(biāo)記； 毛細(xì)管電泳； 遺傳多樣性； DNA 分子身份證

中圖分類號(hào) S517.102.4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1000-2421（2024）03-0148-10

蕎麥屬于蓼科（Polygonaceae）蕎麥屬（Fagopy?rum Mill）雙子葉植物，營(yíng)養(yǎng)豐富，有“百谷之王”之稱［1］。貴州是中國(guó)蕎麥的起源地和主產(chǎn)區(qū)之一，有苦蕎（Fagopyrum tataricum （L）. Gaertn.）、甜蕎（F. es?culentum Moench）和金蕎麥（F. cymosum）3 個(gè)種，主要以苦蕎種植為主［2-3］。蕎麥為貴州省優(yōu)勢(shì)特色作物品種，是貴州發(fā)展山地特色高效農(nóng)業(yè)的支柱產(chǎn)業(yè)之一［4］。長(zhǎng)期以來(lái)，貴州畢節(jié)市、六盤(pán)水市等蕎麥主產(chǎn)區(qū)存在自繁留種、品種混雜和栽培管理粗放等問(wèn)題，嚴(yán)重影響了蕎麥產(chǎn)量和品質(zhì)［5］。因此，基于分子標(biāo)記技術(shù)開(kāi)展蕎麥種質(zhì)資源遺傳多樣性分析和DNA指紋鑒定，對(duì)加快蕎麥遺傳育種和新種質(zhì)知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)進(jìn)程，進(jìn)而促進(jìn)蕎麥產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要意義。

SSR（simple sequence repeat，簡(jiǎn)單重復(fù)序列）分子標(biāo)記操作簡(jiǎn)單、多態(tài)性豐富、重復(fù)性好，在近似品種的鑒別方面優(yōu)勢(shì)顯著，是構(gòu)建指紋圖譜的重要標(biāo)記［6-7］?，F(xiàn)有的使用SSR 分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)蕎麥種質(zhì)資源遺傳多樣性分析和指紋圖譜構(gòu)建的研究大多集中在苦蕎，并且沒(méi)有對(duì)貴州省蕎麥資源親緣關(guān)系及DNA 分子身份證構(gòu)建等的系統(tǒng)研究［8-9］。DNA 分子身份證是在指紋圖譜基礎(chǔ)上，將種質(zhì)特征數(shù)字化，使每個(gè)種質(zhì)都擁有自己的獨(dú)特代碼，檢索品種時(shí)更加方便和直觀［10-11］。近年來(lái)，使用SSR 標(biāo)記方法開(kāi)展種質(zhì)親緣關(guān)系分析和DNA 分子身份證構(gòu)建已非常普遍［12-13］。

目前，國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)利用SSR 分子標(biāo)記結(jié)合毛細(xì)管電泳技術(shù)用于蕎麥的研究報(bào)道，本研究擬采用SSR 標(biāo)記對(duì)貴州省60 份蕎麥種質(zhì)開(kāi)展遺傳多樣性分析，并構(gòu)建其DNA 分子身份證，旨在揭示貴州省蕎麥種質(zhì)資源間的親緣關(guān)系，為貴州省蕎麥種質(zhì)的遺傳育種、種質(zhì)保護(hù)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

苦蕎、甜蕎和金蕎3 個(gè)種共60 份試驗(yàn)材料，保存單位為貴州師范大學(xué)（54 份）和六盤(pán)水職業(yè)技術(shù)學(xué)院（6 份）（表1）。51 份種質(zhì)由貴州師范大學(xué)蕎麥產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究中心提供種子，在營(yíng)養(yǎng)盤(pán)播種20 d 后進(jìn)行采樣，其余9 份分別取自貴州省六盤(pán)水市水城區(qū)玉舍鎮(zhèn)和貴州師范大學(xué)安順市西秀區(qū)雙堡鎮(zhèn)蕎麥種植基地。采樣時(shí)隨機(jī)選取10 株，采集新鮮幼嫩葉片，混合后包入錫箔紙，迅速放入液氮，帶回實(shí)驗(yàn)室保存于-80 ℃冰箱備用。

1.2 植物DNA的提取

采用DNA 提取試劑盒DP320（天根，北京）提取所有供試樣品DNA，提取完成后采用1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA 完整性，采用全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（ThermoFisher Scientific， MA， USA）檢測(cè)其濃度與純度，質(zhì)量合格后將其稀釋至約35 ng/μL，置于-20 ℃保存。

1.3 SSR引物對(duì)來(lái)源

根據(jù)SSR 引物具有通用性強(qiáng)的特點(diǎn)，查閱普通蕎麥、苦蕎SSR 標(biāo)記研究的相關(guān)文獻(xiàn)［14-17］，共搜集挑選出100 對(duì)引物，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.4 SSR-PCR

隨機(jī)挑選5 個(gè)DNA 模板對(duì)100 對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過(guò)2% 瓊脂糖凝膠電泳初步篩選出多態(tài)性引物，再采用Qsep 100TM全自動(dòng)核酸蛋白分析儀（杭州厚澤生物科技有限公司）進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測(cè)。用于引物篩選的DNA 材料包括采用黔黑蕎（QM01）、貴米苦蕎55 號(hào)（QM14）、涼K19-10（QM28）、貴紅花甜蕎2 號(hào)（QM42）和九江苦蕎（QM55）。

PCR 擴(kuò)增反應(yīng)采用10 μL 體系：模板基因組DNA 1 μL，正、反向引物各1 μL，2×Taq PCR MasterMix 5 μL，ddH2O 補(bǔ)充至10 μL。2×Taq PCRMaster Mix 來(lái)源于北京天根生物科技有限公司（TIANGEN）。SSR-PCR 擴(kuò)增反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，最適退火溫度60 ℃反應(yīng)30 s，72 ℃反應(yīng)30 s，共35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min；4 ℃保存。

將篩選出的16 對(duì)多態(tài)性豐富的SSR 引物（表2）進(jìn)行毛細(xì)管電泳，毛細(xì)管電泳所使用的卡匣為S1 高分辨率卡匣，分子大小標(biāo)準(zhǔn)參照物為1K Size marker（深圳鼎澤揚(yáng)生物科技有限公司生產(chǎn)）。使用8% 變性聚丙烯酰胺凝膠分離PCR 產(chǎn)物，電壓為170 V，120 min 后開(kāi)始銀染，隨后拍照留存。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

毛細(xì)管電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳的結(jié)果均按獲得的DNA 分子質(zhì)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，根據(jù)片段位置區(qū)分，同一位置有條帶記為1，無(wú)條帶記為0。將統(tǒng)計(jì)結(jié)果構(gòu)建成數(shù)據(jù)矩陣，用Popgen32 軟件計(jì)算等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、觀察雜合度和Shannon’s 指數(shù)；用Power Marker v3.25 軟件計(jì)算多態(tài)信息含量（PIC）；NTSYS pc 2.10e 分析軟件計(jì)算相似系數(shù)，并按UPMGA 方法構(gòu)建親緣關(guān)系樹(shù)狀圖；通過(guò)條形碼和二維碼生成器（http：//qr-batch.com/）構(gòu)建供試種質(zhì)分子身份證。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR引物對(duì)篩選

提取的60 份蕎麥種質(zhì)的基因組DNA 質(zhì)量濃度為38～122 ng/μL，OD₂₆₀/OD₂₈₀ 在1.7～2.0，均滿足后續(xù)PCR 試驗(yàn)的要求。利用100 對(duì)引物對(duì)隨機(jī)選取的5 個(gè)蕎麥品種進(jìn)行擴(kuò)增，篩選出擴(kuò)增產(chǎn)物條帶清晰穩(wěn)定的40 對(duì)引物（圖1），對(duì)這40 對(duì)引物進(jìn)行多態(tài)性檢測(cè)，共篩選出多態(tài)性較高的16 對(duì)（表2）。以引物SSR98 為例，它在5 個(gè)品種中擴(kuò)增產(chǎn)物毛細(xì)管電泳圖見(jiàn)圖2，可見(jiàn)該引物具有較高的擴(kuò)增多態(tài)性。

2.2 蕎麥的遺傳多樣性分析

通過(guò)Popgene32 對(duì)毛細(xì)管電泳結(jié)果統(tǒng)計(jì)的0、1數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果（表3）顯示，16 對(duì)SSR 引物在60 份蕎麥種質(zhì)中共檢測(cè)出174 個(gè)多態(tài)性片段，最少的3 個(gè)（SSR72、SSR98），最多的24 個(gè)（SSR29），平均為10.875 個(gè)，基因片段大小集中在102～508 bp。單個(gè)引物的等位基因數(shù)為1.944～2.000，均值1.993；有效等位基因數(shù)為1.162（SSR82）～1.647（SSR13），均值1.317；Nei’s基因多樣性指數(shù)變幅為0.126（SSR36）～0.361（SSR13），平均值0.206；Shannon信息指數(shù)變幅為0.231（SSR36）～0.532（SSR13），平均值0.337；多態(tài)信息含量在0.309～0.925，均值為0.693。以上結(jié)果表明，篩選出的引物多態(tài)性高，貴州省蕎麥資源遺傳多樣性豐富。

2.3 蕎麥種質(zhì)的聚類分析

根據(jù)UPGMA 法對(duì)60 份蕎麥種質(zhì)進(jìn)行聚類分析，進(jìn)而獲得不同蕎麥品種間的遺傳關(guān)系樹(shù)狀圖（圖3）。在Dice 系數(shù)0.374 處蕎麥種質(zhì)可分為3 組：其中A 組包含47 份苦蕎品種；B 組包含4 份金蕎麥的品種；C 組包含9 份甜蕎品種。Dice 相似系數(shù)0.484 將苦蕎組更細(xì)分為A1、A2 2 個(gè)小組，A1 組主要包括：貴州省威寧縣農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所毛春等選育的黔苦蕎系列、貴州師范大學(xué)陳慶富等通過(guò)小米蕎（屬薄殼苦蕎）與晉蕎2 號(hào)等有性雜交產(chǎn)生的新品系（含貴米苦蕎和黑米苦蕎系列）；A2 組包括：六盤(pán)水職業(yè)技術(shù)學(xué)院張清明等選育的六苦蕎系列，通過(guò)苦蕎和金蕎麥雜交育成的貴金苦蕎系列。這表明貴州地區(qū)的不同苦蕎種質(zhì)具有遺傳近緣性和差異性。

2.4 毛細(xì)管電泳鑒定蕎麥種質(zhì)可靠性

本研究分別采用毛細(xì)管和聚丙烯銀染顯影技術(shù)，基于相同的材料和引物對(duì)2 種方法的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較，以SSR-13 為例展示2 種檢測(cè)方法的結(jié)果（圖4 和圖5）。毛細(xì)管電泳由于較高的靈敏度，共擴(kuò)增出174 條多態(tài)性條帶，而聚丙烯酰胺凝膠電泳僅擴(kuò)增出72 條多態(tài)性條帶，60 份蕎麥種質(zhì)的Dice 系數(shù)變幅為0.333～0.974，平均0.699。在Dice 系數(shù)約為0.654處，苦蕎、金蕎麥和甜蕎分別聚為A、B 和C 3 組（圖6）；在Dice 系數(shù)約為0.702 處分為A1 和A2 2 個(gè)小組，43 個(gè)苦蕎種質(zhì)聚在A1 組，A2 組僅包含大苦1 號(hào)和3 個(gè)貴金苦蕎品種。

2.5 種質(zhì)DNA分子身份證構(gòu)建

在16 對(duì)多態(tài)性引物中，SSR29、SSR36、SSR77、SSR82、SSR55、SSR13 和SSR38 的多態(tài)性指數(shù)較高，鑒別能力較強(qiáng)，其中SSR29 引物鑒別能力最強(qiáng)（表4），可單獨(dú)鑒別39 個(gè)種質(zhì)，鑒別率為65%。經(jīng)過(guò)篩選，所有供試種質(zhì)通過(guò)SSR29、SSR36、SSR773 對(duì)SSR 引物組合即可被完全區(qū)分開(kāi)，可以用來(lái)構(gòu)建蕎麥種質(zhì)的DNA 分子身份證。將選用的3 對(duì)SSR 引物按照SSR29、SSR36、SSR77 固定順序，以每個(gè)種質(zhì)在對(duì)應(yīng)的引物擴(kuò)增的“0”和“1”矩陣進(jìn)行串聯(lián)排列，用以表示DNA 分子身份證字符串，最后將種質(zhì)的編號(hào)、保存單位及身份證號(hào)等信息導(dǎo)入二維碼生成器中以得到二維碼DNA 分子身份證，圖7為貴米苦蕎55 號(hào)和九江苦蕎的分子身份證。

3討論

SSR 分子標(biāo)記是國(guó)際植物新品種保護(hù)聯(lián)盟（UPOV）認(rèn)可的DNA 指紋數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建的首選標(biāo)記，其擴(kuò)增產(chǎn)物主要通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）和毛細(xì)管電泳（CE） 2 種方法進(jìn)行檢測(cè)［18-19］。前期利用SSR 分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)蕎麥種質(zhì)資源的研究主要集中在苦蕎，擴(kuò)增產(chǎn)物均由聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)［20］。本研究采用SSR 分子標(biāo)記結(jié)合毛細(xì)管電泳技術(shù)進(jìn)行蕎麥種質(zhì)資源鑒定。

3.1 蕎麥種質(zhì)DNA分子身份證的構(gòu)建

種質(zhì)資源DNA 分子身份證與DNA 指紋圖譜能夠區(qū)分不同的品種，但二者又有所不同。分子身份證是指紋圖譜數(shù)字化后的結(jié)果，分子身份證利用特定的數(shù)字編碼成數(shù)字串，輔以條形碼或者二維碼可以實(shí)現(xiàn)種質(zhì)資源快速識(shí)別，現(xiàn)已作為一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用于品種的快速識(shí)別和鑒定［21-22］。

以往對(duì)于貴州省蕎麥種質(zhì)資源的研究均為利用SSR 分子標(biāo)記技術(shù)構(gòu)建指紋圖譜對(duì)蕎麥種質(zhì)資源進(jìn)行鑒定［23］，沒(méi)有關(guān)于DNA 分子身份證構(gòu)建的研究。本研究以SSR 分子標(biāo)記技術(shù)為核心，采用毛細(xì)管電泳技術(shù)作為分析手段，實(shí)現(xiàn)蕎麥DNA 分子身份證制作的高精度及高通量；結(jié)合供試蕎麥的保存單位等基礎(chǔ)信息，利用3對(duì)SSR引物組合構(gòu)建了60 份蕎麥種質(zhì)資源的條形碼和二維碼共2 種DNA 分子身份證，克服了指紋圖譜人工對(duì)比繁瑣、低效等問(wèn)題，不僅可以達(dá)到快速鑒定的目的，而且有助于知識(shí)產(chǎn)權(quán)的保護(hù)，這對(duì)蕎麥種質(zhì)的識(shí)別和鑒定具有十分重要的意義。

3.2 貴州蕎麥的遺傳多樣性和聚類分析

本研究利用16 對(duì)SSR 引物分析蕎麥60 份種質(zhì)，使用毛細(xì)管電泳法檢測(cè)出174 個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，每對(duì)引物平均10.875 個(gè)，多態(tài)信息含量變幅為0.309～0.925，平均為0.693，表明貴州省蕎麥種質(zhì)資源具有豐富的遺傳多樣性，這對(duì)于今后蕎麥品種改良以及挖掘更多的優(yōu)良基因有重要意義。王晉雄［24］利用47對(duì)SSR 引物對(duì)甘肅省96 份蕎麥種質(zhì)資源進(jìn)行了遺傳多樣性分析，PIC 平均值為0.590；馬名川等［25］使用13 對(duì)SSR 引物對(duì)山西省49 份苦蕎資源進(jìn)行了遺傳多樣性分析，PIC 平均值為0.390，均比本研究低，這可能與材料和SSR 引物的選擇不同以及檢測(cè)方法有關(guān)。

聚類分析中苦蕎、甜蕎和金蕎麥各聚為一類，在相似系數(shù)約為0.484 處苦蕎進(jìn)一步聚為A1 和A2 兩個(gè)小組。所有種質(zhì)遺傳相似系數(shù)變幅在0.032～0.918，貴甜4 號(hào)和黑米2 號(hào)的遺傳相似系數(shù)最小，黑米41-2 和黑米202203 遺傳相似性系數(shù)最大。根據(jù)王貴等［26］對(duì)沙子空心李的研究，遺傳相似系數(shù)能夠反映群體間的親緣關(guān)系，貴甜4 號(hào)和黑米2 號(hào)的遺傳相似系數(shù)最小，二者之間親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，可以為蕎麥育種時(shí)親本材料的選擇提供參考。此外，本研究發(fā)現(xiàn)來(lái)自不同地區(qū)同名的品種并沒(méi)有聚在同一類，如分別來(lái)自貴州師范大學(xué)蕎麥產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究中心保存和貴州省六盤(pán)水市水城區(qū)玉舍鎮(zhèn)種植的六農(nóng)1 號(hào)、六苦蕎3 號(hào)，這表明蕎麥品種可能存在換種現(xiàn)象，其原因有待進(jìn)一步研究。金蕎麥作為重要的藥飼兼用植物資源，越來(lái)越受到人們的關(guān)注，但目前未有針對(duì)金蕎麥基因組開(kāi)發(fā)的SSR 引物。在本研究共收集了4份金蕎麥種質(zhì)，數(shù)量較少，在引物篩選時(shí)并未將其選入，但篩選出的16 對(duì)SSR 引物同樣適用于金蕎麥種質(zhì)的分析鑒定。從聚類圖中可看出種質(zhì)間遺傳關(guān)系的遠(yuǎn)近，對(duì)于貴州省蕎麥資源進(jìn)一步的保護(hù)和利用具有重要意義。

總之，本研究開(kāi)發(fā)的高效性SSR 分子標(biāo)記能夠有效地鑒定貴州蕎麥重要種質(zhì)的遺傳多樣性，并且可用于構(gòu)建分子身份證。未來(lái)可將篩選到的SSR 標(biāo)記應(yīng)用于更廣泛的蕎麥種質(zhì)的多態(tài)性鑒定和分析中，以促進(jìn)蕎麥的種質(zhì)創(chuàng)新和種質(zhì)保存。

致謝：感謝貴州師范大學(xué)蕎麥產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究中心陳慶富教授和六盤(pán)水職業(yè)技術(shù)學(xué)院張清明老師提供試驗(yàn)材料。

（責(zé)任編輯：張志鈺）