酵母雙雜交技術(shù)在植物研究中的應(yīng)用

摘要要：本文對(duì)酵母雙雜交技術(shù)在植物基因功能研究以及抗逆性等方面的應(yīng)用進(jìn)行了綜述。首先，我們闡述了酵母雙雜交技術(shù)的工作原理以及實(shí)驗(yàn)流程。其次，我們?cè)敿?xì)描述了利用該技術(shù)所取得的一系列重要研究結(jié)果，涉及到不同作物品種間特定基因互作關(guān)系、新型抗逆基因篩選等方面。最后，針對(duì)酵母雙雜交技術(shù)的局限性問題找到新的解決方法，并對(duì)酵母雙雜交技術(shù)在植物領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)行了展望。

關(guān)鍵詞：酵母雙雜交；植物；蛋白互作

中圖分類號(hào)：S188" " " " " " " " " " " "文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A" " " " " " " " " " " " 文章編號(hào)：2095-5774（2024）05-0438-07

Application of Yeast Two-hybrid Technology in Plant Research

Guo Jin，Nie Zhuxin，Wang Jing*

（College of" Biological Science and Engineering，North Minzu University，Yinchuan，Ningxia 750021，China）

Abstract：This review provides an overview of the application of yeast two-hybrid technology in plant gene function research and stress resistance. Firstly，it outlines the working principle and experimental procedures of yeast two-hybrid technology. Secondly，it details a series of significant research findings using this technology，including specific gene interactions among different crop species and the identification of novel stress resistance genes. Finally，a new approach to address the limitations of yeast two-hybrid technology is proposed，along with a prospective outlook on its application in plant research.

Key words：Yeast two-hybrid；Plants；Protein interaction

生命的基本過程就是不同功能蛋白質(zhì)在時(shí)空上有序和協(xié)同作用的結(jié)果，探索蛋白質(zhì)之間的相互作用是理解蛋白質(zhì)功能的基礎(chǔ)。在生物學(xué)研究中，有多種研究蛋白質(zhì)相互作用的方法，包括體外檢測(cè)法：熒光偏振免疫分析法（Fluorescence polarization immunoassay，F(xiàn)PIA）、等溫量熱滴定儀（Isothermal titration calorimetry，ITC）、表面離子體共振（Surface plasmon resonance，SPR）、微量熱泳動(dòng)技術(shù)（Microscale thermophoresis，MST）；體內(nèi)檢測(cè)法：下拉實(shí)驗(yàn)（Pull-down assay）、免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，Co-IP）、蛋白質(zhì)相互作用交聯(lián)分析（Protein interaction crosslinking analysis）、酵母雙雜交（Yeast Two-Hybrid）篩選體系。酵母雙雜交是在體內(nèi)研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間相互作用的一種分子生物學(xué)方法，該方法高效、簡潔，能夠檢測(cè)蛋白質(zhì)之間極微弱或瞬時(shí)的相互作用。在植物研究中具有重要應(yīng)用價(jià)值，該技術(shù)能夠揭示植物中不同蛋白質(zhì)之間復(fù)雜而精細(xì)的相互作用關(guān)系，為深入理解蛋白質(zhì)在植物生長發(fā)育、抗逆性等方面的功能提供了重要依據(jù)。

1工作原理

酵母雙雜交的基礎(chǔ)成分依賴于轉(zhuǎn)錄激活因子GAL4［1］，GAL4轉(zhuǎn)錄激活因子是一種內(nèi)源性表達(dá)蛋白［2］，含有DNA結(jié)合域（DNA binding domain，DNA-BD；GAL41-147aa） ［3］和激活結(jié)構(gòu)域（ Activation domain，AD；GAL4771-881aa） ［4］。Keegan［3］發(fā)現(xiàn)了酵母GAL4蛋白與靶基因上游特定的DNA位點(diǎn)結(jié)合并激活轉(zhuǎn)錄。Fields 和 Song［5］建立了酵母雙雜交體系，在酵母細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)GAL4轉(zhuǎn)錄因子通常具有兩個(gè)相對(duì)獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域：BD和AD，這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域在空間上彼此分離，各具功能。BD和AD相互獨(dú)立時(shí)不能激活轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，只有當(dāng)這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域共同作用時(shí)轉(zhuǎn)錄才能正常進(jìn)行。利用這一特性，可以分別將BD與AD同目標(biāo)蛋白結(jié)合形成融合蛋白，如果待測(cè)的兩個(gè)目標(biāo)蛋白之間發(fā)生相互作用，BD與AD在空間上相互接近從而啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄，使下游的報(bào)告基因表達(dá)，就可以產(chǎn)生可觀測(cè)表型。如果待測(cè)蛋白質(zhì)之間沒有相互作用，則轉(zhuǎn)錄不會(huì)發(fā)生（如圖1所示）。

2組成

酵母雙雜交系統(tǒng)的組成部分，①Gal4 BD ：識(shí)別上游激活序列 （UAS） + 誘餌蛋白X（Bait protein）（通常為已知蛋白）；②Gal4 AD ：轉(zhuǎn)錄激活作用+ 獵物蛋白Y（Prey protein）（通常為未知蛋白）；③帶有報(bào)告基因的宿主菌株：常用報(bào)告基因分為營養(yǎng)缺陷篩選型、抗性篩選型和藍(lán)白斑篩選型報(bào)告基因，營養(yǎng)缺陷篩選型、抗性篩選型報(bào)告基因根據(jù)宿主菌能否在選擇培養(yǎng)基上生長，判斷蛋白質(zhì)之間是否相互作用；藍(lán)白斑篩選型報(bào)告基因通過顯色反應(yīng)篩選陽性克隆。

3實(shí)驗(yàn)流程

酵母雙雜交技術(shù)是檢測(cè)蛋白質(zhì)互作的一種非常有效的方法，其大致的實(shí)驗(yàn)流程為：①構(gòu)建酵母表達(dá)載體，將誘餌蛋白的編碼序列連接到pGBKT7，獵物蛋白的編碼序列連接到pGADT7 ；②酵母遺傳轉(zhuǎn)化，將構(gòu)建好的酵母表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到酵母菌株中；③自激活和自毒檢測(cè)；④酵母雙雜交，將正常轉(zhuǎn)化的酵母菌株在選擇培養(yǎng)基上進(jìn)行適時(shí)培養(yǎng)；⑤檢測(cè)，如果蛋白質(zhì)之間存在相互作用，在SD/-Ade-His-Trp-Leu+X-α-Gal+AbA培養(yǎng)基上，呈現(xiàn)藍(lán)色（如圖2所示）。

4酵母雙雜交技術(shù)在植物研究中的應(yīng)用

酵母雙雜交技術(shù)在植物研究中的應(yīng)用主要包括三個(gè)方面。首先，利用該技術(shù)可以在cDNA文庫中檢測(cè)已知蛋白和確認(rèn)未知蛋白之間的相互作用［6］。其次，可以通過該技術(shù)探索新基因的生物學(xué)功能［7］。最后，酵母雙雜交技術(shù)還可用于確定蛋白質(zhì)之間相互作用所必須的結(jié)構(gòu)域［7］。

4.1 檢測(cè)蛋白質(zhì)之間相互作用

通過酵母雙雜交技術(shù)研究蛋白質(zhì)之間相互作用是探索蛋白質(zhì)功能的關(guān)鍵，植物的生長發(fā)育，細(xì)胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、響應(yīng)生物及非生物脅迫以及細(xì)胞周期調(diào)控等過程，都是蛋白質(zhì)之間相互作用，共同調(diào)控的結(jié)果。在植物生長發(fā)育過程中，可以利用酵母雙雜交技術(shù)研究蛋白質(zhì)之間的相互作用。

在花的生長發(fā)育中，衰老由不可逆的程序性細(xì)胞死亡（Programmed cell death，PCD）過程調(diào)控［8］。Wang等［9］克隆了黃花菜花朵中特異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子HfNAC090和HfNAP1，兩個(gè)基因均在黃花菜花的PCD過程中發(fā)揮主導(dǎo)作用，通過酵母雙雜交技術(shù)證明HfNAC090和HfNAP1之間存在相互作用，該結(jié)果為構(gòu)建黃花菜花朵中PCD調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供了重要依據(jù)，同時(shí)，為延緩黃花菜花朵的衰老提供了新的策略。Chen等［10］在棗樹的研究中，利用酵母文庫篩選技術(shù)，檢測(cè)到對(duì)棗樹芽增殖起正調(diào)控作用的植原體效應(yīng)蛋白Zaofeng6的互作蛋白ZjTCP7，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)Zaofeng6通過抑制ZjTCP7的表達(dá)，促進(jìn)棗樹芽的增殖。這項(xiàng)研究結(jié)果為理解植物病原體效應(yīng)蛋白與植物生長之間的相互作用機(jī)制提供了新的視角。Shan等［11］在研究NAC轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控香蕉果實(shí)成熟中的作用機(jī)制時(shí)，通過酵母雙雜交技術(shù)，檢測(cè)到MaNAC1/2與MaEIN5蛋白相互作用，結(jié)合實(shí)驗(yàn)得出MaNAC1和MaNAC2通過與乙烯信號(hào)通路相互作用參與香蕉果實(shí)的成熟。在山藥中，通過酵母文庫篩選技術(shù)，獲得能夠與調(diào)控山藥塊莖膨大的DoWRKY40相互作用的四種蛋白（內(nèi)切葡聚糖酶蛋白、DNA結(jié)合蛋白BIN4、蛋白磷酸蛋白和BAG家族分子伴侶蛋白），這一研究為解析山藥莖塊膨大及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控過程奠定了基礎(chǔ)［12］。

植物作為環(huán)境的一部分，與外界的光、溫、水、氣、熱及其他生命體相互影響，相互作用。酵母雙雜交技術(shù)是研究植物響應(yīng)逆境脅迫過程中蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用的重要方法。TIFY基因家族對(duì)植物的生長、發(fā)育和抗逆性起著重要的調(diào)控作用［15］。Wang等［16］利用酵母雙雜交技術(shù)，證明兩個(gè)正調(diào)控辣椒植株耐寒性的轉(zhuǎn)錄因子CaTIFY7、CaTIFY10b能夠相互作用，并發(fā)現(xiàn)CaTIFY7與CaTIFY10b可能形成異源二聚體或同源二聚體，正調(diào)控辣椒的冷脅迫反應(yīng)。這項(xiàng)研究成果，為深入理解TIFY基因家族的功能和分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，也為未來開展耐寒辣椒的品種選育提供了依據(jù)。Wang等［15］和王秋月等［16］分別在小葉楊和玉米中，利用酵母文庫篩選技術(shù)，篩選出參與小葉楊響應(yīng)鹽脅迫的乙烯信號(hào)通路相關(guān)因子及能夠調(diào)控玉米大斑病菌黑色素合成相關(guān)的因子，為深入研究小葉楊的鹽脅迫響應(yīng)機(jī)制及玉米大斑病菌的致病機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。光脅迫是限制大豆產(chǎn)量的重要因素，Zhang等［17］，利用酵母雙雜交技術(shù)確定了大豆中GmPLP1和GmVTC2（GmVTC2a，GmVTC2b和GmVTC2c）家族蛋白能夠相互作用，并通過提高大豆內(nèi)源抗壞血酸含量，增強(qiáng)其對(duì)強(qiáng)光脅迫的耐受能力。Lynch等［18］利用酵母文庫篩選，檢測(cè)到組蛋白去乙?；概cABA-INSENSITIVE5結(jié)合蛋白（AFPs）能夠相互作用［19］，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)AFPs可以通過TOPLESS依賴性和非依賴性染色質(zhì)修飾機(jī)制調(diào)節(jié)植物基因?qū)BA的響應(yīng)過程，調(diào)節(jié)植物抗旱過程。

4.2 發(fā)現(xiàn)新的蛋白質(zhì)及蛋白質(zhì)的功能

利用酵母雙雜交技術(shù)，篩選植物不同發(fā)育時(shí)期、不同生長條件的cDNA文庫，可為獲得參與植物某一生命活動(dòng)的新的蛋白質(zhì)或已知蛋白質(zhì)的新功能提供思路，這是酵母雙雜交技術(shù)目前最受矚目的應(yīng)用之一。Lin等［20］在研究MPK4介導(dǎo)的煙草抗煙草青霉素桿菌的實(shí)驗(yàn)中，通過篩選煙草葉片mRNA文庫，獲得能夠與MPK4相互作用的肌醇-3-磷酸合成酶同工酶1（MIPS1）蛋白，兩者協(xié)同作用參與了植株與多種壓力相關(guān)ROS的產(chǎn)生，影響氣孔運(yùn)動(dòng)，進(jìn)而增強(qiáng)了植株抗病性。此外，通過篩庫，還獲得與葉綠體發(fā)育相關(guān)的兩個(gè)伴侶蛋白60亞單位α1（CPN60A）和DNA J蛋白A7 （DJA7）及與Ras信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的RAB GTPASE同源物A1G（RABA1G），這些蛋白的發(fā)現(xiàn)，為深入理解MPK4激酶的新功能開辟了新的方向。Wang等［21］利用菌核菌的真菌效應(yīng)物Sspg1d篩選油菜的cDNA文庫，鑒定出一個(gè)含有C2結(jié)構(gòu)域的小蛋白（IPG-1），IPG-1可被菌核菌高度誘導(dǎo)表達(dá)，這為解析菌核菌與油菜的作用機(jī)制提供了新的候選基因。Cao等［22］構(gòu)建了高質(zhì)量的小麥春化過程酵母cDNA文庫，以TaVRN-A1為誘餌，篩選得到兩個(gè)互作蛋白TaSOC1和TaSVP1，為理解小麥春化途徑的調(diào)控提供了重要的線索。Guo等［23］以GhZFP1為誘餌蛋白，篩選陸地棉的cDNA文庫，檢測(cè)到GhZFP1蛋白可與參與棉花響應(yīng)缺水脅迫的GZIRD21A蛋白和抗病相關(guān)的GZIPR5相互作用，揭示GhZFP1很可能是一個(gè)陸地棉響應(yīng)鹽脅迫和真菌病害的調(diào)控因子。

4.3 檢測(cè)蛋白質(zhì)相互作用的特定區(qū)域

大多數(shù)功能蛋白具有多個(gè)結(jié)構(gòu)域，蛋白與蛋白相互作用時(shí)，往往依賴于特定的結(jié)構(gòu)域結(jié)合，進(jìn)而發(fā)揮功能。研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用的結(jié)構(gòu)域時(shí)，可以將蛋白質(zhì)按照結(jié)構(gòu)域劃分，分別構(gòu)建載體，研究其相互作用。Ferna?ndez-Calvo等［24］發(fā)現(xiàn)MYC2蛋白與茉莉酸信號(hào)通路調(diào)控因子JAZs（Jasmonate ZIM-domain）結(jié)合過程中，N端序列是必須的結(jié)構(gòu)域，將MYC2蛋白N端序列截?cái)酁镸YC2-D55-99和MYC2-D93-160，分別構(gòu)建載體，通過酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)，證明MYC2-D93-160結(jié)構(gòu)域可與大多數(shù)JAZs蛋白互作，通過生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)MYC2-D93-160結(jié)構(gòu)域在與JAZs互作的MYC蛋白中高度保守。這項(xiàng)研究成果為篩選能夠在茉莉酸信號(hào)通路中發(fā)揮作用的蛋白提供了數(shù)據(jù)支撐。Kang等［25］，利用酵母雙雜交技術(shù)從蘋果中篩選出與MdCOP1互作的MdBT2蛋白，并證明兩個(gè)蛋白相互作用的結(jié)構(gòu)域?yàn)镸dBT2的back-like結(jié)構(gòu)域和MdCOP1的coil-coil結(jié)構(gòu)域，這為理解蘋果花色苷生物合成的分子調(diào)控機(jī)制提供了新的視角。Guo等［26］構(gòu)建了無機(jī)磷酸鹽（Pi）處理的水稻幼苗cDNA文庫，并通過酵母雙雜交技術(shù)，篩選獲得與OsSPX-MFS3相互作用的蛋白OsSYP22，并進(jìn)一步證明OsSYP22全長、OsSYP22SynN、OsSYP22SynN+t-SNARE 可與OsSPX-MFS3的SPX的結(jié)構(gòu)域相互作用，在水稻感知磷酸鹽穩(wěn)態(tài)過程中發(fā)揮作用。

5 酵母雙雜交技術(shù)的局限性

在植物研究領(lǐng)域，酵母雙雜交技術(shù)雖然被廣泛應(yīng)用，但仍存在一些不足之處。其中主要表現(xiàn)為：①假陽性，即靶蛋白或誘餌蛋白具有自激活性，在無需相互結(jié)合的情況下就能激活轉(zhuǎn)錄功能并產(chǎn)生可觀測(cè)的表型。為避免這種情況的發(fā)生，需要進(jìn)行空白試驗(yàn)來消除影響。 ②假陰性［27］，即不能在細(xì)胞內(nèi)折疊的蛋白質(zhì)或不能進(jìn)入細(xì)胞核的蛋白質(zhì)無法通過酵母雙雜交技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，并且所有表達(dá)的蛋白質(zhì)都不能具有毒性［28］。目前，為了克服酵母雙雜交技術(shù)的限制，已經(jīng)開發(fā)和應(yīng)用了多種新興技術(shù)和方法。例如，分裂泛素化細(xì)胞質(zhì)酵母雙雜交系統(tǒng)以及基因編輯技術(shù)優(yōu)化酵母雙雜交系統(tǒng)等。分裂泛素化細(xì)胞質(zhì)酵母雙雜交系統(tǒng)通過將目標(biāo)蛋白分為兩部分，并在不同的細(xì)胞中表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)在細(xì)胞質(zhì)中的正確折疊和功能表達(dá)。這一方法有助于研究那些可能無法在傳統(tǒng)酵母雙雜交系統(tǒng)中正確表達(dá)或折疊的蛋白質(zhì)［29］。此外，利用基因編輯技術(shù)優(yōu)化酵母雙雜交系統(tǒng)也是一個(gè)可行的途徑，通過CRISPR-Cas9等基因編輯技術(shù)，在酵母細(xì)胞中精確修改特定基因的表達(dá)，以增強(qiáng)或抑制某些蛋白質(zhì)的功能，從而優(yōu)化酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)［30］。

6 展望

除了在基礎(chǔ)科學(xué)研究中的應(yīng)用外，酵母雙雜交技術(shù)的研究成果也被廣泛運(yùn)用于作物的遺傳改良。利用該技術(shù)可以篩選出與特定性狀相關(guān)聯(lián)的蛋白質(zhì)，并進(jìn)一步進(jìn)行功能分析和基因編輯，從而為生物育種提供新思路和方法。

總之，酵母雙雜交技術(shù)不僅在揭示植物細(xì)胞內(nèi)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)方面具有重要意義，在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域也有著廣闊的應(yīng)用前景。隨著該技術(shù)不斷完善和深入應(yīng)用，必將在生命科學(xué)研究中做出更大貢獻(xiàn)。

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（責(zé)任編輯：馮" "新）

收稿日期：2024-05-06

項(xiàng)目基金：北方民族大學(xué)研究生創(chuàng)新項(xiàng)目（YCX24405）

作者簡介：*為通訊作者，王靜（1984-），女，副教授，主要從事植物此生代謝產(chǎn)物調(diào)控的研究，E-mail：wangjing_imu2@163.com 。

郭瑾（1994-），女，碩士研究生，主要從事植物次生代謝產(chǎn)物調(diào)控研究，E-mail：1282524504@qq.com