血小板衍生生長因子對脈絡(luò)膜黑色素瘤細(xì)胞活性及侵襲能力的影響

［摘要］ 目的

探討血小板衍生生長因子（PDGF）對脈絡(luò)膜黑色素瘤（choroidal melanoma，CM）細(xì)胞活性及侵襲能力的影響。

方法 將CM細(xì)胞分為A、B組，分別轉(zhuǎn)染空載體和敲降PDGF的慢病毒，采用RT-qPCR技術(shù)檢測兩組細(xì)胞中PDGF mRNA相對表達(dá)量，采用XTT實(shí)驗(yàn)檢測兩組細(xì)胞活性，采用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測兩組細(xì)胞侵襲能力，采用Western blot實(shí)驗(yàn)檢測兩組細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）及基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）相關(guān)標(biāo)志物蛋白的相對表達(dá)量。GEPIA數(shù)據(jù)庫分析PDGF水平與CM患者預(yù)后的關(guān)系。

結(jié)果 與A組比較，B組細(xì)胞中PDGF RNA相對表達(dá)量下降（t=176.30，Plt;0.05），細(xì)胞存活數(shù)目下降及侵襲能力減弱（F=57.21，t=14.10，Plt;0.05）。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與A組相比，B組細(xì)胞中E-cadherin相對表達(dá)量升高，N-cadherin、Snail、Vimentin、MMP9及MT1 MMP的相對表達(dá)量下降（t=4.13～14.14，Plt;0.05）。GEPIA數(shù)據(jù)庫分析顯示，PDGF-A、PDGF-B高表達(dá)與CM患者的不良預(yù)后有關(guān)（Plt;0.05）。

結(jié)論 PDGF具有增強(qiáng)CM細(xì)胞活性，促進(jìn)CM細(xì)胞侵襲的作用，其機(jī)制可能與誘導(dǎo)細(xì)胞EMT的發(fā)生有關(guān)。

［關(guān)鍵詞］ 黑色素瘤；脈絡(luò)膜腫瘤；血小板源性生長因子；細(xì)胞增殖；腫瘤浸潤；上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化；基質(zhì)金屬蛋白酶類

［中圖分類號］ R739.7

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］ A

Effect of platelet-derived growth factor on the activity and invasion ability of choroidal melanoma cells

YAO Ningning， YUAN Yingying， MA Qingyue， YI Wendan， SUI Aihua， LUO Wenjuan

（Department of Ophthalmology， The Affiliated Hospital of Qingdao University， Qingdao 266003， China）

; ［ABSTRACT］＼ Objective To investigate the effect of platelet-derived growth factor （PDGF） on the activity and invasion ability of choroidal melanoma （CM） cells.

Methods CM cells were divided into groups A and B and were transfected with empty vector and PDGF knockdown lentivirus， respectively. RT-qPCR was used to measure the relative expression level of PDGF mRNA; XTT assay was used to measure cell activity; Transwell assay was used to test the invasion ability of cells in the two groups; Western blot was used to measure the relative expression levels of epithelial-mesenchymal transition （EMT） marker proteins and matrix metalloproteinases （MMPs）. GEPIA database was used to investigate the association between PDGF and the prognosis of CM patients.

Results Compared with group A， group B had significant reductions in the relative expression level of PDGF RNA （t=176.30，Plt;0.05）， the number of cells which survived （F=57.21，Plt;0.05）， and the invasion ability of cells （F=57.21，t=14.10，Plt;0.05）. Western blot showed that compared with group A， group B had a significant increase in the relative expression level of E-cadherin and significant reductions in the relative expression levels of N-cadherin， Snail， Vimentin， MMP9， and MT1 MMP （t=4.13-14.14，Plt;0.05）. The GEPIA database analysis showed that the high expression levels of PDGF-A and PDGF-B were associated with the poor prognosis of CM patients （Plt;0.05）.

Conclusion PDGF can enhance the activity of CM cells and promote the invasion of CM cells， possibly by inducing EMT.

［KEY WORDS］ Melanoma; Choroid neoplasms; Platelet-derived growth factor; Cell proliferation; Neoplasm invasiveness; Epithelial-mesenchymal transition; Matrix metalloproteinases

脈絡(luò)膜黑色素瘤（choroidal melanoma，CM）是起源于脈絡(luò)膜基質(zhì)內(nèi)的黑色素瘤細(xì)胞，是成人眼部最常見的惡性腫瘤［1］。CM易通過血液循環(huán)發(fā)生轉(zhuǎn)移，最容易轉(zhuǎn)移的部位是肝臟［2-3］。目前手術(shù)、放療（包括放射敷貼）、激光等治療方法雖然可以使CM患者的癥狀獲得一定程度的改善，但是患者的總體生存率仍然很低。因此揭示CM發(fā)生發(fā)展的具體機(jī)制，探尋其潛在的治療靶點(diǎn)，是目前的研究熱點(diǎn)之一。血小板衍生生長因子（PDGF）是一種有絲分裂因子，可分為PDGF-A～PDGF-D四種亞型，單體通過二硫鍵可形成PDGF-AA、PDGF-BB、PDGF-CC、PDGF-DD、PDGF-AB同型或異型二聚體［4-5］。在生理狀態(tài)下，PDGF與受體結(jié)合后可以激活MAPK、PI3K等信號通路［6］，促進(jìn)細(xì)胞的生長、遷移和表型轉(zhuǎn)化等［7］。研究還發(fā)現(xiàn)，PDGF在多種惡性腫瘤的發(fā)展中均發(fā)揮著重要作用，如PDGF高表達(dá)的卵巢癌患者，其臨床預(yù)后較差［8］，在轉(zhuǎn)基因小鼠前列腺癌模型中PDGF-B高表達(dá)，且給予PDGF-B抑制劑后前列腺癌細(xì)胞的增殖能力減弱［9］。然而PDGF對CM細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響尚不清楚。本研究通過慢病毒敲降CM細(xì)胞中PDGF的表達(dá)水平，探討PDGF對CM細(xì)胞增殖、侵襲及上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）的影響，旨在為CM的治療提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞來源及培養(yǎng)

CM細(xì)胞Ocm-1購自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院，置于含10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素的RIPM-1640培養(yǎng)基中，于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，至對數(shù)生長期時用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2 細(xì)胞的轉(zhuǎn)染

敲降PDGF的慢病毒購買于上海漢恒生物科技有限公司。將對數(shù)生長期的Ocm-1細(xì)胞接種于6孔板中，當(dāng)細(xì)胞融合度接近于50%時，分為A、B組，分別于培養(yǎng)基中加入空載體慢病毒（A組）和敲降PDGF慢病毒（B組）再繼續(xù)培養(yǎng)48 h。然后更換為新鮮培養(yǎng)基，使用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞熒光情況，當(dāng)細(xì)胞熒光密度達(dá)80%～90%時，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 RT-qPCR技術(shù)檢測細(xì)胞中PDGF mRNA相對表達(dá)量

根據(jù)說明書使用TRIzol試劑分別提取A、B組細(xì)胞中的總RNA，使用分光光度計檢測RNA濃度和純度，然后根據(jù)說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和RT-qPCR反應(yīng)。以GAPDH為內(nèi)參，使用2－△△CT公式計算PDGF的相對表達(dá)量。引物名稱及其序列見表1。

1.4 XTT實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的活性

將轉(zhuǎn)染成功的A、B組細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，接種于96孔板中，每孔1×104個細(xì)胞，每組設(shè)置3個復(fù)孔。第2天待細(xì)胞完全貼壁后，根據(jù)說明書加

入XTT試劑繼續(xù)培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)第24、48、72小

時時使用酶標(biāo)儀于波長450 nm處檢測兩組細(xì)胞的吸光度值。根據(jù)吸光度值按照說明書計算細(xì)胞的存活數(shù)目。

1.5 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的侵襲能力

按照說明書要求，提前將基質(zhì)膠鋪于上室并待其凝固。然后將轉(zhuǎn)染成功的A、B組細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，依次進(jìn)行消化、計數(shù)，每組取1×104個細(xì)胞，用不含血清的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后加入到上室。下室中均加入600 μL含有10% FBS的培養(yǎng)基作為化學(xué)引誘劑。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，棄去上室培養(yǎng)基，使用PBS清洗2次，用棉簽輕輕擦去上室存留的細(xì)胞，然后依次進(jìn)行甲醇固定、1%伊紅染色和自然風(fēng)干后，使用倒置顯微鏡觀察并拍照，計算穿過小室（即下室）的細(xì)胞數(shù)目。

1.6 Western blot實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞中EMT相關(guān)標(biāo)志物蛋白的相對表達(dá)量

將轉(zhuǎn)染成功的A、B組細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，用PBS沖洗細(xì)胞3次后，加入含1%蛋白酶抑制劑（P0100，北京索萊寶生物科技有限公司）的RIPA蛋白裂解液（P0010，北京索萊寶生物科技有限公司），于冰上裂解30 min，然后在4 ℃下13 000 r/min離心15 min，取上清液。采用BCA蛋白測定試劑盒測定細(xì)胞的蛋白濃度。以SDS-PAGE電泳分離蛋白樣品，后將其電轉(zhuǎn)至PVDF膜上。用5%脫脂乳在室溫下封閉膜2 h，加一抗4 ℃過夜。第2天，用PBST沖洗PVDF膜3次，加入相應(yīng)二抗室溫孵育1 h。最后，用PBST再沖洗PVDF膜3次，以ECL化學(xué)發(fā)光法檢測蛋白表達(dá)水平，使用Image J軟件分析蛋白條帶的灰度值，以目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值計算目的蛋白的相對表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 22.0和Graphpad Prism 9軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料以x-±s表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，兩組間不同時間點(diǎn)的比較采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析。在GEPIA數(shù)據(jù)庫當(dāng)中采用Kaplan-Meier法分析PDGF-A、PDGF-B基因表達(dá)與CM患者預(yù)后的關(guān)系。以Plt;0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)" 果

2.1 PDGF表達(dá)對細(xì)胞活性的影響

RT-qPCR技術(shù)檢測結(jié)果顯示，A、B組細(xì)胞中PDGF的相對表達(dá)量分別為1.00±0.00、0.11±0.01，與A組相比，B組細(xì)胞中PDGF的相對表達(dá)量明顯下降（t=176.30，Plt;0.05）。重復(fù)測量設(shè)計的方差分析結(jié)果顯示，組別、時間以及時間和組別的交互作用對Ocm-1細(xì)胞存活數(shù)目均具有顯著影響（F組別=57.21，F(xiàn)時間=1 012.46，F(xiàn)交互=35.77，Plt;0.05）；單獨(dú)效應(yīng)分析顯示，隨著培養(yǎng)時間延長，A、B組細(xì)胞存活的數(shù)目均逐漸增高，差異具有顯著意義（F組內(nèi)=444.90，130.50，Plt;0.05）；在培養(yǎng)第24、48、72小時時兩組細(xì)胞存活數(shù)目比較均具有顯著差異（F組間=14.45～105.68，Plt;0.05）。見表2。

2.2 PDGF對兩組細(xì)胞侵襲能力的影響

Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，A、B組細(xì)胞侵襲數(shù)量分別為（288.70±13.32）、（127.00±14.73）個，兩組間比較差異具有顯著性（t=14.10，Plt;0.05），詳見圖1。

2.3 PDGF對細(xì)胞中EMT相關(guān)標(biāo)志物蛋白表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果顯示，與A組相比，B組細(xì)胞中上皮標(biāo)志物E-cadherin的相對表達(dá)量顯著增加（t=4.13，Plt;0.05），間質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin、Snail和Vimentin蛋白的相對表達(dá)量均顯著下降（t=7.70～14.14，Plt;0.05），腫瘤遷移侵襲相關(guān)因子MMP9以及MT1 MMP的相對表達(dá)量也顯著下降（t=5.30、8.50，Plt;0.05）。見表3。

2.4 PDGF與CM患者不良預(yù)后的關(guān)系

GEPIA數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，PDGF-A、PDGF-B基因的表達(dá)水平與CM患者的不良預(yù)后呈負(fù)相關(guān)（Plt;0.05）。

3 討" 論

CM是葡萄膜黑色素瘤的主要亞型。CM具有預(yù)后差、轉(zhuǎn)移率高和死亡率高的特點(diǎn)，其發(fā)生發(fā)展的詳細(xì)機(jī)制尚不完全清楚。雖然手術(shù)、放療（包括放射敷貼）、激光等治療方法有了一定進(jìn)展，但CM患者的總體生存率仍然很低。目前關(guān)于CM發(fā)生發(fā)展的具體機(jī)制也尚待明確。

PDGF具有促進(jìn)細(xì)胞的生長、增殖、遷移及血管生成等多種功能［10］。在小鼠皮下瘤模型（T241纖維肉瘤和Lewi肺癌細(xì)胞）中，PDGF-BB可通過與PDGFR-β結(jié)合誘導(dǎo)促紅細(xì)胞生成素（EPO）的表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤血管生成和腫瘤生長［11］。PDGF-D在人類惡性腫瘤中發(fā)揮重要作用，參與腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、侵襲、血管生成等多種生命過程［12］。本研究首先使用空載體慢病毒和敲降PDGF病毒轉(zhuǎn)染CM細(xì)胞，使用RT-qPCR方法，檢測兩組細(xì)胞中PDGF基因的表達(dá)水平，結(jié)果顯示B組的細(xì)胞中PDGF表達(dá)水平顯著下降，說明敲降PDGF慢病毒轉(zhuǎn)染成功。然后使用XTT和Transwell實(shí)驗(yàn)檢測PDGF對于CM細(xì)胞活性和侵襲能力的影響。XTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，敲降PDGF后CM細(xì)胞的活性下降；Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，敲降PDGF后CM細(xì)胞的侵襲能力下降，說明PDGF表達(dá)能夠增強(qiáng)CM細(xì)胞的活性和促進(jìn)其侵襲能力。為了進(jìn)一步研究PDGF對CM的影響，本研究使用GEPIA數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)PDGF-A、PDGF-B高表達(dá)與CM患者的不良預(yù)后有關(guān)。由此可知，PDGF在CM的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

EMT是指上皮細(xì)胞通過特定程序轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)表型細(xì)胞的生物學(xué)過程［13］。EMT會使癌細(xì)胞失去細(xì)胞與細(xì)胞之間的連接，并且通過調(diào)控各種基質(zhì)降解酶降解局部組織的基底膜，從而使腫瘤細(xì)胞完成侵襲與遷移的過程，導(dǎo)致腫瘤的轉(zhuǎn)移以及復(fù)發(fā)［14-16］，是腫瘤獲得惡性表型的關(guān)鍵。EMT相關(guān)標(biāo)志物包括E-cadherin、N-cadherin、Snail、Vimentin、Zeb1等。SINKEVICIUS等［17］發(fā)現(xiàn)在肺腺癌小鼠模型中，腫瘤組織中E-cadherin低表達(dá)可以促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移。而組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶CSRP2BP通過激活N-cadherin的表達(dá)促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移［18］。在胰腺導(dǎo)管癌中，Girdin與Vimentin相互作用可以誘導(dǎo)EMT進(jìn)程，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移［19］。相關(guān)研究顯示EMT相關(guān)標(biāo)志物Zeb1、Snail等也具有促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的作用［20-22］。MMPs不僅是一個蛋白水解酶的大家族，也是鋅依賴性內(nèi)肽酶，可降解細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白質(zhì)，在激活生長因子和維持人體正常組織結(jié)構(gòu)穩(wěn)定方面發(fā)揮著關(guān)鍵的作用，特別是在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移中。MMP9和MT1 MMP屬于MMPs家族的成員，研究表明MMP9和MT1 MMP可通過降解組織中的膠原蛋白和凝膠蛋白促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移［23］。研究還發(fā)現(xiàn)，膽管癌細(xì)胞中PDGF高表達(dá)可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT形態(tài)轉(zhuǎn)化，從而促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移［24］。在結(jié)直腸癌中，PDGF通過誘導(dǎo)EMT增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲［25］，說明PDGF可以通過EMT促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移。由此可以推測，PDGF可能通過影響EMT進(jìn)程影響CM的遷移。因此在本研究中，使用Western blot實(shí)驗(yàn)檢測敲降PDGF后CM細(xì)胞中EMT相關(guān)標(biāo)志物蛋白的水平，結(jié)果顯示，EMT上皮標(biāo)志物E-cadherin蛋白水平表達(dá)升高，間質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin、Snail和Vimentin的蛋白表達(dá)水平下降，同時腫瘤遷移侵襲相關(guān)因子MMP9和MT1 MMP的蛋白表達(dá)水平也下降，因此進(jìn)一步提示，敲降PDGF可以抑制EMT進(jìn)程，從而抑制CM的侵襲能力。

綜上所述，PDGF具有增強(qiáng)CM細(xì)胞活性的作用，其可能是通過促進(jìn)EMT相關(guān)標(biāo)志物蛋白的表達(dá)水平，進(jìn)而調(diào)控EMT，促進(jìn)CM細(xì)胞的侵襲。本研究為CM的治療提供了理論參考，后續(xù)還需對相關(guān)機(jī)制進(jìn)行更深入和更全面的探討。

作者聲明：姚寧寧、袁瑩瑩、羅文娟參與了研究設(shè)計；姚寧寧、馬清悅、易雯丹、隋愛華參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發(fā)表該論文，且均聲明不存在利益沖突。

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（本文編輯 耿波）