4-HMA對氧糖剝奪/復(fù)氧神經(jīng)元細胞和大腦中動脈栓塞/再灌注小鼠腦組織損傷的保護作用及其機制

［摘要］ 目的

探討4-羥基扁桃酸（4-HMA）對氧糖剝奪/復(fù)氧（OGD/R）致神經(jīng)元細胞損傷以及大腦中動脈栓塞/再灌注（MCAO/R）致小鼠腦組織損傷的保護作用及其機制。

方法 提取原代神經(jīng)元細胞，設(shè)立對照組（神經(jīng)元培養(yǎng)基培養(yǎng)）、OGD/R組（OGD/R處理）及OGD/R+4-HMA組（給予OGD/R處理+4-HMA干預(yù)）。在各組細胞培養(yǎng)6 h后，采用Western blot法檢測各組神經(jīng)元細胞中白蛋白激酶B（Akt）和磷酸化Akt（p-Akt）的水平，通過CCK-8實驗檢測各組細胞的細胞活力。將C57BL/6小鼠隨機分為Sham組、MCAO/R組及MCAO/R+4-HMA組，每組6只。Sham組小鼠僅頸外動脈造口，但不阻塞其大腦中動脈；MCAO/R組和MCAO/R+4-HMA組小鼠均進行MCAO手術(shù)，栓塞大腦中動脈1.5 h恢復(fù)血流，MCAO/R+4-HMA組小鼠分別于血流恢復(fù)0、3 h時腹腔注射4-HMA，MCAO/R組小鼠不做任何處理。采用TTC染色法測定各組小鼠的腦梗死體積百分比并計算梗死區(qū)域占總腦體積百分比，并通過小鼠改良神經(jīng)損傷評分（mNSS）對小鼠行為學(xué)進行評估。

結(jié)果 OGD/R、OGD/R+4-HMA組與對照組比較，細胞中p-Akt相對表達量、p-Akt/Akt比值顯著性增高（F=10.49、8.87，tLSD=3.02～3.14，Plt;0.05），Akt相對表達量差異無顯著性（Pgt;0.05）。OGD/R+4-HMA組的細胞活力明顯高于OGD/R組（F=104.60，tLSD=7.28，Plt;0.05）。相較于MCAO/R組，MCAO/R+4-HMA組小鼠的mNSS分值和腦梗死體積百分比均顯著降低（F=7.20、108.00，tLSD=3.32、5.41，Plt;0.05）。

結(jié)論 4-HMA能夠減輕OGD/R模型致神經(jīng)元細胞的損傷，降低MCAO/R小鼠的腦梗死體積百分比，其作用機制可能與提高腦神經(jīng)元細胞中p-Akt水平有關(guān)。

［關(guān)鍵詞］ 細胞低氧；再灌注損傷；缺氧缺血，腦；神經(jīng)元；神經(jīng)保護；抗氧化劑；氧化性應(yīng)激

［中圖分類號］ R743.3;R338

［文獻標志碼］ A

Protective effect of 4-hydroxymandelic acid against neuronal cell injury induced by oxygen-glucose deprivation/reoxygenation and brain tissue damage induced by middle cerebral artery occlusion/reperfusion in mice and its mechanism

LIU Wenhao， SUN Xiaona， WANG Xiaorong， ZHAO Zhiyuan， XU Rui

（School of Basic Medicine， Qingdao University， Qingdao 266071， China）

; ［ABSTRACT］＼ Objective To investigate the protective effect of 4-hydroxymandelic acid （4-HMA） against neuronal cell injury induced by oxygen-glucose deprivation/reoxygenation （OGD/R） and brain tissue damage induced by middle cerebral artery occlusion/reperfusion （MCAO/R） in mice and its mechanism.

Methods Primary neuronal cells were extracted and divided into control group （cultured in neuronal culture medium）， OGD/R group （treated with OGD/R）， and OGD/R+4-HMA group （treated with OGD/R and 4-HMA intervention）. After 6 h of cells culture， Western blot was used to measure the levels of protein kinase B （Akt） and phosphorylated Akt （p-Akt） in neuronal cells of each group， and CCK-8 assay was used to measure cell viability in each group. C57BL/6 mice were randomly divided into Sham group， MCAO/R group， and MCAO/R+4-HMA group， with 6 mice in each group. The mice in the Sham group were given an external carotid artery stoma alone， but without middle cerebral artery occlusion. The mice in the MCAO/R group and the MCAO/R+4-HMA group were given MCAO surgery， with the restoration of blood flow after middle cerebral artery occlusion for 1.5 h; the mice in the MCAO/R+4-HMA group were given intraperitoneal injection of 4-HMA at 0 and 3 h after the restoration of blood flow， while those in the MCAO/R group were not given such treatment. TTC staining was used to measure the percentage of cerebral infarct volume and calculate the percentage of infarct area in total brain volume， and modified Neurological Severity Score （mNSS） was used to assess the behaviors of mice.

Results Compared with the control group， the OGD/R group and the OGD/R+4-HMA group had significant increases in the re-

lative expression level of p-Akt and p-Akt/Akt ratio （F=10.49，8.87，tLSD=3.02-3.14，Plt;0.05）， and there was no significant difference in the relative expression level of Akt （Pgt;0.05）. The OGD/R+4-HMA group had a significantly higher cell viability than the OGD/R group （F=104.60，tLSD=7.28，Plt;0.05）. Compared with the MCAO/R group， the MCAO/R+4-HMA group had significant reductions in mNSS score and the percentage of cerebral infarct volume （F=7.20，108.00， tLSD=3.32，5.41，Plt;0.05）.

Conclusion This study shows that 4-HMA can alleviate neuronal injury caused by OGD/R and reduce the percentage of cerebral infarct volume in MCAO/R mice， possibly by increasing the level of p-Akt in neuronal cells.

［KEY WORDS］ Cell hypoxia; Reperfusion injury; Hypoxia-

ischemia， brain; Neurons; Neuroprotection; Antioxidants; Oxidative stress

缺血性腦卒中是影響中老年人身體健康的主要疾病之一，其致殘致死率居世界首位［1］。目前，缺血性腦卒中主要的治療方式是通過靜脈溶栓或者血管內(nèi)介入取栓使缺血區(qū)域血流再通，以挽救缺血半暗帶［2-3］。然而并不是所有患者都能從血流再通中獲益，缺血再灌注（I/R）損傷是造成缺血性腦卒中患者預(yù)后不良的重要原因之一［4］。因此，闡明I/R損傷的機制對治療缺血性腦卒中、提高患者預(yù)后具有重要意義。氧化應(yīng)激過程中過氧化物的過度產(chǎn)生是造成I/R損傷的重要原因［5-6］，清除過氧化物對于維持細胞穩(wěn)態(tài)和預(yù)防I/R損傷至關(guān)重要。目前，臨床上應(yīng)用的抗氧化劑藥物的療效并沒有達到理想效果［7］。輔酶Q（CoQ）是一種對氧化磷酸化至關(guān)重要的氧化還原活性脂質(zhì)，幾乎所有細胞都能合成，4-羥基扁桃酸（4-HMA）是合成抗氧化劑CoQ頭部基團的重要前體［8］。本研究旨在觀察4-HMA對氧糖剝奪/復(fù)氧（OGD/R）損傷的神經(jīng)元細胞和大腦中動脈栓塞/再灌注（MCAO/R）模型小鼠的保護作用，并對其機制進行深入的研究和探討。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雄性C57/BL6小鼠23只，6～8周齡，體質(zhì)量23～25 g，購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司。飼養(yǎng)于青島大學(xué)實驗動物房，室內(nèi)恒溫恒濕，通風良好，光照充足，小鼠自由飲食。

1.2 實驗材料

4-HMA和CCK-8試劑盒購自上海陶術(shù)生物科技有限公司；Neurobasal培養(yǎng)基、B-27補充劑和L-谷氨酰胺購自美國Gibco公司；蛋白激酶B（Akt）、磷酸化Akt蛋白（p-Akt）、β-肌動蛋白（β-actin）一抗抗體和二抗抗體（羊抗兔）購自武漢愛博泰克生物科技有限公司；ECL發(fā)光液購自大連美侖生物技術(shù)有限公司；2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）和組織細胞固定液購自北京索萊寶科技有限公司。原代神經(jīng)元細胞由青島大學(xué)神經(jīng)再生與康復(fù)研究院提供。

1.3 體外實驗

1.3.1 原代神經(jīng)元細胞分組及處理 將原代神經(jīng)元細胞分別以3×108個/L和1×109個/L的密度接種到包被有多聚賴氨酸的48孔板和6孔板上，加入神經(jīng)元培養(yǎng)基（Neurobasal培養(yǎng)基50 mL+1% B-27補劑+0.5 μmol/L的L-谷氨酰胺+1%青霉素-鏈霉素），均置于37 ℃、含體積分數(shù)0.05 CO2的恒溫箱中培養(yǎng)7 d。培養(yǎng)期間，神經(jīng)元培養(yǎng)基每3 d更換一次［9］。第7天時，對細胞進行觀察，當細胞狀態(tài)良好、突觸狀態(tài)正常時，將細胞分為對照組、OGD/R組、OGD/R+4-HMA組。對照組細胞培養(yǎng)板中加入神經(jīng)元培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)7.5 h；OGD/R組、OGD/R+4-HMA組神經(jīng)元細胞均進行90 min OGD/R處理［10］，在再復(fù)氧時，OGD/R+4-HMA組向培養(yǎng)板中加入40 mol/L的4-HMA，OGD/R組加入等量DMSO，繼續(xù)培養(yǎng)6 h［11］。

1.3.2 各組細胞活力檢測 將48孔板中培養(yǎng)6 h的各組原代神經(jīng)細胞，棄去原培養(yǎng)液，加入CCK-8工作液（神經(jīng)元培養(yǎng)基和CCK-8原液比例為9∶1），同時設(shè)立無細胞的空白對照，繼續(xù)培養(yǎng)6 h。采用SpectraMax ABS（美國Molecular Devices公司）于波長450 nm處檢測各組神經(jīng)元細胞的吸光度值，并計算細胞活力。細胞活力=（實驗組的吸光度值－空白組的吸光度值）/（對照組的吸光度值－空白組的吸光度值）×100%。實驗重復(fù)3次，結(jié)果取均值。

1.3.3 蛋白免疫印跡（Western blot）實驗檢測各組神經(jīng)元細胞中Akt、p-Akt的表達水平 收集6孔板中培養(yǎng)6 h的各組原代神經(jīng)細胞，加入蛋白裂解液（PMSF∶RIPA=1∶100）提取總蛋白。按照SDS-PAGE凝膠制備說明書操作步驟，分離樣品中的蛋白質(zhì)。使用快速封閉液封閉PVDF膜（美國Cytiva公司）10 min，并且依次加入p-Akt一抗（1∶2 000）以及Akt一抗（1∶2 000），4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次，二抗室溫孵育1 h，TBST再次洗膜3次，顯影。以β-actin為內(nèi)參，使用Image J軟件對蛋白的灰度值進行分析，并計算各組細胞Akt和p-Akt的相對表達量。實驗重復(fù)3次，結(jié)果取均值。

1.4 動物實驗

1.4.1 動物分組及處理 C57BL/6小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機分為Sham組（6只）、MCAO/R組（10只）和MCAO/R+4-HMA組（7只）。所有小鼠均先使用異氟烷麻醉，切開頸部皮膚、分離頸動脈后，Sham組小鼠僅頸外動脈造口，但是不阻塞其大腦中動脈；MCAO/R組小鼠在頸外動脈造口后插入線栓，阻塞其大腦中動脈1.5 h后拔出線栓，再恢復(fù)血流灌注6 h，制備小鼠腦MCAO/R模型［10］；MCAO/R+4-HMA組小鼠在制備腦MCAO/R模型過程中，分別于血流恢復(fù)0、3 h時，經(jīng)腹腔注射40 mg/kg的4-HMA。模型制備成功后，各組小鼠再常規(guī)飼養(yǎng)24 h。在模型制備過程中，MCAO/R組小鼠死亡4只，MCAO/R+4-HMA組小鼠死亡1只。

1.4.2 小鼠改良神經(jīng)損傷評分（mNSS）分值及腦梗死體積百分比測定 各組小鼠在飼養(yǎng)24 h后，采用mNSS量表對小鼠行為學(xué)進行評估［12］。評估結(jié)束后，以4%異氟烷麻醉各組小鼠，剝離出小鼠的腦組織，行2 mm厚冠狀切片，每只小鼠腦組織切成6片。將小鼠腦組織切片以含有2% TTC溶液的磷酸鹽緩沖液染色30 min后，置于4%甲醛溶液中4 ℃過夜。使用掃描儀（日本Seiko Epson公司）觀察切片并拍照。采用盲法（操作者對小鼠分組情況未知）操作，使用Image J軟件分析和計算各組小鼠腦梗死體積百分比。腦梗死體積百分比=腦梗死總體積/腦組織總體積×100%。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

采用GraphPad Prism 9和IBM SPSS 27軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料以x-±s表示。各組間比較采用單因素ANOVA，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。以Plt;0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)" 果

2.1 各組細胞的細胞活力比較

CCK-8實驗檢測結(jié)果示，對照組、OGD/R組及OGD/R+4-HMA組細胞的細胞活力為（100.00±9.81）%、（40.68±3.82）%以及（59.98±4.53）%。各組比較差異具有顯著性（F=104.60，Plt;0.05）；其中OGD/R組相較于對照組，細胞活力顯著性下降（tLSD=12.60，Plt;0.05），OGD/R+4-HMA組相較于OGD/R組，細胞活力明顯升高（tLSD=7.28，Plt;0.05）。

2.2 各組細胞中Akt的磷酸化水平比較

Western blot實驗結(jié)果顯示，三組細胞當中p-Akt/Akt比值、p-Akt的相對表達量比較差異有顯著性（F=8.87、10.49，Plt;0.05），Akt相對表達量比較差異無顯著性（Pgt;0.05）。其中，OGD/R組和OGD/R+4-HMA組分別與對照組比較，細胞中p-Akt相對表達量、p-Akt/Akt比值顯著增高（tLSD=3.02～3.14，Plt;0.05）；OGD/R組與OGD/R+4-HMA組細胞中p-Akt/Akt比值、p-Akt相對表達量比較差異有顯著性（tLSD=4.90、4.25，Plt;0.05）。見表1、圖1。

2.3 各組小鼠的腦梗死體積百分比及mNSS分值比較

Sham組、MCAO/R組及MCAO/R+4-HMA組小鼠的腦梗死體積百分比分別為0、（30.10±4.91）%、（17.20±5.20）%，各組間比較差異有顯著性（F=108.00，Plt;0.05）；其中與Sham組相比，MCAO/R組小鼠梗死體積百分比顯著升高（tLSD=12.19，Plt;0.05）；與MCAO/R組相比，MCAO/R+4-HMA組小鼠腦梗死體積百分比顯著降低（tLSD=5.41，Plt;0.05）。見圖2。Sham組、MCAO/R組、MCAO/R+4-HMA組小鼠mNSS分值分別為0、（4.60±0.97）、（3.20±0.92）分，各組比較差異有顯著性（F=7.20，Plt;0.05）。其中與Sham組相比，MCAO/R組小鼠mNSS分值顯著增高（Plt;0.05）；與MCAO/R組相比，MCAO/R+4-HMA組小鼠mNSS分值顯著降低（tLSD=3.32，Plt;0.05）。

3 討" 論

腦I/R損傷涉及機體內(nèi)一系列復(fù)雜的病理生理改變，如細胞凋亡、自由基過量產(chǎn)生、能量代謝障礙和炎癥反應(yīng)等，這些機制相互作用，加劇了腦組織損傷程度［13-14］。其中，過量自由基在腦I/R損傷過程中起重要作用。研究認為，抗氧化藥物治療是緩解I/R損傷的一種有效策略。谷胱甘肽、CoQ等抗氧化藥物能夠有效清除體內(nèi)過量自由基，減輕細胞損傷［15-17］。4-HMA是一種生活中常見的芳香類化合物，也是CoQ頭部基團合成過程中重要的前體物質(zhì)［18］。但4-HMA在缺血再灌注損傷中的作用目前尚不清楚。

首先，本研究進行了體外細胞實驗，CCK-8實驗結(jié)果顯示，OGD/R+4-HMA組神經(jīng)元的細胞活力顯著高于OGD/R組，提示4-HMA干預(yù)能夠顯著提高經(jīng)OGD/R預(yù)處理的原代神經(jīng)元細胞活力，減輕缺氧和低營養(yǎng)狀態(tài)下神經(jīng)元細胞的損傷［19］。

4-HMA是CoQ合成過程中限速底物的重要組成部分，能夠顯著影響CoQ的合成進程［20］。CoQ被證實具有顯著抗炎和抗氧化作用，其機制是通過增加細胞生存必需的激酶p-Akt表達水平來實現(xiàn)上述作用［21-22］。本研究中復(fù)氧6 h后與對照組相比，OGD/R組、OGD/R+4-HMA組細胞中p-Akt相對表達量、p-Akt/Akt比值顯著增高，Akt相對表達量差異無顯著性，提示4-HMA對OGD/R神經(jīng)元細胞損傷的保護作用與細胞內(nèi)p-Akt水平有關(guān)，并由此進一步推測4-HMA干預(yù)可能能夠促進CoQ的合成，增加CoQ的細胞內(nèi)含量，進而促進Akt的磷酸化進程，提高細胞內(nèi)p-Akt水平，發(fā)揮其細胞保護作用。

隨后本研究又進行了動物研究，探討4-HMA對小鼠腦組織的保護作用。在動物MCAO/R模型中，腦梗死體積百分比與mNSS均為評估腦損傷程度的常用指標。本研究結(jié)果顯示，與對照組相比較，4-HMA能夠顯著降低MCAO/R+4-HMA組小鼠腦梗死體積百分比和mNSS分值，提示腹腔注射4-HMA能夠減輕小鼠腦I/R損傷，4-HMA干預(yù)對MCAO/R模型小鼠的腦組織具有保護作用。既往研究發(fā)現(xiàn)，外源添加4-HMA能夠促進釀酒酵母氧化呼吸進程并增加細胞內(nèi)CoQ的含量，4-HMA對線粒體呼吸鏈、CoQ的合成以及細胞生長都具有重要作用［20，23］。通過外源補充4-HMA，促進CoQ的合成進程，增加其體內(nèi)含量，能夠有效地對抗過氧化物過量產(chǎn)生引起的各種疾病，對疾病的發(fā)生起到一定的預(yù)防作用［24］。

綜上所述，4-HMA能夠減輕OGD/R模型致神經(jīng)元細胞的損傷，降低MCAO/R小鼠的腦梗死體積百分比，其作用機制可能與提高腦神經(jīng)元細胞中p-Akt水平有關(guān)。后續(xù)應(yīng)進一步探討4-HMA對于I/R損傷腦神經(jīng)元的保護作用，開發(fā)其應(yīng)用潛力。

倫理批準和動物權(quán)利聲明：本研究涉及的所有動物實驗均已通過青島大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會的審核批準（文件號QYFYWZLL-28579）。所有實驗過程均遵照《實驗動物管理條例》的規(guī)定進行。

作者聲明：徐銳、劉文豪參與了研究設(shè)計；劉文豪、趙志遠、孫曉娜、王曉榕參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發(fā)表該論文，且均聲明不存在利益沖突。

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（本文編輯 耿波）