?“紅陽”獼猴桃根際土壤細菌的分離與鑒定

引用格式：瞿昕怡，彭清忠，向小奇，等. “紅陽”獼猴桃根際土壤細菌的分離與鑒定[J]. 湖南農(nóng)業(yè)科學，2024（6）：5-9.

DOI：10.16498/j.cnki.hnnykx.2024.006.002

收稿日期：2023-12-28

基金項目：湖南省重點研發(fā)計劃（2022NK2055）；湖南省大學生創(chuàng)新訓練計劃項目（S202310531067）

作者簡介：瞿昕怡（2002—），女，湖南株洲市人，本科生，研究方向為微生物生態(tài)學。

通信作者：易浪波

摘要：為探明健康與感病“紅陽”獼猴桃根際土壤的細菌種群差異，從湘西州保靖縣獼猴桃種植區(qū)采集健康與感病2種根際土壤樣品，通過純培養(yǎng)法分離細菌，基于細菌菌落形態(tài)特征和16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析進行種屬鑒定。從2種根際土壤樣品中共分離獲得30株細菌，經(jīng)鑒定分屬于鏈霉菌屬、紅球菌屬、芽孢桿菌屬、北里孢菌屬和節(jié)桿菌屬5個屬；健康獼猴桃根際土壤中優(yōu)勢菌群為芽孢桿菌屬和鏈霉菌屬；感病獼猴桃根際土壤中主要是芽孢桿菌屬細菌，且沒有分離到北里孢菌屬細菌。這表明健康與感病“紅陽”獼猴桃根際土壤中細菌在種屬水平存在差異，推測鏈霉菌屬細菌中可能存在拮抗?jié)儾〉木辍?/p>

關(guān)鍵詞：獼猴桃；根際土壤；可培養(yǎng)細菌；分離；鑒定

中圖分類號：S436.634 文獻標識碼：A 文章編號：1006-060X（2024）06-0005-05

Isolation and Identification of Bacteria from Rhizosphere Soil of the Kiwifruit Variety 'Hongyang'

QU Xin-yi，PENG Qing-zhong，XIANG Xiao-qi，YI Lang-bo

（College of Biology and Environmental Sciences， Jishou University， Jishou 416000， PRC）

Abstract： This study aims to reveal the differences of rhizosphere soil microorganisms between the healthy and diseased plants of the kiwifruit variety 'Hongyang'. Rhizosphere soil samples of the healthy and diseased plants were collected from the kiwifruit planting area of Baojing County， Xiangxi Prefecture， and bacteria were isolated by the pure culture method. The isolates were identified by morphological observation of colonies and phylogenetic analysis based on 16S rRNA gene sequences. A total of 30 bacterial strains were isolated from two kinds of soil samples， and they were identified as Streptomyces， Rhodococcus， Bacillus， Kitasatospora， and Arthrobacter. Bacillus and Streptomyces were the dominant bacteria in the rhizosphere soil of healthy kiwifruit plants. Bacillus was dominant and Kitasatospora was not discovered in the rhizosphere soil of diseased kiwifruit plants. The results demonstrated differences of bacteria genera in the rhizosphere soil between healthy and diseased plants of the kiwifruit variety 'Hongyang'， which indicated that there might be antagonistic strains of Streptomyces against kiwifruit canker.

Key words： kiwifruit; rhizosphere soil; culturable bacteria; isolation; identification

獼猴桃細菌性潰瘍病是嚴重威脅獼猴桃生產(chǎn)和發(fā)展的典型病害[1]，其病原菌為丁香假單胞桿菌獼猴桃致病變種（Pseudomonas syringae pv. actinidiae，Psa）[2-3]。獼猴桃潰瘍病的發(fā)病特點是蔓延速度快，嚴重時能覆蓋整個種植園區(qū)，造成巨大的經(jīng)濟損失，極大地限制了獼猴桃產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。目前針對潰瘍病這一毀滅性的病害，主要防治措施有農(nóng)業(yè)防治[4]、化學防治和生物防治等。在化學防治過程中，長期使用同類農(nóng)藥會使病菌產(chǎn)生一定抗性，導致藥效下降，且化學藥劑的長期使用容易造成重金屬污染和抗生素殘留，危害生態(tài)環(huán)境和人類健康。生物防治是將一株或幾株特殊菌株制成單菌劑或者混合菌劑，用于降低植物發(fā)病率，控制病害程度[5]。生物防治具有環(huán)境友好、人畜安全、可持續(xù)性、特異性強等特點，符合人們對綠色防治的需求，因而受到眾多學者青睞[6]。

根際是植物、土壤、微生物3者相互作用的場所，亦是各種有益或有害物質(zhì)進入根系參與物質(zhì)循壞的門戶[7]。根際微生物是土壤的重要組分，其種類豐富，可分泌大量代謝物質(zhì)，影響土壤理化性質(zhì)的同時也影響植物的生長發(fā)育、抗逆和抗病性等[8]。因此，根際土壤細菌種群結(jié)構(gòu)和多樣性是獼猴桃防病治病研究的重點領(lǐng)域之一。

湘西土家族苗族自治州（以下簡稱“湘西州”）由于其得天獨厚的地理位置和氣候條件，是我國獼猴桃的重點產(chǎn)區(qū)之一，被稱為中南地區(qū)“獼猴桃之鄉(xiāng)”。2021年，湘西地區(qū)獼猴桃的種植面積約為1.33萬hm2，獼猴桃產(chǎn)業(yè)成為推動湘西地區(qū)經(jīng)濟發(fā)展的支柱產(chǎn)業(yè)之一[9]。保靖縣是湘西州主要的獼猴桃種植基地之一，近年該縣的“紅陽”獼猴桃園大規(guī)模暴發(fā)潰瘍病，嚴重影響當?shù)孬J猴桃的產(chǎn)量與質(zhì)量。鑒于此，該研究對健康和感病“紅陽”獼猴桃根際土壤細菌進行分離，基于細菌形態(tài)特征和分子生物學方法對菌株進行鑒定，并分析健康和感病獼猴桃根際土壤的微生物多樣性，探明“紅陽”獼猴桃根際土壤細菌的種群差異，為獼猴桃潰瘍病生物防治菌劑的研發(fā)提供菌種資源。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

在湘西州保靖縣獼猴桃基地（110°4′E，28°54′N）

采集獼猴桃根際土壤樣品，用五點取樣法確定采樣植株，采集健康和感病獼猴桃植株根際土壤樣品各5份。將5份健康植株的土樣充分混合，記為A組；將5份感病植株的土樣充分混合，記為B組；土樣采集后置于4℃冰箱中保藏備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基的配制 （1）LB液體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，NaCl 10 g，酵母粉5 g，蒸餾水1 000 mL，pH值7.0。（2）LB固體培養(yǎng)基：在LB液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，加入瓊脂10～15 g。（3）高氏一號培養(yǎng)基：可溶性淀粉20 g，NaCl 0.5 g，KNO3 1 g，K2HPO4 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，水1 000 mL，pH值7.0。

1.2.2 菌株分離與純化 稱取A、B 2組土壤樣品各5 g，分別加到裝有50 mL無菌水的三角瓶中，置于25℃、轉(zhuǎn)速150 r/min條件下振蕩30 min。每組設(shè)置3個平行樣，稀釋100倍后吸取樣品溶液各200 μL涂布于不同培養(yǎng)基上，25℃恒溫培養(yǎng)2～4 d。記錄各培養(yǎng)基上細菌群落生長數(shù)量，并挑取單菌落接種至LB固體培養(yǎng)基，通過平板劃線法純化3代。將純化后的菌株接種至LB液體培養(yǎng)基中，在25℃、轉(zhuǎn)速180 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)1～2 d，待培養(yǎng)液混濁或出現(xiàn)明顯絮狀物后，吸取培養(yǎng)液0.5 mL加入1.5 mL離心管中，再加入0.5 mL 40%甘油，混勻后用封口膜密封，置于-80℃冰箱中保存。

1.2.3 菌株DNA的提取 取出保存于-80℃冰箱中的A、B組菌株，于LB固體培養(yǎng)基中通過平板劃線法純化培養(yǎng)，挑取單菌落于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)1～2 d，得到菌懸液。采用細菌基因組DNA快速提取試劑盒，按照操作手冊進行菌株DNA的提取，提取

的DNA立即進行下一步試驗或于-20℃冰箱中保存。

1.2.4 菌株的16S rRNA基因擴增測序及系統(tǒng)發(fā)育分析 以A、B組菌株的基因組DNA為模板，分別配置50 μL PCR反應體系，其中2×Taq PCR Mix 25 μL，

細菌通用引物PA（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG

-3'）和PB（5'-TTAAGGTGATCCAGCCGCA-3'）各1

μL，基因組DNA模板2 μL，Taq酶1 μL，再加雙蒸水補齊至50 μL。充分混勻放入PCR儀，進行16S rRNA基因片段擴增。PCR程序為：95℃預變性2.5 min；95℃變性15 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。運用NCBI中Blast工具進行同源序列比對，得到與菌株相似度高的菌屬，并從中選出相似度最高的9株，下載其16S rRNA序列，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，再根據(jù)同源性大小和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系進行菌株鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 細菌的分離與形態(tài)特征記錄

通過純培養(yǎng)法，從A、B組中分離出多株細菌，根據(jù)菌落形態(tài)和細胞顯微形態(tài)特征去冗余，最終從根際土壤A、B組中各選取15株代表性菌株，分別記錄為a1～a15和b1～b15。將分離菌株接種于LB固體培養(yǎng)基中劃線培養(yǎng)長出單菌落，記錄菌株的形態(tài)特征（圖1和表1）。

2.2 細菌類群鑒定

分別提取分離A、B組菌株的基因組DNA，經(jīng)PCR擴增獲得序列長度約1.5 kb的16S rRNA基因片段，電泳圖見圖2、圖3。

將測定序列提交至GenBank進行Blast同源性比對，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹確定菌株的分類學地位。結(jié)果表明，30株細菌主要分為5大類，其16S rRNA基因序列分別與鏈霉菌屬（Streptomyces）、紅球菌屬（Rhodococcus）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、北里孢菌屬（Kitasatospora）和節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）的同源性高達99%以上，種屬鑒定的可信度較高。由表2可知，A組有6株屬于芽孢桿菌屬，5株屬于鏈霉菌屬，2株屬于紅球菌屬，1株屬于北里孢菌屬，1株屬于節(jié)桿菌屬；B組有10株屬于芽孢桿菌屬，2株屬于紅球菌屬，2株屬于節(jié)桿菌屬，1株屬于鏈霉菌屬。

2.3 菌株的多樣性對比

由表2可知，在健康與感病獼猴桃根際土壤分離純化得到的30株菌株中，芽孢桿菌屬、鏈霉菌屬、紅球菌屬、節(jié)桿菌屬和北里孢菌屬分別占比53.34%、20.00%、13.33%、10.00%和3.33%，其中芽孢桿菌屬為優(yōu)勢菌屬。在健康獼猴桃根際土壤分離純化得到的15株菌株中，5個屬的占比從高至低依次為芽孢桿菌屬（40.00%）、鏈霉菌屬（33.33%）、紅球菌屬（13.33%）、北里孢菌屬（6.67%）和節(jié)桿菌屬（6.67%），其中芽孢桿菌和鏈霉菌為優(yōu)勢菌群。在感病獼猴桃根際土壤分離純化得到的15株菌株中，4個屬的占比從高至低依次為芽孢桿菌屬（66.67%）、紅球菌屬（13.33%）、節(jié)桿菌屬（13.33%）、鏈霉菌屬（6.67%），其中芽孢桿菌為優(yōu)勢菌群。

由PAST 4.03軟件進行數(shù)據(jù)處理，利用多樣性指數(shù)分析比較健康與感病獼猴桃根際細菌多樣性的差異。在α多樣性分析中，Chao1指數(shù)反映群落的豐富度，其指數(shù)越大，說明該群落豐富度越高；香農(nóng)指數(shù)和辛普森指數(shù)反映群落多樣性，其指數(shù)越大，說明該群落多樣性越高。由表3可知，健康獼猴桃根際土壤中細菌的多樣性高于感病獼猴桃根際土壤。

3 討論與結(jié)論

根際的范圍一般指包圍根表面幾毫米范圍內(nèi)的區(qū)域，這一區(qū)域同時受到根系、土壤、微生物等的共同作用[10]。在根際微生物中，細菌最常見。近年來，利用土壤中的有益細菌防治植物病害成為國內(nèi)外研究的熱點[11]。盛存波等[12]從陜西省獼猴桃果園根際土壤中分離獲得對獼猴桃潰瘍病菌有抑制作用的芽孢桿菌B56-3；邵寶林等[13]從四川省獼猴桃根際土壤中篩選出對獼猴桃潰瘍病菌有拮抗效果的芽孢桿菌B2；張鐘月[5]從健康與感病獼猴桃根際土壤分離出寡養(yǎng)單胞菌屬等27個菌屬。

該研究在湘西州保靖縣的獼猴桃種植區(qū)采集健康和感病獼猴桃植株根際土壤，從中篩選出菌落形態(tài)特征差異較大的30株菌株，經(jīng)測序和系統(tǒng)進化分析，初步鑒定30株菌株分別屬于芽孢桿菌屬、鏈霉菌屬、紅球菌屬、節(jié)桿菌屬和北里孢菌屬5個屬，表明獼猴根際土壤細菌具有豐富的物種多樣性，這些菌種極大地豐富了獼猴桃潰瘍病生物防治的微生物種質(zhì)資源。

此外，該研究篩選的30株菌株中芽孢桿菌屬有16株，占比達53.34%，可推斷其為獼猴桃植株根際土壤的優(yōu)勢菌屬。比較健康和感病獼猴桃根際土壤細菌菌群發(fā)現(xiàn)：鏈霉菌屬菌株在健康植株根際土壤占比（33.33%）明顯高于在感病植株根際土壤中的占比（6.67%），且在健康獼猴桃根際土壤中屬于優(yōu)勢菌群之一，由此推測鏈霉菌屬在獼猴桃根際土壤的分布差異可能是影響獼猴桃植株健康或感病的原因之一。王芳等[15]發(fā)現(xiàn)，鏈霉菌SY-L12對獼猴桃潰瘍病菌有拮抗作用，因此可進一步研究健康獼猴桃根際土壤分離出的鏈霉菌中是否存在拮抗?jié)儾〉木?，以期為獼猴桃細菌性潰瘍病的生物防治提供菌種資源。

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（責任編輯：王婷）