?鎘脅迫下鄰苯二甲酸酯降解菌的篩選及其應(yīng)用研究?

引用格式：周冰玉，周宇，王春平，等. 鎘脅迫下鄰苯二甲酸酯降解菌的篩選及其應(yīng)用研究[J]. 湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2024（6）：1-4，9.

DOI：10.16498/j.cnki.hnnykx.2024.006.001

收稿日期：2024-02-01

基金項(xiàng)目：湖南省自然科學(xué)基金（2020JJ5321；2021JJ30412）

作者簡介：周冰玉（1989—），女，湖南長沙市人，工程師，主要從事農(nóng)業(yè)環(huán)境資源基礎(chǔ)與應(yīng)用研究。

通信作者：劉標(biāo)

摘要：為豐富鎘脅迫下能高效降解鄰苯二甲酸酯的微生物資源，該研究通過含有鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（DEHP）和鎘的無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基從實(shí)驗(yàn)室保藏菌株中篩選到1株DEHP高效降解菌B-7，并對菌株特性進(jìn)行了研究。菌株B-7為解淀粉芽孢桿菌，生物安全性高，對DEHP的降解性能優(yōu)良，發(fā)揮降解作用的最適溫度為25～40℃、最適pH值為6～8。菌株B-7在DEHP初始濃度為400 mg/L、鎘含量為10 mmol/L的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)4 d，其對DEHP的降解率高達(dá)93.1%，且該菌株對DMP、DEP、DBP均具有較強(qiáng)的降解能力。在鎘和DEHP復(fù)合污染的土壤中，B-7與土壤土著微生物的協(xié)同降解顯著提高了DEHP的降解率，表明該菌株在鎘和鄰苯二甲酸酯復(fù)合污染土壤的微生物修復(fù)領(lǐng)域具有潛在應(yīng)用價(jià)值。

關(guān)鍵詞：鄰苯二甲酸酯；鎘；解淀粉芽孢桿菌；土壤生物修復(fù)

中圖分類號(hào)：Q939.96; X172 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1006-060X（2024）06-0001-04

Screening and Application of a Phthalate Ester-Degrading Strain under Cadmium Stress

ZHOU Bing-yu，ZHOU Yu，WANG Chun-ping，LIU Fen，LIU Biao

（Hunan Institute of Microbiology， Changsha 410009， PRC）

Abstract： To enrich the phthalate ester （PAE）-degrading microbial resources under cadmium stress， we screened out an efficient di-（2-ethylhexyl） phthalate （DEHP）-degrading strain B-7 by using the inorganic salt liquid medium containing DEHP and cadmium from the strains preserved in our laboratory and studied the characteristics of the strain. Strain B-7 was Bacillus amyloliquefaciens with high biosafety and strong ability of degrading DEHP. The strain exerted the optimal degradation effect at 25-40 ℃ and pH 6-8. When cultured in the inorganic salt medium with an initial DEHP concentration of 400 mg/L and cadmium concentration of 10 mmol/L for 4 days， the strain showcased the degradation rate of 93.1% for DEHP. Moreover， the strain demonstrated strong degradation effects on dimethyl phthalate （DMP）， diethylphthalate （DEP）， and dibutyl phthalate （DBP）. In the soil contaminated with both cadmium and DEHP， strain B-7 coordinated with the indigenous microorganisms in soil to increase the degradation rate of DEHP. The results suggested that strain B-7 demonstrated a promising application prospect in the bioremediation of cadmium and PAE-contaminated soil.

Key words： phthalate esters; cadmium; Bacillus amyloliquefaciens; soil bioremediation

鄰苯二甲酸酯（Phthalic acid esters，PAEs）作為增塑劑被廣泛使用。在塑料薄膜制品中，PAEs主要以游離態(tài)存在，它們依靠氫鍵和范德華力而不是共價(jià)鍵結(jié)合，因此不能穩(wěn)定存在于塑料中。隨著時(shí)間的推移，PAEs會(huì)逐漸從塑料薄膜中釋放出來造成環(huán)境污染[1-2]。PAEs是一類具有內(nèi)分泌干擾特性的雌激素，即使在低濃度下也會(huì)干擾動(dòng)物的內(nèi)分泌系統(tǒng)，且伴有致畸、致突變和致癌的風(fēng)險(xiǎn)[3]。隨著大棚蔬菜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，地膜的投入量大幅度增加，導(dǎo)致農(nóng)田土壤中PAEs含量不斷上升。這些有機(jī)污染物不僅影響土壤質(zhì)量，還可能通過食物鏈進(jìn)入人體，最終危害人類的健康[4-5]。近年來，人們對土壤質(zhì)量和農(nóng)產(chǎn)品安全的關(guān)注度不斷提高，如何降解農(nóng)田土壤的PAEs成為亟待解決的問題[6]。

在土壤中，PAEs的水解和光解速率非常緩慢，主要依靠微生物降解[7]。部分土壤中缺少降解PAEs的高效土著微生物，導(dǎo)致這些土壤中殘留的PAEs濃度較高。通過添加外源微生物菌劑，可以提高土壤中PAEs的降解率，且該措施具有綠色高效、成本低、操作簡單等優(yōu)點(diǎn)，成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)[8-13]。目前報(bào)道的降解菌株大多數(shù)是針對單一鄰苯二甲酸酯污染進(jìn)行篩選的，而實(shí)際土壤中往往存在PAEs和重金屬的復(fù)合污染[14]。陳欣瑤等[15]研究發(fā)現(xiàn)土壤微生物量和微生物菌落數(shù)隨著鎘含量的增加而降低，因此已篩選菌株在復(fù)合污染土壤修復(fù)中的應(yīng)用效果有待進(jìn)一步評價(jià)。

該研究以相對難降解的鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（DEHP）為對象，以實(shí)驗(yàn)室前期保存的用于生物有機(jī)肥添加的生物安全菌株為菌種庫，從中篩選能夠在鎘脅迫下高效降解DEHP的菌株，并對其應(yīng)用效果進(jìn)行分析，以期豐富鄰苯二甲酸酯和鎘復(fù)合污染土壤修復(fù)的微生物資源。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與培養(yǎng)基

主要試劑為鄰苯二甲酸二甲酯（DMP）、鄰苯二甲酸二乙酯（DEP）、鄰苯二甲酸二丁酯（DBP）、鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（DEHP），均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司（分析純，＞99%）。

種子培養(yǎng)基為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3.0 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，蒸餾水1 000 mL，pH值7.4。無機(jī)鹽（MSM）培養(yǎng)基：KH2PO4 4.5 g，K2HPO4 5.8 g，（NH4）2SO4 2.0 g，NaCl 0.75 g，CaCl2 0.02 g，MgCl2 0.16 g，F(xiàn)eCl3 0.002 g，pH值7.0；固體培養(yǎng)基按1.5%～2%的比例添加瓊脂粉。含PAEs的MSM培養(yǎng)基：分別用甲醇配置4種PAEs母液（濃度為10 g/L），0.22 μm無菌濾膜過濾，再按比例添加到MSM培養(yǎng)基中，配制成以PAEs為唯一碳源的培養(yǎng)基；往上述培養(yǎng)基中加入一定量的CdCl2配置成含鎘和PAEs的無機(jī)鹽培養(yǎng)基。

1.2 鎘脅迫下鄰苯二甲酸酯降解菌株的篩選

1.2.1 降解菌株的初篩 待篩選菌種為11株實(shí)驗(yàn)室分離保存的、可用于生物有機(jī)肥添加的生物安全菌株，編號(hào)分別為X-4、X-6、X-7、X-8、B-3、B-6、B-7、B-8、B-9、LH-1和LH-2。利用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基制備11株待篩菌株的種子液，按1%接種量分別將各菌株種子液接種到含有DEHP和鎘的MSM液體培養(yǎng)基中（DEHP終濃度為400 mg/L、鎘含量為10 mmol/L），在30℃、150 r/min條件下遮光振蕩培養(yǎng)，第4天時(shí)取樣測定各培養(yǎng)液的OD600，以此判斷菌株在鎘脅迫下利用碳源PAEs生長繁殖的能力。

1.2.2 降解菌株的復(fù)篩 將初篩獲得的菌株接種到牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，培養(yǎng)16 h至對數(shù)生長期，收集菌液離心、棄上清，加入無菌水重懸菌體，作為種子液備用。按1%（V/V）的接種量將種子液轉(zhuǎn)接到DEHP初始濃度為400 mg/L、鎘含量為10 mmol/L的MSM培養(yǎng)基中，30℃、150 r/min條件下遮光振蕩培養(yǎng)，每隔1 d取樣測定培養(yǎng)液中剩余的DEHP含量，連續(xù)測定7 d。

1.3 DEHP含量的測定

對培養(yǎng)液中剩余的DEHP進(jìn)行萃取復(fù)溶，利用高效液相色譜法（HPLC）測定DEHP含量[16]。具體操作方法為：在培養(yǎng)液中加入50 mL正己烷萃取，收集有機(jī)相，重復(fù)2次；將2次萃取液混合，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上將正己烷蒸干，加入10 mL甲醇溶解萃取物，過0.22 μm有機(jī)相過濾器，濾液用HPLC色譜儀測定DEHP含量。HPLC條件：色譜柱為Agilent Eclipse XDB-18（200 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為甲醇 ∶ 水=95∶5；進(jìn)樣量20 μL，柱溫35℃，流速1 mL/min，檢測波長為228 nm。

1.4 不同溫度、pH值對菌株降解DEHP的影響

1.4.1 溫度的影響 按1%的接種量將復(fù)篩菌株種子液轉(zhuǎn)接至DEHP初始濃度為400 mg/L、鎘含量為10 mmol/L的MSM培養(yǎng)基中，分別設(shè)定培養(yǎng)溫度為15、20、25、30、35、40℃，其他條件相同，培養(yǎng)4 d后測定培養(yǎng)液的DEHP含量。以相同溫度但未添加外源菌劑的處理作為對照，按照公式（1）計(jì)算各溫度下的降解率。

1.4.2 pH值的影響 分別用HCl和NaOH將DEHP初始濃度為400 mg/L、鎘含量為10 mmol/L的MSM液體培養(yǎng)基的pH值調(diào)節(jié)為4、5、6、7、8、9，再接種1%菌株種子液，30℃、150 r/min條件下遮光培養(yǎng)4 d后測定DEHP含量，以相同初始pH值但未添加外源菌劑的處理作為對照，按照公式（1）計(jì)算各pH值下的降解率。

1.5 菌株對不同類型PAEs的降解能力比較

按1%的接種量將復(fù)篩菌株的種子液轉(zhuǎn)接到含不同類型PAEs（DMP、DEP、DBP、DEHP）的MSM培養(yǎng)基中（初始濃度均為400 mg/L），30℃、150 r/min條件下遮光培養(yǎng)4 d。使用紫外分光光度計(jì)測定菌株生長量，采用高效液相色譜法檢測各類型培養(yǎng)液中PAEs的殘留含量，根據(jù)公式（2）計(jì)算降解率。

（2）

1.6 鎘脅迫下菌株對DEHP污染土壤的修復(fù)能力

模擬試驗(yàn)所用土壤取自湖南益陽某辣椒種植農(nóng)田（未檢出DEHP，鎘含量為0.79 mg/kg）。菌株通過牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基擴(kuò)繁后，將菌液離心后棄上清液，使用無菌水重懸菌體，調(diào)節(jié)菌懸液濃度至108 CFU/mL備用。為了探明鎘脅迫下單一菌株B-7對DEHP污染土壤的修復(fù)能力以及菌株B-7與土壤土著微生物協(xié)同降解DEHP的效果，試驗(yàn)設(shè)置土壤滅菌組和未滅菌組。分別取500 g過20目篩后土壤及滅菌土壤（121℃滅菌40 min）裝入塑料盆中，添加DEHP溶液調(diào)節(jié)終濃度約為100 mg/kg，按1%量（V/W，

mL/g）接種B-7菌懸液到土壤中，將塑料盆放置于防雨水的塑料大棚中，每隔5 d取樣測定DEHP含量，總周期30 d。滅菌組與未滅菌組均以接種相同體積蒸餾水為對照，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。土壤中DEHP的萃取檢測方法參照謝婧[17]研究的步驟進(jìn)行。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

使用Excel 2007軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和繪圖，使用SPSS 25軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 鎘脅迫下鄰苯二甲酸降解菌株的篩選

在初篩試驗(yàn)中，經(jīng)過4 d培養(yǎng)后，菌株B-7的培養(yǎng)液OD600為1.028，其他10株細(xì)菌均未見明顯生長，OD600為0，即11株細(xì)菌中只有B-7能在鎘脅迫下以DEHP作為唯一碳源進(jìn)行生長繁殖。菌株B-7為實(shí)驗(yàn)室前期分離獲得的解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens），在微生物肥料生物安全通用技術(shù)準(zhǔn)則（NY/T 1109—2017）中，解淀粉芽孢桿菌為第一級(jí)免做毒理學(xué)試驗(yàn)的菌種，生物安全性高。菌株B-7在以DEHP為唯一碳源的培養(yǎng)基中能夠迅速生長，生長遲緩期很短。由圖1可知，接種1 d后對DEHP初始濃度為400 mg/L的培養(yǎng)液進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)DEHP降解率達(dá)到50.1%，此后繼續(xù)保持較強(qiáng)的降解速率，4 d后DEHP降解率達(dá)到93.1%。隨著培養(yǎng)基中DEHP的消耗及次級(jí)代謝產(chǎn)物的積累，菌株B-7逐漸進(jìn)入衰亡期，DEHP含量無顯著變化。在其他高效降解菌株（如E1、ASW6D）篩選過程中均經(jīng)歷富集馴化過程，而菌株B-7未經(jīng)馴化對DEHP的降解率就達(dá)90%以上，說明菌株B-7具有優(yōu)良的DEHP降解性能。

2.2 不同溫度、pH值對B-7降解DEHP的影響

為了探究菌株B-7適應(yīng)實(shí)際農(nóng)業(yè)生產(chǎn)環(huán)境的性能，該研究分析了不同溫度條件下菌株B-7對DEHP降解能力的差異。如圖2（a）所示，在15～25℃范圍內(nèi)，B-7對DEHP的降解率與溫度呈正相關(guān)關(guān)系，表明低溫對B-7的降解性能有顯著影響；在25～40℃范圍內(nèi)，其降解率均保持在較高的水平，表明該菌株能在較寬范圍的環(huán)境溫度下發(fā)揮作用。

不同pH值條件下菌株B-7對DEHP的降解率有顯著差異，結(jié)合湖南地區(qū)土壤pH值的實(shí)際情況，分析pH值4～9時(shí)B-7對DEHP降解情況。圖2（b）顯示，菌株降解DEHP的最佳pH值為6～8，此時(shí)降解率均達(dá)86%以上；在pH值為5或9時(shí)，降解率顯著降低，但仍大于60%。這表明，pH值對菌株B-7降解性能有較大影響，但較寬pH范圍下B-7均能高效降解DEHP。

2.3 菌株B-7對不同類型PAEs降解能力的分析

表1顯示，菌株B-7在4種PAEs底物的培養(yǎng)基中均能較好地生長，培養(yǎng)4 d后DMP、DEP、DBP和DEHP的降解率均大于85%，統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，菌株B-7對4種PAEs的降解能力并無顯著性差異。

2.4 鎘脅迫下B-7對DEHP污染土壤的修復(fù)效果

由圖3可知，在對照組中，經(jīng)過滅菌處理后，土壤中的DEHP降解速度非常緩慢，30 d時(shí)降解率僅為12.4%，而未滅菌土壤中DEHP降解率為53.3%，表明土壤微生物在DEHP的降解中起主要作用；接種B-7的滅菌土壤組降解率為45.5%，而未滅菌土壤組降解率達(dá)到85.7%，說明在菌株B-7與土壤土著微生物協(xié)助配合下，土壤中的DEHP降解率得到顯著提高。在滅菌和未滅菌2種類型的土壤中，B-7接種組的降解率均顯著高于相對應(yīng)的未接種組，表明菌株B-7顯著提高了土壤中DEHP的降解率。

3 結(jié)論與討論

該研究從實(shí)驗(yàn)室保存菌株中篩選到1株在鎘脅迫下能高效降解鄰苯二甲酸酯的解淀粉芽孢桿菌B-7。在DEHP初始濃度為400 mg/L的MSM培養(yǎng)基中培養(yǎng)4 d后，菌株B-7對DEHP的降解率可達(dá)93.1%，B-7在以DEHP為唯一碳源的培養(yǎng)基中能夠迅速生長，生長遲緩期很短，這一結(jié)果與紫色桿菌屬菌株E1[14]、分枝桿菌ASW6D[18]降解DEHP的研究結(jié)果類似。微生物的生長繁殖主要受環(huán)境溫度、pH值的影響，其分泌的相關(guān)功能酶的活性也與這2個(gè)環(huán)境條件密切相關(guān)。菌株B-7發(fā)揮作用的最適溫度為25～40℃，這與楊婧等[18]的研究中菌株ASW6D最適溫度范圍類似；菌株B-7的最適pH值為6～8，在這個(gè)范圍外，其對DEHP的降解能力大大降低，這與Wu等[19]研究中菌株JDC-41降解DBP的特性類似。此外，該研究發(fā)現(xiàn)菌株B-7對DMP、DEP、DBP和DEHP多種類型的PAEs均有較強(qiáng)的降解能力且對4種PAEs的降解能力無顯著性差異，這與已報(bào)道的菌株ASW6D[18]和B3[20]降解DMP、DEP、DBP比降解DEHP的效果更佳這一結(jié)果不同。根據(jù)調(diào)查，我國部分農(nóng)田土壤為多種PAEs的復(fù)合污染（主要是DBP、DEHP），該菌株能夠降解多種PAEs，進(jìn)一步說明在修復(fù)多種PAEs污染的農(nóng)田土壤上具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。探究鎘脅迫下B-7對DEHP污染土壤的修復(fù)能力，發(fā)現(xiàn)添加菌株B-7可以顯著提高土壤中DEHP的降解率，證明其在鎘和PAEs復(fù)合污染土壤的微生物修復(fù)領(lǐng)域具有潛在應(yīng)用價(jià)值。

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（責(zé)任編輯：王婷）