丹皮酚對(duì)大腦中動(dòng)脈缺血模型小鼠行為功能障礙的改善作用研究

【摘要】 背景 中風(fēng)是嚴(yán)重危害人體健康的心腦血管系統(tǒng)疾病之一，具有高患病率、高致殘率和高致死率的特征。牡丹皮是毛茛科植物牡丹干燥根皮，具有清熱涼血、活血化瘀之功效。丹皮酚是牡丹皮的主要活性成分，已有研究證實(shí)在缺糖缺氧條件下，丹皮酚對(duì)神經(jīng)元有一定保護(hù)作用。目的 觀察丹皮酚對(duì)大腦中動(dòng)脈缺血（MCAO）模型小鼠的干預(yù)效果，探究丹皮酚溶液灌胃在治療中風(fēng)行為功能障礙的神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制。方法 本研究時(shí)間為2019年12月—2021年12月。缺血性中風(fēng)模型的建立與評(píng)價(jià)：將20只SPF級(jí)雄性C57BL/6小鼠，采用隨機(jī)數(shù)字表法分成假手術(shù)組（n=10）、模型組（MCAO組，n=10），采用線栓法制成小鼠MCAO模型，造模24 h后，通過(guò)Longa評(píng)分評(píng)價(jià)各組小鼠神經(jīng)功能受損情況；激光散斑血流成像系統(tǒng)監(jiān)測(cè)各組小鼠在MCAO術(shù)后大腦血流改變狀況；對(duì)MCAO術(shù)后的小鼠進(jìn)行TTC染色，在病理上觀察小鼠大腦的損傷情況。探究丹皮酚對(duì)MCAO小鼠的行為功能保護(hù)作用：將50只SPF級(jí)、雄性C57BL/6小鼠進(jìn)行隨機(jī)分組：假手術(shù)組（n=10）、模型+玉米油組（n=20）、模型+丹皮酚組（n=20）。造模后24 h，驗(yàn)證模型穩(wěn)定后，模型+丹皮酚組用丹皮酚玉米油溶液灌胃，給藥濃度為100 mg·kg-1· d-1，其余組灌服等量玉米油。在造模28 d后，統(tǒng)計(jì)三組小鼠的存活情況，繪制生存曲線；使用Longa評(píng)分判斷小鼠神經(jīng)功能恢復(fù)情況；尼氏染色法檢測(cè)小鼠大腦梗死面積；行為學(xué)測(cè)試小鼠在造模前及造模后7、14、21、28 d 5個(gè)時(shí)間點(diǎn)的運(yùn)動(dòng)感覺(jué)功能改變。探究丹皮酚對(duì)MCAO小鼠行為功能改善的機(jī)制：隨機(jī)將30只SPF級(jí)、雄性C57BL/6小鼠分成假手術(shù)組（n=6）、模型+玉米油組（n=12）、模型+丹皮酚組（n=12）。造模后24 h，驗(yàn)證模型穩(wěn)定后，藥物組用丹皮酚玉米油溶液灌胃，給藥濃度為100 mg·kg-1·d-1，其余組灌服等量玉米油。造模后2 d，用Western blotting法測(cè)定小鼠大腦紋狀體白介素1β（IL-1β）蛋白表達(dá)情況，探究急性期內(nèi)丹皮酚是否能降低大腦炎性反應(yīng)；造模后14 d，采用免疫熒光法檢測(cè)小鼠大腦半暗帶離子鈣結(jié)合銜接分子1（IBA1）、膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）的表達(dá)。結(jié)果 模型+玉米油組小鼠干預(yù)28 d的生存率為66.47%，丹皮酚組小鼠生存率為81.43%。Log-rank檢驗(yàn)結(jié)果顯示，三組小鼠干預(yù)28 d的生存曲線比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=1.436，Plt;0.05）。造模28 d后，模型+丹皮酚組Longa評(píng)分低于模型+玉米油組（Plt;0.05）。三組小鼠造模后14 d腦組織中IBA1、GFAP表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05）；模型+玉米油組、模型+丹皮酚組小鼠造模后14 d腦組織中IBA1、GFAP表達(dá)水平高于假手術(shù)組（Plt;0.05）；模型+丹皮酚組小鼠造模后14 d腦組織中IBA1、GFAP表達(dá)水平低于模型+玉米油組（Plt;0.05）。模型+玉米油組小鼠造模后2 d紋狀體IL-1β蛋白表達(dá)水平高于假手術(shù)組（Plt;0.05）；模型+丹皮酚組小鼠造模后2 d紋狀體IL-1β蛋白表達(dá)水平低于模型+玉米油組（Plt;0.05）。結(jié)論 丹皮酚可控制MCAO模型中小鼠在急性階段的發(fā)癥反應(yīng)，減少了小鼠急性腦梗死面積，延長(zhǎng)了小鼠生存期、改善了其運(yùn)動(dòng)感覺(jué)功能。

【關(guān)鍵詞】 腦缺血；大腦中動(dòng)脈缺血；丹皮酚；離子鈣結(jié)合銜接分子1；膠質(zhì)纖維酸性蛋白；白介素1β；功能障礙

【中圖分類號(hào)】 R 743.31 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】 A DOI：10.12114/j.issn.1007-9572.2022.0346

【引用本文】 陳茜，駱建宇，鄺棗園，等. 丹皮酚對(duì)大腦中動(dòng)脈缺血模型小鼠行為功能障礙的改善作用研究［J］. 中國(guó)全科醫(yī)學(xué)，2023，26（27）：3441-3449. DOI：10.12114/j.issn.1007-9572.2022.0346.［www.chinagp.net］

【Abstract】 Background Stroke is a cardiovascular disease that seriously endangers human health，which is characterized by high prevalence，disability and mortality rates. Peony bark is the dried root bark of peony in the buttercup family，which has the effect of clearing heat and cooling blood，activating blood circulation and resolving blood stasis. Paeonol（PAE） is the main active ingredient of peony bark，has been confirmed to have neuroprotective effect under hypoglycemia and hypoxia conditions. Objective To observe the effect and neurobiological mechanism of gastric administration of paeonol solution on improving behavioral dysfunction caused by middle cerebral artery occlusion （MCAO），a kind of stroke，in a mouse model. Methods The study was conducted from December 2019 to December 2021. Twenty SPF male C57BL/6 mice were randomized into SHAM group （n=10） and model group （MCAO group，n=10）. The MCAO model was formed by intraluminal suture method. After 24 hours of modeling，the neurological function of each group was evaluated by Longa Score. Laser Speckle Contrast Imaging was used to monitor the changes of cerebral blood flow after MCAO. TTC staining was used in the pathological examination of cerebral infarction in MCAO mice. For investigating the protective effect of PAE on behavioural dysfunction of MCAO mice，50 SPF male C57BL/6 mice were randomly grouped into SHAM group （n=10），model+corn oil group （n=20），and model+PAE group （n=20）. After the verification of model stability at 24 hours following the modeling，the model+PAE group received intragastric administration of PAE and corn oil solution in a concentration of 100 mg·kg-1· d-1，and the other two groups were gavaged with equal amounts of corn oil. Then on the 28th day after of modelling，survival curve was plotted to assess the survival status of mice in the three groups；the neurological recovery of mice was determined using the Longa Score；the area of cerebral infarction was examined by Nissl staining. The behavioural changes in motor sensory function were tested at five time points：the day before modeling，and 7，14，21 and 28 days after modelling. For exploring the mechanism of PAE improving behavioural dysfunction in MCAO mice，30 SPF male C57BL/6 mice were randomly divided into SHAM group （n=6），model+corn oil group （n=12） and model+PAE group （n=12）. After verifying the model stability at 24 hours following the modeling，the model+PAE group received intragastric administration of PAE and corn oil solution in a concentration of 100 mg·kg-1· d-1，and the other two groups were gavaged with an equal amount of corn oil. The expression of interleukin 1β（IL-1β） protein in the striatum of mouse brain was measured by Western blotting on the second day after modelling to investigate whether PAE could reduce the inflammatory response in the brain during the acute period. The expression of ionized calcium-binding adapter molecule 1 （IBA1） and glial fibrillary acidic protein （GFAP） in the penumbra was measured by immunofluorescence on the 14th day after modelling. Results The 28-day survival rate was 66.47% for the model+corn oil group，and 81.43% for model+PAE group. Log-rank test showed that the 28-day survival curve significantly differed across SHAM group，model+corn oil group，and model+PAE group（χ2=1.436，Plt;0.05） The Longa Score was lower in model+PAE group than in model+corn oil group on the 28th day after modelling（Plt;0.05）. The differences in the expression levels of IBA1 and GFAP in brain tissues of the three groups were statistically significant （Plt;0.05）. Specifically，the expression levels of IBA1 and GFAP in brain tissues in SHAM group were lower than those of the other two groups （Plt;0.05）. The expression levels of IBA1 and GFAP in brain tissues in model+PAE group were lower than those in model+corn oil group （Plt;0.05）. On the second day after modelling，model+corn oil group had higher expression level of IL-1β in striatum than both SHAM group and model+PAE group （Plt;0.05）. Conclusion PAE could control the inflammatory response in the acute stage，reduce the area of acute cerebral infarction，prolong the survival time and improve the motor sensory function in the mouse model of MCAO.

【Key words】 Brain Ischemia；Middle cerebral artery occlusion；Paeonol；Ionized calcium binding adapter molecule 1；Glial fibrillary acidic protein；Interleukin 1β；Dysfunction

中風(fēng)是嚴(yán)重危害人體健康的心腦血管系統(tǒng)疾病之一，其中，缺血性腦血管?。╥schemic cerebrovascular disease，ICVD）約占所有中風(fēng)的80%，具有高患病率、致殘率和致死率等特征，而中老年人群則是傷殘和死亡群體中的重點(diǎn)研究對(duì)象［1］。

丹皮酚為毛茛科植物牡丹的干燥根皮（牡丹皮）和蘿藦科鵝絨藤屬植物徐長(zhǎng)卿的干燥根及根莖中的主要活性成分。一項(xiàng)腦組織缺血再灌注小鼠模型研究發(fā)現(xiàn)，丹皮酚能夠降低腦梗死面積［2］。有研究認(rèn)為，丹皮酚能夠?qū)股窠?jīng)系統(tǒng)炎癥、抑制氧自由基的產(chǎn)生［3］，在缺糖、缺氧的條件下，丹皮酚對(duì)神經(jīng)元有保護(hù)作用［4］。上述研究表明丹皮酚很可能是一類極有前景的神經(jīng)保護(hù)劑。本研究旨在通過(guò)觀察丹皮酚對(duì)大腦中動(dòng)脈缺血（MCAO）模型小鼠的干預(yù)效果，從而明確丹皮酚在缺血性中風(fēng)治療中的作用，具體實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與時(shí)間 SPF級(jí)C57BL/6雄性小鼠100只，體質(zhì)量23～28 g，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK（粵）2019-0047。小鼠均飼養(yǎng)于廣州中醫(yī)藥大學(xué)華南針灸實(shí)驗(yàn)中心，12 h光照、黑暗交替，室溫23～25 ℃，相對(duì)濕度50%～60%。造模前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，食水自由。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理審查（審查批號(hào)：20190307034），實(shí)驗(yàn)操作均嚴(yán)格按照廣州中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物操作執(zhí)行。本研究時(shí)間為2019年12月—2021年12月。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品和試劑 丹皮酚粉末（上海源葉生物科技有限公司，貨號(hào)：S24511），玉米油（SIGMA公司，貨號(hào)：C8267），兔抗大鼠離子鈣結(jié)合銜接分子1（IBA1）單克隆抗體（Wako公司，貨號(hào)：019-19741），大鼠膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）單克隆抗體（Thermo Fisher公司，貨號(hào)：13-0300），小鼠白介素（IL）-1β單克隆抗體（CST公司，貨號(hào)：12242S）；2，2，2-三溴乙醇（SIGMA公司，貨號(hào)：T48402-5G），動(dòng)物用異氟烷（Reward公司，貨號(hào)：R510-22-10）；其余試劑均為分析純。

1.3 主要儀器 動(dòng)物實(shí)時(shí)激光散斑灌注成像儀（Perimed AB），動(dòng)物維持麻醉系統(tǒng)（Reward公司），高速冷凍離心機(jī)（賽默飛世爾科技公司），冰凍切片機(jī)（賽默飛世爾科技公司），共聚焦顯微鏡（Nikon），基礎(chǔ)電泳儀電源（Bio Rad），小型轉(zhuǎn)印槽（Bio Rad），正置熒光顯微鏡 （Nikon），凝膠成像分析系統(tǒng)（Bio Rad），硅膠線栓（北京西濃科技有限公司）。

1.4 制備模型及驗(yàn)證模型穩(wěn)定性

1.4.1 MCAO模型制備 采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)將20只C57/BL6小鼠隨機(jī)分為MCAO模型組、假手術(shù)組，每組各10只。參照Z(yǔ)ea Longa線栓法［5］進(jìn)行MCAO模型制備。使用小動(dòng)物氣體麻醉系統(tǒng)、2%異氟烷維持麻醉，以仰臥位方式固定，頸下正中切開(kāi)，沿正中線分離鼓泡腺體，找到頸總動(dòng)脈以彎鑷做鈍性分離，分離迷走神經(jīng)，頸總動(dòng)脈近心端穿6-0絲線并結(jié)扎，向上分離，尋找頸總左側(cè)分叉，作鈍性分離并結(jié)扎頸外動(dòng)脈，用毛細(xì)血管夾夾閉頸內(nèi)動(dòng)脈，頸總動(dòng)脈遠(yuǎn)心端穿6-0絲線暫不結(jié)扎，血管剪15°～45°剪開(kāi)勁總動(dòng)脈，插入線栓，結(jié)扎遠(yuǎn)心端線結(jié)后打開(kāi)血管夾，線栓順血管插入至威利斯環(huán)。假手術(shù)組除不置入線栓外，其他過(guò)程均同MCAO模型小鼠。小鼠在清醒后進(jìn)行Longa評(píng)分，評(píng)分2～3分為造模成功，1ｈ后拔出線栓完成造模。凡由于其他因素而造成的動(dòng)物數(shù)量低于實(shí)驗(yàn)各組預(yù)定數(shù)量時(shí)，均采用隨機(jī)抽樣原則補(bǔ)齊所需要的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量。

1.4.2 神經(jīng)功能損害評(píng)分觀察行為學(xué)以驗(yàn)證模型成功 造模后24 h，對(duì)動(dòng)物模型進(jìn)行評(píng)分，Longa評(píng)分2～3分者認(rèn)為滿足要求，可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。對(duì)不滿足判斷標(biāo)準(zhǔn)的小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)剔除。麻醉后未蘇醒者認(rèn)為造模失敗，相關(guān)神經(jīng)功能損傷評(píng)分情況，見(jiàn)表1。

1.4.3 激光散斑灌注成像檢測(cè)梗死側(cè)腦血流灌注情況以驗(yàn)證模型穩(wěn)定性 造模后24 h，參照PAUL等［6］方法，利用激光散斑灌注成像技術(shù)觀察MCAO模型小鼠梗死側(cè)腦血流變化。采用隨機(jī)數(shù)字表法，將10只小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組與MCAO組，每組各5只，于造模后24 h，將各組小鼠用1.25%的三溴乙醇溶液麻醉后俯臥位固定于腦立體定位儀上，剃去頭部毛發(fā)，消毒后從頭部正中剪開(kāi)頭皮暴露顱骨，用波長(zhǎng)為671 nm的激光照射顱骨上，相機(jī)芯片上形成血管的動(dòng)態(tài)散斑圖（操作距離

11.6 cm，成像面積直徑87 mm2，曝光-時(shí)間 60 s，2張圖像/s，分辨率單位0.035 mm），采用PIMSoft程序計(jì)算感興趣區(qū)域（ROI）的均值作為灌注量。

1.4.4 TTC染色觀察小鼠大腦梗死部位及面積 造模后24 h，隨機(jī)選取3只小鼠，使用1.25％的三溴乙醇溶液進(jìn)行腹腔注射（注射劑量0.1 mL/10 g小鼠），麻醉后頸椎脫臼處死，剝離大腦后迅速置于小鼠腦模具中，于-20 ℃冰箱冰凍20 min。切去嗅球與小腦部分，利用模具將鼠腦切成厚度為1 mm的腦片。將切好的腦片放入配制好的1％TTC溶液中，并置于37 ℃水浴鍋中避光加熱，15 min后觀察腦片顏色變化并記錄。

1.5 探究丹皮酚對(duì)MCAO模型小鼠行為功能的改善作用

1.5.1 實(shí)驗(yàn)分組與給藥 采用隨機(jī)數(shù)字表法對(duì)50只小鼠進(jìn)行分組，模型+丹皮酚組、模型+玉米油組各20只，假手術(shù)組為10只。模型+丹皮酚組、模型+玉米油組28 d內(nèi)存活下來(lái)的小鼠數(shù)量各9只，假手術(shù)組為10只。

模型+丹皮酚組：MCAO造模成功24 h后灌服丹皮酚玉米油溶液100 mg·kg-1·d-1（丹皮酚玉米油溶液濃度為40 mg/mL）。

模型+玉米油組：MCAO造模成功24 h后灌服玉米油溶液100 mg·kg-1·d-1。

假手術(shù)組：術(shù)后24 h灌服玉米油溶液100 mg·kg-1·d-1。

于造模后28 d內(nèi)對(duì)各組小鼠的存活狀況情況予以統(tǒng)計(jì)，繪制生存曲線，采用Longa評(píng)分法對(duì)小鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分。

1.5.2 尼氏染色法檢測(cè)小鼠腦組織病理?yè)p傷程度 用藥后28 d，各組小鼠分別取5只，麻醉后取腦，4％多聚甲醛溶液（PFA）4 ℃固定過(guò)夜。然后依次置于15%、30%蔗糖溶液中梯度脫水，Thermo冰凍切片機(jī)切片，厚度為40 μm。腦片置于70%乙醇浸泡4 h；超純水浸洗2次；固定后晾干，用尼氏染液（焦油紫法）染色20～30 min；超純水浸洗2次；95%乙醇脫色2次；無(wú)水乙醇脫色；二甲苯透明2次；晾干后用中性樹(shù)膠封片，采用Nikon正置光學(xué)顯微鏡拍照，觀察腦組織病理?yè)p傷程度。比較三組小鼠健側(cè)大腦面積/患側(cè)大腦面積系數(shù)。

1.5.3 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)評(píng)估小鼠運(yùn)動(dòng)感覺(jué)功能 （1）走格子測(cè)試：主要用于評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)小鼠在自發(fā)運(yùn)動(dòng)過(guò)程中的運(yùn)動(dòng)感覺(jué)協(xié)調(diào)性功能［7］。評(píng)估時(shí)小鼠被安置在距離桌面高30 cm、長(zhǎng)35 cm、寬30 cm的金屬網(wǎng)格上，網(wǎng)格的孔寬度為1.5 cm。讓小鼠在網(wǎng)格上自由爬行5 min。在網(wǎng)格下，利用視頻采集設(shè)備記錄小鼠的爬行過(guò)程。如果小鼠指爪未抓住網(wǎng)格而踩空即為一次錯(cuò)步。小鼠在黑暗環(huán)境下自由行走并開(kāi)始計(jì)時(shí)，通過(guò)視頻慢放來(lái)計(jì)數(shù)小鼠在黑暗網(wǎng)格中100步內(nèi)的右側(cè)肢體錯(cuò)步次數(shù)，計(jì)算錯(cuò)步占百步的百分比為踩空率。MCAO造模前3 d為適應(yīng)訓(xùn)練，每天將小鼠放置在金屬網(wǎng)格架上自由爬動(dòng)2 min，消除小鼠的焦慮情緒。造模前采集最后1次適應(yīng)活動(dòng)的視頻，并分析錯(cuò)步率以作為基線數(shù)據(jù)。三組小鼠造模后第7、14、21、28天各評(píng)估1次，并采集視頻分析踩空率。

（2）爬杯測(cè)試：用于評(píng)估小鼠前肢使用不對(duì)稱性［8］。造模前3 d為適應(yīng)性階段。小鼠被放置在直徑9 cm、高15 cm的透明有機(jī)玻璃圓筒中隨意活動(dòng)，當(dāng)其后肢佇立起身爬杯次數(shù)達(dá)10次后方可拎出，5 min內(nèi)后肢站立起身次數(shù)lt;10次的小鼠將放回籠中自由活動(dòng)10 min后再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，直至完成10次爬杯。三組小鼠造模后第7、14、21、28天時(shí)，將小鼠安置在圓筒中隨意活動(dòng)，在圓筒前約10 cm處安裝視頻采集設(shè)備記錄小鼠活動(dòng)狀況，并利用視頻慢放來(lái)計(jì)數(shù)小鼠用后肢站立時(shí)用右前爪接觸筒壁的總次數(shù)，以及因無(wú)力觸穩(wěn)杯壁而出現(xiàn)右前爪劃拖的次數(shù)，拖爪次數(shù)/觸壁總次數(shù)×100％=拖爪率。每輪小鼠實(shí)驗(yàn)完畢后均需用乙醇消毒圓筒，確保圓筒無(wú)異味，不影響其他小鼠的測(cè)試。

（3）患側(cè)前肢剝離粘紙測(cè)試：用于評(píng)估小鼠前肢運(yùn)動(dòng)感覺(jué)功能［9］。將0.3 cm×0.4 cm的粘紙貼于小鼠右前爪掌心。將小鼠放在直徑20 cm的透明有機(jī)玻璃圓杯中，小鼠首次對(duì)粘紙做出反應(yīng)的時(shí)間（如甩動(dòng)右爪、用嘴接觸粘紙等）為感覺(jué)粘紙時(shí)間。造模前3 d根據(jù)以上步驟進(jìn)行自適應(yīng)培訓(xùn)，將最后1 d的數(shù)據(jù)視為基線數(shù)據(jù)，在造模后第7、14、21、28天均進(jìn)行2輪測(cè)試并取最優(yōu)值。

1.6 丹皮酚對(duì)MCAO小鼠行為功能改善的機(jī)制分析

1.6.1 實(shí)驗(yàn)分組與給藥 隨機(jī)將30只SPF級(jí)雄性C57BL/6小鼠分成假手術(shù)（SHAM）組6只，術(shù)后存活6只；模型+玉米油（MCAO+oil）組、模型+丹皮酚（MCAO+PAE）組各12只，術(shù)后存活各11只，給藥方式以及藥物濃度同1.5.1。

1.6.2 免疫熒光法檢測(cè)腦組織中IBA1、GFAP表達(dá)水平 于造模后14 d，模型+玉米油組、模型+丹皮酚組各取5只小鼠，假手術(shù)組取3只小鼠。將小鼠用1.25％三溴乙醇溶液麻醉后取腦，4％PFA于4 ℃固定12 h。然后依次置于15%、30%蔗糖溶液中脫水，用冰凍切片機(jī)切片（厚度為40 μm）。腦片用封閉液（2.5%羊血清、2.5%驢血清和0.3% Triton X-100，溶于PBS，pH值為7.4）封閉1 h，滴加一抗（IBA1、GFAP抗體均為1∶1 000稀釋），4 ℃過(guò)夜孵育，次日，PBS洗滌后滴加熒光二抗（1∶2 000），避光于室溫下孵育2 h。經(jīng)PBS洗滌后，滴加4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）（1∶2 000），染色10 min后用PBS清洗，最后用含甘油的PBS溶液作為封片劑進(jìn)行封片，于熒光顯微鏡下觀察小鼠腦損傷側(cè)冰凍切片，在相同的放大倍數(shù)及參數(shù)下，分別隨機(jī)選取每張腦片梗死中心區(qū)以及半暗帶區(qū)3個(gè)視野照相。

1.6.3 Western blotting法檢測(cè)紋狀體白介素1β（IL-1β）蛋白表達(dá)水平 于造模后2 d，模型+玉米油組、模型+丹皮酚組各取6只小鼠，假手術(shù)組取3只小鼠。斷頸處死小鼠后取腦，冰上操作，分離其紋狀體，用RIPA裂解緩沖液（含有1∶50蛋白酶磷酸酶抑制劑）提取紋狀體中的蛋白質(zhì)。然后加入1×loading buffer進(jìn)行配平，使各樣本濃度均為2 μg/μL。將蛋白質(zhì)提取物于55 ℃下煮沸20 min，加樣（2μL/泳道）到10％凝膠上。室溫下采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離，然后將凝膠轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。使用5％牛血清白蛋白（BSA）封閉液室溫封閉PVDF 1 h，孵育一抗，搖床過(guò)夜。然后室溫下孵育二抗1.5 h，使用TBST漂洗3次，固定顯影成像后用Image J軟件進(jìn)行分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Graphpad Prism 7.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和圖片制作。計(jì)量資料經(jīng)Shapiro-Walk檢驗(yàn)判斷是否符合正態(tài)分布，符合者多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；不同時(shí)間點(diǎn)多組間比較采用多因素重復(fù)測(cè)量方差分析。不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以M（P25，P75）表示，多組間比較采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)，組間兩兩比較采用Bonferroni檢驗(yàn)。以Plt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 模型制備與驗(yàn)證模型穩(wěn)定性

2.1.1 造模24 h后神經(jīng)功能缺損情況比較 造模后2 h，假手術(shù)組小鼠Longa評(píng)分為0分，MCAO模型小鼠Longa評(píng)分為2.0（2.0，2.0）分。

造模后24 h，將MCAO模型小鼠吊起懸空，發(fā)現(xiàn)小鼠右前爪向腹側(cè)蜷縮（圖1），自由活動(dòng)時(shí)軀體不自主地向患側(cè)轉(zhuǎn)圈，或行走時(shí)向患側(cè)傾斜，Longa評(píng)分為2～3分。

2.1.2 造模后24 h激光散斑灌注成像檢測(cè)梗死側(cè)腦血流灌注情況 造模后24 h，假手術(shù)組小鼠梗死側(cè)平均腦血流灌注量為（223.6±9.7），MCAO模型小鼠為（144.0±15.9）；造模后24 h MCAO模型小鼠梗死側(cè)平均腦血流灌注量小于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=9.54，Plt;0.01）。MCAO模型小鼠大腦中動(dòng)脈區(qū)血供異常，左右兩側(cè)腦血流灌注圖見(jiàn)圖2。

2.1.3 造模24 h后TTC染色評(píng)估MCAO模型小鼠大腦梗死部位及面積 在小鼠大腦中動(dòng)脈缺血1 h再灌注24 h后對(duì)其大腦切片進(jìn)行TTC染色，可觀察到未梗死部位呈暗紅色，梗死部位表現(xiàn)為發(fā)白，部位集中在患側(cè)紋狀體與皮質(zhì)，見(jiàn)圖3。

2.2 丹皮酚對(duì)MCAO模型小鼠行為功能的改善作用

2.2.1 三組小鼠28 d內(nèi)生存期比較 模型+玉米油組小鼠干預(yù)28 d的生存率為66.47%，模型+丹皮酚組小鼠生存率為81.43%。Log-rank檢驗(yàn)結(jié)果顯示，三組小鼠干預(yù)28 d的生存曲線比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=1.436，Plt;0.05），見(jiàn)圖4。

2.2.2 三組小鼠造模后28 d Longa評(píng)分比較 三組小鼠造模后28 d Longa評(píng)分比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05）；造模28 d后，模型+玉米油組Longa評(píng)分高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05）；模型+丹皮酚組與假手術(shù)組Longa評(píng)分比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05）；模型+丹皮酚組Longa評(píng)分低于模型+玉米油組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05），見(jiàn)表2。

2.2.3 三組小鼠造模后28 d健側(cè)大腦面積/患側(cè)大腦面積系數(shù)比較 三組小鼠造模后28 d健側(cè)大腦面積/患側(cè)大腦面積系數(shù)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05）；模型+玉米油組、模型+丹皮酚組小鼠造模后28 d健側(cè)大腦面積/患側(cè)大腦面積系數(shù)大于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05）；模型+丹皮酚組小鼠造模后28 d健側(cè)大腦面積/患側(cè)大腦面積系數(shù)小于模型+玉米油組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05），見(jiàn)表3。

假手術(shù)組小鼠腦部切片左右腦片形狀對(duì)稱，皮質(zhì)神經(jīng)元構(gòu)造形態(tài)正常，排列有序，尼氏小體數(shù)量豐富，染色水平一致，呈現(xiàn)深藍(lán)紫色，未見(jiàn)病理性損傷。與假手術(shù)組比較，模型+玉米油組小鼠大腦梗死處中樞神經(jīng)元發(fā)生嚴(yán)重萎縮變形，腦組織的內(nèi)部結(jié)構(gòu)也遭到了損害，患側(cè)大腦萎縮，見(jiàn)圖5。

2.2.4 各組小鼠運(yùn)動(dòng)感覺(jué)功能比較 組間與時(shí)間對(duì)小鼠走格子測(cè)試踩空率存在交互作用（Plt;0.05）；組間及時(shí)間分別為小鼠走格子測(cè)試踩空率主效應(yīng)顯著（Plt;0.05）。模型+玉米油組小鼠造模后7、14、21、28 d走格子測(cè)試踩空率高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05）；模型+丹皮酚組小鼠造模后7、14 d走格子測(cè)試踩空率高于假手術(shù)組，造模后7、14、21、28 d走格子測(cè)試踩空率低于模型+玉米油組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05），見(jiàn)表4。

組間與時(shí)間對(duì)小鼠爬杯試驗(yàn)拖爪率存在交互作用（Plt;0.05）；組間及時(shí)間分別為小鼠爬杯試驗(yàn)拖爪率主效應(yīng)顯著（Plt;0.05）。模型+玉米油組、模型+丹皮酚組小鼠造模后7、14、21、28 d爬杯試驗(yàn)拖爪率高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05）；模型+丹皮酚組小鼠造模后7、14、21、28 d爬杯試驗(yàn)拖爪率低于模型+玉米油組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05），見(jiàn)表5。

組間與時(shí)間對(duì)小鼠感覺(jué)粘紙時(shí)間存在交互作用（Plt;0.05）；組間及時(shí)間分別為小鼠感覺(jué)粘紙時(shí)間主效應(yīng)顯著（Plt;0.05）。模型+玉米油組小鼠造模后7、14、21、28 d感覺(jué)粘紙時(shí)間長(zhǎng)于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05）；模型+丹皮酚組小鼠造模后7、14、21 d感覺(jué)粘紙時(shí)間短于模型+玉米油組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05）；模型+丹皮酚組小鼠造模后7 d感覺(jué)粘紙時(shí)間長(zhǎng)于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05），見(jiàn)表6。

2.3 丹皮酚對(duì)MCAO小鼠行為功能改善的機(jī)制

2.3.1 三組小鼠造模后14 d腦組織中IBA1、GFAP表達(dá)水平比較 三組小鼠造模后14 d腦組織中IBA1、GFAP表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05）；模型+玉米油組、模型+丹皮酚組小鼠造模后14 d腦組織中IBA1、GFAP表達(dá)水平高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05）；模型+丹皮酚組小鼠造模后14 d腦組織中IBA1、GFAP表達(dá)水平低于模型+玉米油組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05），見(jiàn)表7、圖6。

2.3.2 三組小鼠造模后2 d紋狀體IL-1β蛋白表達(dá)水平比較 三組小鼠造模后2 d紋狀體IL-1β蛋白表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05）；模型+玉米油組小鼠造模后2 d紋狀體IL-1β蛋白表達(dá)水平高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05）；模型+丹皮酚組小鼠造模后2 d紋狀體IL-1β蛋白表達(dá)水平低于模型+玉米油組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05），見(jiàn)表8、圖7。

3 討論

臨床上，大多數(shù)人類缺血性梗死發(fā)生在大腦中動(dòng)脈區(qū)域［10］，因此，為了更好地在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中模擬人類大腦缺血性疾病，本實(shí)驗(yàn)選擇了MCAO模型進(jìn)行研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，建造MCAO模型后，小鼠顱內(nèi)存在明顯的梗死病灶，中樞神經(jīng)行為嚴(yán)重受損，腦組織的內(nèi)部結(jié)構(gòu)越來(lái)越薄和稀松，腦內(nèi)神經(jīng)元皺縮嚴(yán)重；丹皮酚治療后，MCAO模型小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害情況較之前好轉(zhuǎn)，干預(yù)28 d的生存率明顯提高，前肢運(yùn)動(dòng)感覺(jué)協(xié)調(diào)功能及前肢非對(duì)稱性運(yùn)動(dòng)功能均顯著提高，與腦梗死體積結(jié)果一致，說(shuō)明丹皮酚能在一定程度上緩解這些損害，對(duì)MCAO模型小鼠的行為和感覺(jué)功能有明確的改善作用。

缺血性中風(fēng)后梗死區(qū)可劃分為核心區(qū)和缺血半暗帶區(qū)，核心地帶的周邊缺血性腦組織為缺血半暗帶，而缺血暗帶區(qū)則為發(fā)生氧化應(yīng)激、自由基損害的主要部位，為腦灌注量介于電活動(dòng)失常與不可逆神經(jīng)元去極化之間的狀態(tài)區(qū)域［11］，其神經(jīng)元表現(xiàn)為凋亡。半暗帶的概念已經(jīng)成為中風(fēng)研究中的一個(gè)里程碑，因?yàn)榘氚祹Щ旧鲜强梢酝炀鹊?，減小半暗帶區(qū)神經(jīng)元損傷是神經(jīng)保護(hù)的重要方法［12］。小膠質(zhì)細(xì)胞也是中樞神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)（CNS）重要的機(jī)體免疫組成部分［13］，中風(fēng)后不斷被激活的小膠質(zhì)細(xì)胞可產(chǎn)生炎性因子，造成神經(jīng)炎性反應(yīng)的惡性循環(huán)，因此炎性反應(yīng)是中風(fēng)后突出的表現(xiàn)，小膠質(zhì)細(xì)胞也已被證明是動(dòng)物模型腦缺血早期神經(jīng)元損傷的敏感指標(biāo)［14］。星狀膠質(zhì)神經(jīng)元廣泛存在于人腦灰質(zhì)和白質(zhì)中，在神經(jīng)元的發(fā)育、突觸傳導(dǎo)、神經(jīng)組織修復(fù)和再生、神經(jīng)系統(tǒng)免疫功能和各種神經(jīng)系統(tǒng)疾患的病理機(jī)制等方面均起到了重要的作用。IBA1和GFAP分別為小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)記物，其是反應(yīng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷程度的標(biāo)志性物質(zhì)。本研究結(jié)果顯示，丹皮酚造模后小鼠腦組織半暗帶區(qū)內(nèi)IBA1、GFAP表達(dá)均下調(diào)，說(shuō)明星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞應(yīng)激程度降低，這表明丹皮酚可能在緩解缺血性中風(fēng)模型腦內(nèi)炎性反應(yīng)具有一定的療效。

缺血再灌注引起炎性反應(yīng)，其特征是腦內(nèi)各種細(xì)胞因子的局部表達(dá)，IL-1β在腦缺血1 h后即可被檢測(cè)到，且已被認(rèn)為可以誘導(dǎo)神經(jīng)元損傷。IL-1β作為最早確認(rèn)的神經(jīng)肽的細(xì)胞因子，是一種前炎性細(xì)胞因子，其生成與Toll樣受體（TLR）、Nod樣受體（NLRs）家族、RIG-I樣受體（RLRs）家族、C型凝集素受體家族這幾種模式識(shí)別受體相關(guān)，由神經(jīng)系統(tǒng)的內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元合成［15］。研究表明，實(shí)驗(yàn)性中風(fēng)后IL-1β表達(dá)顯著上調(diào)［16］，而丹皮酚通過(guò)阻斷TLR4/髓樣分化因子88（myeloid differentiationfactor 88，MyD88）/核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號(hào)通路傳導(dǎo)，抑制小鼠血清IL-1β水平［17］。本研究利用Western blotting法檢測(cè)MCAO小鼠損傷側(cè)紋狀體IL-1β蛋白表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)其在模型+丹皮酚組較模型+玉米油組明顯降低，說(shuō)明丹皮酚可以有效降低小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，下調(diào)IL-1β的表達(dá)，減少炎性反應(yīng)，使小鼠存活率上升，腦梗死面積減少，運(yùn)動(dòng)感覺(jué)功能改善。

綜上所述，本研究著重探討丹皮酚對(duì)線栓缺血性中風(fēng)模型行為學(xué)功能障礙的效果和相關(guān)生物學(xué)機(jī)制。從分子、病理、行為學(xué)不同層次系統(tǒng)的研究丹皮酚改善缺血性中風(fēng)行為功能障礙，為丹皮酚的臨床應(yīng)用提供參考。

作者貢獻(xiàn)：許沁提出研究思路，確定模型的選擇；陳茜負(fù)責(zé)小鼠模型制作、負(fù)責(zé)各種實(shí)驗(yàn)、對(duì)樣本進(jìn)行采集、收集相關(guān)數(shù)據(jù)、進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和繪制圖表，負(fù)責(zé)論文起草最終版本修訂，對(duì)論文負(fù)責(zé)；駱建宇負(fù)責(zé)行為學(xué)實(shí)驗(yàn)，負(fù)責(zé)行為學(xué)數(shù)據(jù)的采集和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；鄺棗園設(shè)計(jì)研究方案，研究命題的提出、設(shè)計(jì)。

本文無(wú)利益沖突。

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（收稿日期：2022-03-06；修回日期：2022-11-11）

（本文編輯：毛亞敏）