基于Keap1/Nrf2信號通路針灸拮抗DDP腎損傷小鼠的作用機制＊

王永欣，于冬冬，＊＊，莊 語，張歡歡，，滕迎春，晁利芹，魏星宇，范世東

（1. 河南中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院 鄭州 450046；2. 河南中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院 鄭州 450008；3. 河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 鄭州 450099；4. 河南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥科學(xué)院 鄭州 450046）

順鉑（Cisplatin，DDP）是臨床常用的鉑類化療藥物，廣泛運用于多種惡性腫瘤[1-3]，發(fā)揮殺死惡性腫瘤細(xì)胞作用的同時，也會對正常組織細(xì)胞造成嚴(yán)重的損傷，產(chǎn)生一系列毒副反應(yīng)[4]。腎臟對DDP 敏感性高，易在腎近端小管上皮細(xì)胞蓄積致細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，高劑量給藥或低劑量重復(fù)給藥均能造成腎損傷[5-6]。近期研究表明核因子E2 相關(guān)因子2（Nuclear factor E2-related factor2，Nrf2）相關(guān)信號通路的激活在氧化應(yīng)激中發(fā)揮重要作用[7-8]。研究發(fā)現(xiàn)對于鉑類化療藥物引起的肝腎毒性，采用經(jīng)皮穴位電刺激可有效延緩肝腎損傷的進程[9]。前期研究表明針灸對于化療藥物造成的肝腎氧化損傷具有干預(yù)作用，同時也能夠抑制肝細(xì)胞凋亡，以及減輕骨髓抑制等[10-14]，由于化療藥物造成的損傷是多方面多系統(tǒng)的，我們發(fā)現(xiàn)針灸亦能對腎損傷起到良好的改善和保護作用，但機理研究較為薄弱，因此，本研究基于課題組前期結(jié)果，從不同層次觀察針刺與艾灸干預(yù)后DDP 所致腎損傷小鼠中Kelch 樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1（Kelch-like ECHassociated protein- 1，Keap1）和Nrf2 含量，蛋白表達以及mRNA 相對表達的變化，進一步研究其內(nèi)在的微觀機制，說明針灸干預(yù)DDP 所致腎損傷潛在的保護作用機制，為臨床應(yīng)用及研究提供相關(guān)實驗室依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及分組

SPF 級雄性昆明小鼠40 只，5 周齡，體質(zhì)量（30±2）g，濟南朋悅實驗動物繁育有限公司[SCXK（魯）2019-0003]提供。分籠飼養(yǎng)于河南中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心，自由飲水及普通飼料喂養(yǎng)，適應(yīng)實驗室環(huán)境（溫度20℃～25℃，濕度50%～60%,光暗周期12h/12h）3 天后，根據(jù)小鼠體重隨機分為4組（空白組、模型組、針刺組、艾灸組），每組10 只。嚴(yán)格執(zhí)行2006 年科技部發(fā)布的《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》對本實驗動物進行處理[15]。河南中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理審查批準(zhǔn)編號：DWLL2018030013。

1.2 試劑與儀器

主要試劑：注射用順鉑（貨號：AA1A1007B）,購于齊魯制藥有限公司；BUN、Scr 試劑盒（貨號：C013-2-1、C011-2-1），購于南京建成生物工程研究所；NGAL、CysC 試劑盒（貨號：EK0854、EK0679），購于博士德生物工程有限公司；Keap1、Nrf2 ELISA 試劑盒（貨號：E20201202A、E20201125A），購于蘇州卡爾文生物科技有限公司；Keap1 兔單克隆抗體、Nrf2兔多克隆抗體（貨號：R26935、380773），購于成都正能生物技術(shù)有限責(zé)任公司；Keap1、Nrf2 二抗，購于鄭州樂睿生物科技有限公司；SDS-PAGE 凝膠制備試劑盒（貨號：JCPE001），購于西安晶彩生物科技有限公司；RNAzol?RT RNA Isolation Reagent、cDNA 第一鏈合成試劑盒、BlazeTaqTMSYBR? PCR 試劑盒（貨號：QP020、QP056、QP031），購于美國GeneCopoeia 公司；BCA 蛋白濃度測定試劑盒（JC-PD002），購于南京諾唯贊生物科技股份有限公司。

主要儀器：毫針（規(guī)格：0.18 mm×13 mm），購于北京中研太和醫(yī)療器械有限公司；細(xì)艾灸條（規(guī)格：0.4 cm×12 cm），購于臨湘市湖香艾生物科技有限公司；臺式低速離心機（型號：TDZ5-WS），購于上海盧湘儀離心儀器有限公司；酶標(biāo)儀（型號：Model 680）、PowerPac Basic 電泳儀電源（型號：1645050），購于美國Bio-Rad 公司；通用型電泳儀（型號：JY300C），購于北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；高速微量離心機（型號：D2012plus），購于北京大龍興創(chuàng)實驗儀器股份公司；分光光度計（型號：NanoDrop 8000）、蛋白印跡智能成像系統(tǒng)（型號：Bright FL1000），購于賽默飛世爾科技公司；梯度 PCR 儀（型號：TP600），購于日本TaKaRa公司。

1.3 模型制備

查閱文獻發(fā)現(xiàn)，造模方法為單次腹腔注射7.5～25 mg·kg-1的劑量[6,16]。參照孫妍[17]的給藥劑量，并經(jīng)過課題組多次預(yù)實驗，以10 mg·kg-1劑量制備腎損傷模型，并佐以病理切片驗證[12]，發(fā)現(xiàn)此劑量既能造模成功又無動物大量死亡。因此，本實驗采用10 mg·kg-1劑量DDP 進行腹腔注射，誘導(dǎo)腎損傷小鼠模型，模型制備完成時間為24h。空白組小鼠同時段給予腹腔注射0.9% NaCl溶液。

1.4 干預(yù)方法

干預(yù)腧穴：選取大椎、肝俞、腎俞、足三里4 個腧穴，定位方法依據(jù)《實驗針灸學(xué)》[18]；固定方法：小鼠俯臥固定于自制鼠板（由四肢展開的距離大小在木板上釘上距離適宜的釘子制成，布膠帶纏繞塑料夾子固定四肢）上。針刺方法：采用0.18 mm×13 mm 一次性毫針（方向及深度：直刺3 mm；時間：留針6 min）；艾灸方法：采用0.4 cm×12 cm 細(xì)艾條懸灸（時間：每兩穴灸3 min，共計6 min；距離：距離腧穴約2 cm），模型組及空白組每日陪同抓取、固定6 min，與針刺組及艾灸組同步；同時段連續(xù)干預(yù)5天。

1.5 組織取材

取材時間：實驗第7天；取材步驟：①眼球取血，所采集的血液室溫靜置2 h 后，3500 r·min-1離心10 min，取100 μL 上層血清置于2 mL EP 管中，對樣本標(biāo)記后放置在-20℃冰箱保存?zhèn)錂z；②頸椎脫臼處死，剖腹后，取左側(cè)腎臟組織并去除結(jié)締組織，生理鹽水沖洗后，等分后分裝于三份凍存管，其中兩份在取材過程中液氮冷淬，取材完成后，干冰轉(zhuǎn)運至-80℃冰箱保存?zhèn)錂zWestern blot 和RT-PCR，另一份轉(zhuǎn)運至-20℃冰箱保存?zhèn)錂zELISA。

1.6 觀察指標(biāo)及方法

（1）ELISA 法檢測小鼠血清中BUN、Scr、NGAL 和CysC 含量，腎臟組織中Nrf2 及Keap1 含量：血清樣本取離心后上清液進行檢測，腎臟組織樣本加入適量生理鹽水搗碎，離心10 min（3500 r·min-1）取上清；試劑盒從冷藏環(huán)境中取出后在室溫平衡后方使用。余步驟嚴(yán)格按照說明書進行。

（2）Western blot 法測定小鼠腎臟組織中Nrf2 及Keap1 的蛋白表達水平：制備蛋白樣品→酶標(biāo)儀蛋白濃度測定→制膠→加樣→聚丙烯酰胺凝膠電泳→轉(zhuǎn)膜封閉→孵育一抗（1:500- 1:10 000 稀釋一抗，4℃搖晃孵育過夜）→孵育二抗（1:5000 稀釋辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗，室溫?fù)u動孵育2h）→洗膜→ECL化學(xué)發(fā)光顯影（內(nèi)參蛋白：β-actin，目標(biāo)蛋白表達量：目標(biāo)蛋白/內(nèi)參蛋白，Image J軟件測定條帶灰度值）。

（3）Real-time PCR 法檢測小鼠腎臟組織中Nrf2及Keap1 mRNA 相對表達：RNA 抽提（TRIzol 法）→反轉(zhuǎn)錄為cDNA（37℃孵育1 小時，反應(yīng)結(jié)束后85℃滅活處理5 min，-20℃保存反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物待用）→定量PCR實驗（引物序列如表1 所示，采用SYBR Green 熒光染料法，反應(yīng)條件設(shè)定為：預(yù)變性：95℃ 10 min 1 Cycle，變性：95℃ 10 s 40 Cycle，退火：60℃ 20 s 40 Cycle，延伸：72℃ 15 s 40 Cycle）→PCR 數(shù)據(jù)分析（采用2-ΔΔCt法計算Keap1與Nrf2的相對表達量）。

表1 小鼠Keap1、Nrf2 mRNA引物序列

1.7 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)分析使用SPSS 26 軟件，作圖使用GraphPad Prism 9 軟件，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，符合正態(tài)分布采用單因素ANOVA 分析，不符合正態(tài)分布采用非參數(shù)Kruskal Wallis 檢驗。用Levene 法進行方差齊性檢驗，若方差齊，采用LSD 法；若方差不齊，采用Tamhane法。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠血清中BUN、Scr、CysC、NGAL含量

與空白組比，模型組小鼠血清中BUN、Scr、CysC、NGAL 的含量顯著增高（P<0.05）；與模型組比，針刺組和艾灸組小鼠血清中BUN、Scr、CysC、NGAL 的含量顯著降低（P<0.05）。與針刺組比，艾灸組小鼠血清中BUN、Scr、CysC、NGAL 的含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見圖1。

圖1 各組小鼠血清BUN、Scr、CysC、NGAL含量（ELISA法，±s，n=6）

2.2 各組小鼠腎臟中Keap1、Nrf2含量

與空白組比，模型組小鼠腎臟組織中Keap1 的含量顯著增高（P<0.05），Nrf2的含量顯著下降（P<0.05）；與模型組比，針刺組和艾灸組小鼠腎臟組織中Keap1的含量顯著降低（P<0.05），Nrf2 的含量顯著升高（P<0.05）。與針刺組比，艾灸組Keap1、Nrf2含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見圖2。

圖2 各組小鼠腎臟Keap1、Nrf2含量（ELISA法，±s，n=6）

2.3 各組小鼠腎臟中Keap1、Nrf2蛋白表達水平

與空白組比，模型組小鼠腎臟中Keap1 蛋白表達水平顯著增高（P<0.05），Nrf2 蛋白表達水平顯著下降（P<0.05）；與模型組比，針刺組和艾灸組小鼠腎臟中Keap1 蛋白表達水平顯著降低（P<0.05），Nrf2 的蛋白表達水平顯著升高（P<0.05）。與針刺組比，艾灸組Keap1、Nrf2 蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見圖3。

圖3 各組小鼠腎臟Keap1、Nrf2蛋白表達水平（Western blot法，±s，n=6）

2.4 各組小鼠腎臟中Keap1、Nrf2 mRNA 相對表達含量

與空白組比，模型組腎臟組織中Keap1 和Nrf2 mRNA 表達升高（P<0.05）；與模型組比，針刺組及艾灸組腎臟組織中Keap1 mRNA 表達降低（P<0.05），Nrf2 mRNA 表達升高（P<0.05）。與針刺組比，艾灸組腎臟組織Keap1、Nrf2 mRNA 表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見圖4。

3 討論

化療所致腎損傷以血尿、腰部疼痛、倦怠乏力等為主要臨床表現(xiàn)。中醫(yī)并無化療所致腎損傷的文獻記載，現(xiàn)代中醫(yī)學(xué)者[19-21]以“益腎排毒”“滋陰清熱”“補腎健脾”等為治則進行治療，均取得一定療效。正所謂“正氣存內(nèi)，邪不可干”、“邪之所湊，其氣必虛”，因此在治療該病時，需要調(diào)節(jié)腎臟的內(nèi)環(huán)境平衡，宜行健脾、補肝、益腎之法。課題組提出“扶正固腎為主，兼顧疏肝健脾益胃，化瘀止痛”的治療原則，經(jīng)過近40年動物實驗以及臨床研究，總結(jié)出“扶正固腎”穴方（大椎、肝俞、腎俞、足三里）治療化療所致腎損傷[13,22-24]。大椎穴，又名“上杼”、“百勞”，首見于《素問·骨空論》，為督脈與六陽經(jīng)的交會穴，稱“諸陽之會”，統(tǒng)攝一身陽氣，有祛邪外出、激發(fā)陽氣、恢復(fù)正氣的功效；肝俞穴，為肝之背俞穴，是肝之氣血輸注匯集之處，有清利肝膽、疏理肝郁、散結(jié)止痛、補益肝腎的功效；腎俞穴，為腎之背俞穴，腎中精氣輸注的部位，主治腎臟相關(guān)疾病，有調(diào)補腎氣、補益精髓、益腎養(yǎng)陽的功效；足三里穴，為足陽明胃經(jīng)的合穴，胃腑之下合穴，有生發(fā)胃氣、健脾祛濕、補氣生血的功效。諸穴合用可達肝腎同調(diào)、健脾益氣，培元固本之功，可以改善化療所致腎損傷，減少化療所致不良反應(yīng)，增加機體抗病能力。課題組[9,11]既往研究也證實“扶正固腎”穴方對DDP肝腎損傷模型小鼠具有保護作用。

近年來，針灸療法在腫瘤防治上逐步集中在治療腫瘤伴隨癥狀或改善放化療后的不良反應(yīng)[25]。既往研究表明針灸能夠通過抑制Notch 信號通路，對環(huán)磷酰胺致骨髓抑制小鼠起到保護作用[26-28]，但針灸是否對DDP所致腎損傷具有保護作用研究尚淺。BUN、Scr是反映腎功能的常用指標(biāo)，并且NGAL、CysC在急性腎損傷早期具有較高的診斷價值[29]。本研究發(fā)現(xiàn)針灸干預(yù)DDP 腎損傷模型小鼠后，血清中BUN、Scr、CysC 及NGAL 含量明顯降低，結(jié)果表明針灸通過改善DDP 模型小鼠腎功能，對腎損傷發(fā)揮保護作用。此外，研究結(jié)果中針刺與艾灸療效無明顯差異，但艾灸有優(yōu)于針刺的趨勢。

DDP 誘導(dǎo)腎損傷的機理主要是：機體攝入的DDP以腎臟為主要排泄器官，容易在腎臟中形成長時間、高濃度的蓄積環(huán)境，從而誘導(dǎo)機體大量產(chǎn)生活性氧自由基（Reactive oxygen species，ROS）介導(dǎo)炎癥、氧化還原以及細(xì)胞凋亡等應(yīng)激反應(yīng)，對機體腎臟組織造成損傷[30-34]。目前，順鉑腎毒性的機制尚未完全闡明，研究表明腎臟的氧化應(yīng)激反應(yīng)是DDP 所致腎損傷的重要發(fā)病機制之一[35]。在對氧化應(yīng)激的生物學(xué)反應(yīng)中，處于中心位置的是Keap1/Nrf2-ARE信號通路，它調(diào)節(jié)許多抗氧化基因的轉(zhuǎn)錄，保持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定[36]。Nrf2是細(xì)胞抗氧化應(yīng)激的關(guān)鍵蛋白，在正常情況下，處于胞漿中的Nrf2 處于非活性狀態(tài)，與其抑制因子Keap1結(jié)合，被Keap1泛素化修飾，蛋白酶體系統(tǒng)持續(xù)將其降解[37]。在氧化應(yīng)激狀態(tài)下，Keap1 可以快速對細(xì)胞氧化還原狀態(tài)做出相關(guān)反應(yīng)，ROS 可通過修飾Keap1 的半胱氨酸殘基，造成Keap1 對Nrf2 結(jié)合作用的不穩(wěn)定[38]，Nrf2 脫離Keap1 的結(jié)合，快速進行核轉(zhuǎn)移，與抗氧化反應(yīng)原件（Antioxidant response element，ARE）結(jié)合，繼而進行下游靶基因轉(zhuǎn)錄[39]。研究發(fā)現(xiàn)[40]梓醇干預(yù)DDP 腎損傷大鼠模型后，Nrf2 蛋白表達水平及mRNA 相對表達升高，Keap1 蛋白表達水平及mRNA相對表達降低，與本研究結(jié)果一致。本研究結(jié)果顯示，與空白組比，模型組腎臟組織中Keap1 含量、蛋白表達水平及mRNA 相對表達升高，Nrf2 含量及蛋白表達水平降低，mRNA 相對表達升高；與模型組比，針刺組及艾灸組Keap1 含量、蛋白表達水平及mRNA 相對表達降低，Nrf2含量、蛋白表達水平及mRNA相對表達升高。提示DDP 所致腎損傷與Keap1/Nrf2 信號通路的抗氧化作用密切相關(guān)，針灸可通過介導(dǎo)Keap1/Nrf2信號通路提高DDP 小鼠腎臟抗氧化應(yīng)激能力，以改善腎損傷。

綜上所述，本研究以Keap1/Nrf2 信號通路為切入點，通過檢測Keap1 和Nrf2 三個不同層次的表達結(jié)果可知，小鼠腹腔注射DDP 后，造成Keap1/Nrf2 信號通路失調(diào)，破壞腎臟細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，使腎臟組織發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)。針灸干預(yù)后，小鼠血清中BUN、Scr、CysC 及NGAL 含量明顯降低，小鼠腎臟組織中Keap1表達下降，Nrf2表達上升，使得Keap1/Nrf2信號通路趨于平衡，改善腎功能及腎臟組織氧化應(yīng)激反應(yīng)，減輕DDP 所致腎損傷。本研究從氧化應(yīng)激角度闡釋了針灸改善DDP 化療所致腎損傷潛在的微觀機制和信號途徑。由于Keap1/Nrf2信號通路處于氧化還原系統(tǒng)中心位置，其相關(guān)作用機制仍需要深入研究。