藥效學(xué)結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究酸棗仁湯對(duì)不同疾病模型的干預(yù)作用及其作用機(jī)制＊

張洪雄，高太祥，趙 峰，王 楠，王 瑞

（山西中醫(yī)藥大學(xué)中藥與食品工程學(xué)院 晉中 030619）

失眠是一個(gè)常見(jiàn)的公共衛(wèi)生問(wèn)題，長(zhǎng)期失眠會(huì)使人們的健康和生活受到嚴(yán)重的影響，也會(huì)帶來(lái)許多疾病風(fēng)險(xiǎn)，如慢性心力衰竭、心血管疾病、抑郁癥和高血壓等[1]。抑郁癥是一種情緒障礙，其特征是持續(xù)的悲傷，無(wú)法體驗(yàn)快樂(lè)，并伴隨著日常功能的缺陷[2]。抑郁癥的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)穩(wěn)步上升，目前的流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示，抑郁癥現(xiàn)在是全球疾病負(fù)擔(dān)的第三大因素[3]。

失眠和抑郁的相關(guān)治療多以西藥為主但是具有不良反應(yīng)多、易復(fù)發(fā)等缺點(diǎn)[4]。失眠、抑郁癥等精神類(lèi)疾病采用中醫(yī)藥治療效果明顯并且對(duì)人體的副作用小，具有良好的應(yīng)用前景。酸棗仁湯出自《金匱要略》，由酸棗仁、茯苓、川芎、知母、甘草組成，具有養(yǎng)心安神、清熱除煩的作用[5]，上述5 種藥物均為藥食同源目錄（2021 年版）所收載品種。研究顯示，5-HT、NE、DA 等單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)在失眠、抑郁癥中扮演著重要的角色。5-HT 屬于抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，可以抑制覺(jué)醒，使非快動(dòng)眼睡眠延長(zhǎng)[6]。5-HT、NE、DA 的含量減少[7]或受體功能下調(diào)[8]可能會(huì)導(dǎo)致抑郁癥的發(fā)生。

近年來(lái)，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)在中藥復(fù)方研究中的應(yīng)用頗有成效，與西藥針對(duì)單靶點(diǎn)的作用機(jī)制相比，中藥復(fù)方作用于多個(gè)通路和靶點(diǎn)，通過(guò)協(xié)同作用治療疾病。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可以篩選出藥物活性成分和疾病的相關(guān)靶點(diǎn)，準(zhǔn)確預(yù)測(cè)藥物的作用靶點(diǎn)，開(kāi)發(fā)其潛在的藥理作用，這與中藥方劑“多成分、多靶點(diǎn)”的特點(diǎn)相一致[9]。目前，對(duì)酸棗仁湯的藥理作用研究，主要圍繞改善失眠的作用機(jī)制研究[10]，以及其他包括改善記憶力和抗抑郁等方面的研究[11]，但針對(duì)失眠和抑郁這兩種不同疾病，如何合理應(yīng)用酸棗仁湯進(jìn)行治療未見(jiàn)相關(guān)文獻(xiàn)涉及。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)[12]，酸棗仁湯給藥劑量不同，對(duì)腦組織中神經(jīng)遞質(zhì)的調(diào)節(jié)存在差別。因此，本研究通過(guò)給予不同劑量SZRD 及相關(guān)陽(yáng)性藥，比較失眠、抑郁模型小鼠腦組織中5-HT、NE、DA 的含量變化，并進(jìn)行行為學(xué)測(cè)試，明確酸棗仁湯促進(jìn)睡眠、抗抑郁的作用，同時(shí)借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)其核心靶點(diǎn)和相關(guān)作用通路，探究不同劑量SZRD 對(duì)失眠、抑郁模型小鼠的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本研究所用動(dòng)物為四周齡SPF 級(jí)雄性ICR 小鼠，均購(gòu)自維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，共160只，體質(zhì)量為23-27 g，生產(chǎn)許可證編號(hào)為SCXK（京）2016-0006。在山西中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物房飼養(yǎng)，溫度23-26℃，自由飲食、進(jìn)水。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)山西中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)編號(hào)：2019LL155）。

1.2 儀器

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠，SY-5000）；電子天平（諸暨市超澤衡器設(shè)備有限公司，JM-B10001）；萬(wàn)能高速粉碎機(jī)（浙江紅景天工貿(mào)有限公司，DE-100 g）；循環(huán)水式真空泵（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；高速離心機(jī)（科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司，HC-2518）；數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市杰瑞爾電器有限公司，HH-2S）；大小鼠開(kāi)場(chǎng)活動(dòng)實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)（成都泰盟軟件有限公司，OFT-100）

1.3 試劑

氯化鈉注射液（石家莊四藥有限公司，2103041902）；蔗糖（天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司，20210419）；地西泮片（山東信誼制藥有限公司，201001）；逍遙丸（河南省濟(jì)源市濟(jì)世藥業(yè)有限公司，1906066）；DL-4-氯苯基丙氨酸（上海麥克林生化科技有限公司，C12072894）；戊巴比妥鈉（山東西亞化學(xué)股份有限公司，F(xiàn)0749）；羧甲基纖維素鈉（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，20150110）；NE、DA、5-HT 試劑盒（江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司，202112）。

1.4 藥材

（炒）酸棗仁（批號(hào)：200801）、川芎（批號(hào)：190901）、甘草（批號(hào)：200401）、茯苓（批號(hào)：210203）、知母（批號(hào)：190601）。以上5 味藥材均購(gòu)自山西元和堂中藥有限公司，經(jīng)山西中醫(yī)藥大學(xué)裴香萍教授鑒定均為正品。

2 方法

2.1 供試品溶液的制備

酸棗仁湯中各藥配比依據(jù)《金匱要略》，即酸棗仁（炒）、茯苓、知母、川芎和甘草15∶6∶6∶6∶3，浸泡30 min 后，加9 倍量水回流提取3 次，每次1.5 h，將所得藥液紗布過(guò)濾后濃縮至0.37 g·mL-1、3.70 g·mL-1的低、高濃度SZRD 藥液。取地西泮（2.5 mg/片）2 片，加蒸餾水溶解得質(zhì)量濃度為0.10 g·mL-1的地西泮溶液，作為失眠模型小鼠的陽(yáng)性藥。將逍遙丸（0.375 g/丸）置研缽中研磨，加蒸餾水溶解得質(zhì)量濃度為0.19 g·mL-1的逍遙丸溶液，作為抑郁模型小鼠的陽(yáng)性藥。DL-4-氯苯基丙氨酸（PCPA）按500 mg·kg-1，0.2 mL·10 g-1·BW-1計(jì)算稱(chēng)取用量，研至細(xì)粉末狀，加入生理鹽水，并添加適量羧甲基纖維素鈉（CMC-Na），邊加邊攪拌，調(diào)節(jié)PH=7-8，即得PCPA 混懸液，用于失眠模型小鼠的制備。

2.2 模型制備

2.2.1 失眠模型的建立及分組

適應(yīng)性喂養(yǎng)7天后，根據(jù)其體質(zhì)量排序，按照隨機(jī)數(shù)字表法將80 只小鼠隨機(jī)分為5 組，分別為空白組、失眠模型組、SZRD 低、高劑量組以及地西泮組，每組16 只。除空白組外，其余小鼠在9∶00-10∶00 腹腔注射PCPA 混懸液，連續(xù)2 天，空白組注射弱堿性生理鹽水。

2.2.2 抑郁模型的建立及分組

適應(yīng)性喂養(yǎng)7天后，根據(jù)其體質(zhì)量排序，按照隨機(jī)數(shù)字表法將80 只小鼠隨機(jī)分為5 組，即空白組、抑郁模型組、SZRD低、高劑量組以及逍遙丸組，每組16只。除空白組外，其余小鼠采用孤養(yǎng)聯(lián)合慢性不可預(yù)見(jiàn)性溫和應(yīng)激（Chronic Unpredictable Mild Stress，CUMS）程序刺激的方式建立抑郁癥小鼠模型，CUMS 程序刺激見(jiàn)表1。不可同時(shí)進(jìn)行禁食和禁水刺激；每天隨機(jī)刺激小鼠2 次，每天9：00 準(zhǔn)時(shí)1 次，另1 次時(shí)間隨機(jī)，不連續(xù)選用同一種刺激方法，持續(xù)28天。

表1 CUMS刺激程序

2.3 失眠小鼠模型評(píng)價(jià)

2.3.1 延長(zhǎng)戊巴比妥鈉睡眠時(shí)間實(shí)驗(yàn)

第7 天末次給藥60 min 后，將小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉（50 mg·kg-1）后置于單籠中，記錄其入睡時(shí)間和蘇醒時(shí)間，以翻正反射消失為入睡指標(biāo)，計(jì)算睡眠持續(xù)時(shí)間。

2.3.2 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)

曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)是動(dòng)物模型行為學(xué)研究的常用方法。將每只小鼠放在5×5格、25 cm×25 cm敞口并且四周封閉的黑色曠場(chǎng)行為測(cè)定箱中心位置上，正上方安裝紅外攝像機(jī)全程記錄小鼠活動(dòng)情況，保證實(shí)驗(yàn)環(huán)境安靜且光強(qiáng)度平和。小鼠在曠場(chǎng)箱中央適應(yīng)1 min 后，記錄5 min內(nèi)小鼠穿越總格數(shù)（鼠爪至少有3只在格內(nèi)方可算入），中央格停留時(shí)間以及站立次數(shù)。每次實(shí)驗(yàn)前，用低濃度乙醇噴灑曠場(chǎng)箱除去小鼠氣味。

2.4 抑郁小鼠模型評(píng)價(jià)

2.4.1 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)

具體操作步驟與“2.3.2”相一致。

2.4.2 糖水偏好實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)正式開(kāi)始前1天進(jìn)行糖水訓(xùn)練，同時(shí)放置2%蔗糖水和正常飲用水，分別位于鼠籠的兩側(cè)，每隔8 h調(diào)換水瓶位置，訓(xùn)練48 h 后禁食禁水24 h。同時(shí)給予2%蔗糖水和正常小鼠飲用水，并在1 h 后取出水瓶。精密稱(chēng)量實(shí)驗(yàn)前后水瓶中液體消耗量，計(jì)算糖水偏好度（%）=蔗糖水消耗量（g）/[蔗糖水消耗量（g）+正常飲用水消耗量（g）]×100%。

2.4.3 強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)正式開(kāi)始前1 天對(duì)每只小鼠進(jìn)行游泳訓(xùn)練，采用高25 cm，水溫25℃的圓柱形水桶，使其游泳15 min。正式實(shí)驗(yàn)時(shí)，采用同樣的水桶，小鼠適應(yīng)2 min 后，記錄4 min 內(nèi)被迫漂浮的時(shí)間。當(dāng)小鼠在水中的掙扎動(dòng)作不大于3 s，被迫在水中浮起，只有四肢有微小的動(dòng)作，即可視為不動(dòng)狀態(tài)。

2.5 藥物干預(yù)方法

給藥組給藥時(shí)間為28 天。依照人和小鼠轉(zhuǎn)換的等效劑量因子計(jì)算劑量，SZRD 低、高劑量組按照3.7 g·kg-1·d-1、37 g·kg-1·d-1給藥（相當(dāng)于成人臨床劑量和成人臨床劑量的10 倍），地西泮、逍遙丸組按照1.0275 g·kg-1·d-1、1.8495 g·kg-1·d-1給藥（相當(dāng)于成人臨床劑量），模型組給予等體積的生理鹽水。

2.6 取材方法

第7 天末次給藥后，每組隨機(jī)取半數(shù)小鼠禁食不禁水24 h，脫頸處死，摘取大腦，4℃生理鹽水洗凈，擦干，放入無(wú)菌凍存管中，立即放入液氮冷凍，轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存。第28 天末次給藥后，進(jìn)行行為學(xué)檢測(cè)并將剩余小鼠同上述方法處理。將小鼠大腦解凍，加入冷生理鹽水充分研碎，制成10%的腦組織勻漿，4000 r·min-1離心10 min，取上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）方法按照ELISA 試劑盒操作程序檢測(cè)NE、DA、5-HT的含量。

2.7 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)

2.7.1 酸棗仁湯化學(xué)成分篩選及作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

在TCMSP（https://tcmspw.com/tcmsp.php）數(shù)據(jù)庫(kù)中分別檢索酸棗仁、川芎、知母、甘草和茯苓等5 種中藥的化學(xué)成分，篩選符合口服生物利用度（Oral bioavailability，OB）≥30%、化合物類(lèi)藥性（Druglikeness，DL）≥0.18、血腦屏障透過(guò)率（Blood brain barrier，BBB）≥-0.30 和Caco-2 滲透性預(yù)測(cè)（Caco-2 permeability，Caco-2）>-0.4 的成分[13]，得到SZRD 的潛在活性成分及相關(guān)靶點(diǎn)。在ETCM（http://www.tcmip.cn/ETCM）[14]數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索上述5 味中藥，選取類(lèi)藥性等級(jí)“優(yōu)”的化合物作為活性成分[15]。課題組早期研究中[12]，借助高效液相色譜法（HPLC）對(duì)SZRD 中的斯皮諾素（Spinosin）、芒果苷（Mangiferin）、知母皂苷BII（Timosaponin BII）、阿魏酸（Ferulic Acid）、甘草苷（Liquiritin）、甘草酸銨（Ammonium glycyrrhizate）和酸棗仁皂苷A（jujuboside A）進(jìn)行了含量測(cè)定。此外，通過(guò)查閱中國(guó)藥典和現(xiàn)有文獻(xiàn)（CNKI、PubMed）補(bǔ)充SZRD活性成分。

將ETCM 查找到的活性成分和藥典及文獻(xiàn)補(bǔ)充成分導(dǎo)入Pubchem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/search/）數(shù)據(jù)庫(kù)，查找Canonical SMILES 結(jié)構(gòu)式，在STITCH（http://stitch.embl.de/）和SwissTargetPrediction（http://www.swisstargetprediction.ch/）數(shù)據(jù)庫(kù)中，選擇“Homo sapiens”，預(yù)測(cè)其靶點(diǎn)，將所得靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING（https://cn.string-db.org/）和Uniprot（https://www.uniprot.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)轉(zhuǎn)換為基因名[16]。STITCH 和SwissTargetPrediction 數(shù)據(jù)庫(kù)根據(jù)化學(xué)相似性預(yù)測(cè)靶點(diǎn)；STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)和Uniprot 數(shù)據(jù)庫(kù)可以將復(fù)雜名稱(chēng)的靶標(biāo)轉(zhuǎn)換為簡(jiǎn)短的基因名。

2.7.2 疾病基因的確定

使用 DrugBank（https://www. drugbank. ca）[17]、DisGeNET（https://www.disgenet.org/）[18]和GEO（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）[19]三個(gè)疾病相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索“Insomnia”和“Depression”，收集與失眠、抑郁癥相關(guān)的疾病靶點(diǎn)。DrugBank 數(shù)據(jù)庫(kù)是獨(dú)有的生物信息學(xué)資源平臺(tái)，將藥物數(shù)據(jù)、藥物靶標(biāo)以及疾病基因相結(jié)合；DisGeNET是一個(gè)具有多種來(lái)源的有關(guān)疾病基因及變異的數(shù)據(jù)庫(kù)，涵蓋了人類(lèi)多種疾病和特征、基因和基因組變異；在GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)中，分別選取了與失眠和抑郁癥相關(guān)的基因芯片GSE40562、GSE9116進(jìn)行分析。

2.7.3 酸棗仁湯治療失眠和抑郁癥核心靶點(diǎn)的篩選

利用綜合性生物醫(yī)學(xué)可視化分析平臺(tái)Hiplot（https://hiplot.org）將收集到的失眠和抑郁癥疾病基因分別與SZRD成分靶點(diǎn)求交集，得到SZRD 治療失眠和抑郁癥的重要靶點(diǎn)，導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)中，以“high confidence（0.700）”高置信度為置信度閾值，構(gòu)建重要靶點(diǎn)的蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)，并借助Cytoscape v3.9.1進(jìn)行拓?fù)浞治?，綜合節(jié)點(diǎn)連接度（degree）和介數(shù)中心性（Betweenness Centrality）篩選核心靶點(diǎn)。

2.7.4 生物過(guò)程分析與通路富集分析

分別將酸棗仁湯治療失眠和抑郁癥的核心靶點(diǎn)上傳至DAVID（https://david.ncifcrf.gov/）數(shù)據(jù)庫(kù)[20]進(jìn)行GO和KEGG 富集分析。GO富集分析可以得到基因的生物過(guò)程（Biological Process，BP）、分子功能（Molecular Function，MF）、細(xì)胞定位（Cellular Component，CC）3 種相關(guān)條目。KEGG 富集分析可以預(yù)測(cè)酸棗仁湯發(fā)揮治療作用的相關(guān)通路。

2.7.5 “成分-核心靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

找出成分、核心靶點(diǎn)以及通路的對(duì)應(yīng)關(guān)系后，保存為.xlsx 文件，導(dǎo)入Cytoscape v3.9.1 中構(gòu)建“成分-核心靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)，并進(jìn)行拓?fù)浞治觥?/p>

2.8 數(shù)據(jù)處理

行為學(xué)測(cè)試結(jié)果采用GraphPad Prism 8.0 軟件進(jìn)行繪圖分析，神經(jīng)遞質(zhì)檢測(cè)結(jié)果采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，研究所得數(shù)據(jù)均用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，單因素方差分析（One-way ANOVA）進(jìn)行檢驗(yàn)后，兩組數(shù)據(jù)間比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 行為學(xué)測(cè)試結(jié)果

3.1.1 延長(zhǎng)戊巴比妥鈉睡眠時(shí)間實(shí)驗(yàn)

圖1 顯示，失眠模型組小鼠睡眠時(shí)間明顯減少（P<0.01），SZRD 低、高劑量組和地西泮組可以增加睡眠時(shí)間（P<0.05，P<0.01），并且低劑量組和高劑量組具有顯著性差異（P<0.05）。

圖1 各組小鼠睡眠持續(xù)時(shí)間比較

3.1.2 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)

運(yùn)動(dòng)軌跡平面圖（圖2）顯示，失眠模型組小鼠在曠場(chǎng)箱中進(jìn)入中央?yún)^(qū)域的次數(shù)明顯減少，但穿過(guò)總格數(shù)增加；抑郁模型組小鼠進(jìn)入中央?yún)^(qū)域的次數(shù)同樣減少，同時(shí)穿過(guò)總格數(shù)也減少。

圖2 小鼠運(yùn)動(dòng)軌跡平面圖

失眠模型組小鼠穿過(guò)總格數(shù)和站立次數(shù)比空白組顯著增加（P<0.01），中央格停留時(shí)間顯著減少（P<0.01），酸棗仁湯和地西泮可以改善模型小鼠失眠行為表現(xiàn)（P<0.05，P<0.01），并且低劑量組和高劑量組具有顯著性差異（P<0.05，P<0.01）；抑郁模型組小鼠穿過(guò)總格數(shù)、站立次數(shù)和中央格停留時(shí)間比空白組顯著減少（P<0.01），酸棗仁湯和逍遙丸可以改善模型小鼠抑郁行為表現(xiàn)（P<0.05，P<0.01），并且高劑量組和低劑量組具有顯著性差異（P<0.05，P<0.01），見(jiàn)圖3。

圖3 各組小鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果

3.1.3 糖水偏好實(shí)驗(yàn)

抑郁模型組糖水偏好度明顯降低（P<0.01），SZRD 低、高劑量組和逍遙丸組明顯回升（P<0.05），并且高劑量組和低劑量組具有顯著性差異（P<0.01）（圖4）。

圖4 各組小鼠糖水偏好度比較

3.1.4 強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)

抑郁模型組不動(dòng)時(shí)間明顯增加（P<0.01）；SZRD低、高劑量組和逍遙丸組可以減少不動(dòng)時(shí)間（P<0.01），并且高劑量組和低劑量組具有顯著性差異（P<0.05）（圖5）。

圖5 各組小鼠不動(dòng)時(shí)間比較

3.2 神經(jīng)遞質(zhì)檢測(cè)結(jié)果

3.2.1 酸棗仁湯對(duì)失眠小鼠神經(jīng)遞質(zhì)含量的影響

給藥7天后，失眠模型組小鼠5-HT含量明顯降低（P<0.01），NE、DA 含量升高（P<0.05，P<0.01）；SZRD低、高劑量組和地西泮組5-HT 含量升高（P<0.05，P<0.01），NE、DA 含量降低（P<0.05，P<0.01）。給藥28 天后，失眠模型組小鼠5-HT 含量降低（P<0.01），NE、DA含量升高（P<0.01）；SZRD 低、高劑量組和地西泮組5-HT 含量升高（P<0.01），NE、DA 含量顯著降低（P<0.05，P<0.01）。見(jiàn)表2、3。

表2 SZRD對(duì)失眠小鼠NE、DA、5-HT含量的影響（±s，n=8，7天）

表2 SZRD對(duì)失眠小鼠NE、DA、5-HT含量的影響（±s，n=8，7天）

注：與空白組比較，#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

5-HT（pg·mL-1）292.70±15.00 266.74±17.63##283.16±4.94*290.70±9.27**293.82±9.53**組別空白組失眠模型組SZRD低劑量組SZRD高劑量組地西泮組NE（pg·mL-1）158.08±16.27 174.73±7.95#165.47±7.11*163.82±10.78*162.38±11.54*DA（pg·mL-1）46.89±2.84 55.00±3.78##52.03±4.44 50.30±2.68*47.96±3.96**

表3 SZRD對(duì)失眠小鼠NE、DA、5-HT含量的影響（±s，n=8，28天）

表3 SZRD對(duì)失眠小鼠NE、DA、5-HT含量的影響（±s，n=8，28天）

注：與空白組比較，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

5-HT（pg·mL-1）263.56±10.04 235.98±7.01##261.40±10.1**247.41±5.59**262.05±9.14**組別空白組失眠模型組SZRD低劑量組SZRD高劑量組地西泮組NE（pg·mL-1）137.45±6.56 157.99±6.17##142.31±5.64**150.89±4.62*140.03±4.40**DA（pg·mL-1）44.08±2.73 54.13±5.49##47.09±2.81**51.35±1.85 45.84±1.88**

3.2.2 酸棗仁湯對(duì)抑郁小鼠神經(jīng)遞質(zhì)含量的影響

給藥7 天后，抑郁模型組5-HT、DA、NE 的含量明顯降低（P<0.01）。SZRD 低、高劑量組和逍遙丸組與抑郁小鼠相比5-HT、DA、NE 的含量明顯回升（P<0.01）。給藥28 天后，抑郁模型組5-HT、DA、NE 的含量明顯降低（P<0.01）；SZRD 低、高劑量組和逍遙丸組5-HT、DA、NE 的含量升高（P<0.05，P<0.01）。見(jiàn)表4、5。

表4 SZRD對(duì)抑郁小鼠NE、DA、5-HT含量的影響（±s，n=8，7天）

表4 SZRD對(duì)抑郁小鼠NE、DA、5-HT含量的影響（±s，n=8，7天）

注：與空白組比較，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

組別空白組抑郁模型組SZRD低劑量組SZRD高劑量組逍遙丸組5-HT（pg·mL-1）294.70±18.81 246.16±5.00##263.16±7.16**282.26±8.65**290.74±8.35**NE（pg·mL-1）139.18±6.81 122.41±4.33##127.59±3.38*130.33±5.93**134.11±4.45**DA（pg·mL-1）49.06±1.48 42.45±1.54##44.11±1.29*46.31±0.93**48.50±2.60**

表5 SZRD對(duì)抑郁小鼠NE、DA、5-HT含量的影響（±s，n=8，28天）

表5 SZRD對(duì)抑郁小鼠NE、DA、5-HT含量的影響（±s，n=8，28天）

注：與空白組比較，##P<0.01；與模型組比較，**P<0.01。

組別空白組抑郁模型組SZRD低劑量組SZRD高劑量組逍遙丸組5-HT（pg·mL-1）329.47±16.62 263.01±10.82##289.19±8.73**318.45±9.66**322.34±15.16**NE（pg·mL-1）169.84±14.36 143.04±7.14##153.76±5.11**166.00±11.42**168.03±13.51**DA（pg·mL-1）60.35±2.04 47.04±1.77##49.94±1.90**55.23±2.14**58.17±2.93**

3.2.3 低、高劑量酸棗仁湯對(duì)神經(jīng)遞質(zhì)含量的影響

從圖6 可以看出，給藥28 天后，低劑量SZRD 更顯著地回調(diào)由失眠引起的NE、DA 以及5-HT 的含量變化（P<0.01）；高劑量SZRD 更顯著地回調(diào)由抑郁癥引起的NE、DA 以及5-HT 的含量變化（P<0.05，P<0.01）。并且借助MetaboAnalyst 5.0 平臺(tái)（https://www.metaboanalyst.ca/）對(duì)模型組和低、高劑量SZRD 組進(jìn)行可視化分析，見(jiàn)圖7。熱圖顯示，低、高劑量組都能在一定程度上回調(diào)神經(jīng)遞質(zhì)的含量，但低劑量SZRD 可以更明顯地回調(diào)由失眠引起的神經(jīng)遞質(zhì)變化，高劑量回調(diào)由抑郁癥引起的神經(jīng)遞質(zhì)變化更明顯。

圖6 低、高劑量SZRD對(duì)神經(jīng)遞質(zhì)含量的影響

圖7 模型組、低劑量和高劑量組神經(jīng)遞質(zhì)含量變化熱圖分析

3.3 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

3.3.1 酸棗仁湯化學(xué)成分以及作用靶點(diǎn)篩選

通過(guò)TCMSP和ETCM數(shù)據(jù)庫(kù)的篩選，合并補(bǔ)充成分刪去重復(fù)值后共得到SZRD中化學(xué)成分151個(gè)，見(jiàn)表6。將SZRD 中各藥物和成分導(dǎo)入Cytoscape v3.9.1 中構(gòu)建“藥物-成分”網(wǎng)絡(luò)，見(jiàn)圖8。SZRD 靶點(diǎn)經(jīng)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索去除重復(fù)項(xiàng)后共得到238個(gè)。

表6 SZRD部分活性成分信息

3.3.2 疾病基因獲取

在DrugBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中分別檢索“Insomnia”和“Depression”，得到141 個(gè)失眠相關(guān)基因和123 個(gè)抑郁癥相關(guān)基因。在DisGeNET 數(shù)據(jù)庫(kù)中，共得到61 個(gè)失眠相關(guān)基因和1354 個(gè)抑郁癥相關(guān)基因。在GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)中，選取P≤0.05的基因，并以logFC=±1為閾值，得到50個(gè)失眠顯著差異表達(dá)基因和702個(gè)抑郁癥差異表達(dá)基因。合并所得疾病基因，刪除重復(fù)項(xiàng)后得到241 個(gè)失眠相關(guān)基因和2061個(gè)抑郁癥相關(guān)基因。

3.3.3 核心靶點(diǎn)的篩選

將SZRD 成分靶點(diǎn)與失眠、抑郁癥疾病基因求交集，見(jiàn)圖9，分別得到54、112個(gè)重要靶點(diǎn)。將上述關(guān)鍵靶點(diǎn)上傳至STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)，并導(dǎo)入Cytoscape v3.9.1中構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治?，通過(guò)Network Analsis功能分析PPI 網(wǎng)絡(luò)拓?fù)渲笜?biāo)，以節(jié)點(diǎn)連接度的中位數(shù)值和介數(shù)中心性≥0.01 篩選出SZRD 治療失眠的核心靶點(diǎn)18個(gè)，治療抑郁癥的核心靶點(diǎn)34個(gè)，見(jiàn)表7。

圖9 SZRD成分靶點(diǎn)與疾病基因韋恩圖

表7 SZRD治療失眠、抑郁癥前10個(gè)核心靶點(diǎn)

3.3.4 GO功能富集分析

通過(guò)DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)SZRD 治療失眠的核心靶點(diǎn)進(jìn)行GO 分析，結(jié)果顯示19 項(xiàng)與生物過(guò)程（BP）有關(guān)，包括對(duì)外源性刺激的反應(yīng)、突觸傳遞、對(duì)可卡因的反應(yīng)等過(guò)程；5 項(xiàng)與分子功能（MF）有關(guān)，體現(xiàn)在多巴胺神經(jīng)遞質(zhì)受體活性、多巴胺結(jié)合、單胺跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性等；細(xì)胞定位（CC）檢索出10 個(gè)條目，包含了突觸前膜、突觸后膜、神經(jīng)元投射等。選取前5項(xiàng)條目作圖分析，見(jiàn)圖10。

圖10 SZRD治療失眠核心靶點(diǎn)GO分析

SZRD 治療抑郁癥的核心靶點(diǎn)GO 分析顯示，68項(xiàng)條目與生物過(guò)程（BP）有關(guān)，包括細(xì)胞對(duì)鎘離子的反應(yīng)、基因表達(dá)的正調(diào)控、細(xì)胞對(duì)活性氧的反應(yīng)等過(guò)程；18項(xiàng)與分子功能（MF）有關(guān)，體現(xiàn)在MAP激酶活性、多巴胺神經(jīng)遞質(zhì)受體活性、多巴胺結(jié)合等；細(xì)胞定位（CC）檢索出12個(gè)條目，包括谷氨酸能突觸、RNA 聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物、突觸后膜等。選取前5 項(xiàng)條目作圖分析，見(jiàn)圖11。

圖11 SZRD治療抑郁癥核心靶點(diǎn)GO分析

3.3.5 KEGG通路富集分析

KEGG 通路富集分析顯示，SZRD 治療失眠與12 項(xiàng)通路有關(guān)，其中包括cGMP-PKG 信號(hào)通路、可卡因成癮、cAMP 信號(hào)通路、多巴胺能突觸等；SZRD 治療抑郁癥的核心靶點(diǎn)經(jīng)過(guò)分析得到116 項(xiàng)通路，包括脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化、IL-17 信號(hào)通路、化學(xué)致癌作用-活性氧、多巴胺能突觸等。選取前10條通路進(jìn)行作圖分析，見(jiàn)圖12、13。

圖12 SZRD治療失眠核心靶點(diǎn)KEGG通路富集分析氣泡圖

圖13 SZRD治療抑郁癥核心靶點(diǎn)KEGG通路富集分析氣泡圖

3.3.6 “成分-核心靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)

在Cytoscape v3.9.1 中構(gòu)建“成分-核心靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果如圖14所示。進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治龊螅鶕?jù)degree 值大小排名篩選出SZRD 發(fā)揮治療作用的前5 個(gè)相關(guān)靶點(diǎn)，見(jiàn)表8。結(jié)果顯示，SZRD 作用于CALM2、ADRB2、ADRA1B、SLC6A3、ADRA1D 發(fā)揮其治療失眠的作用；SZRD 治療抑郁癥可能與PTGS2、CALM2、HSP90AA1、PPARG、GSK3B有關(guān)。

圖14 “成分-核心靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)

表8 “成分-核心靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)的前5個(gè)核心靶點(diǎn)

4 結(jié)論

本研究通過(guò)行為學(xué)實(shí)驗(yàn)和神經(jīng)遞質(zhì)含量測(cè)定表明，酸棗仁湯具有促進(jìn)睡眠和抗抑郁的作用，并且這種作用與其劑量相關(guān)，低劑量治療失眠、高劑量治療抑郁癥時(shí)可以發(fā)揮更好的療效。借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法預(yù)測(cè)出酸棗仁湯可能通過(guò)cGMP-PKG 信號(hào)通路發(fā)揮其促進(jìn)睡眠的作用，并且這種作用與CALM2、ADRB2、ADRA1B、SLC6A3、ADRA1D 等靶點(diǎn)密切相關(guān)；酸棗仁湯發(fā)揮抗抑郁作用可能與IL-17 信號(hào)通路有關(guān)，作用于PTGS2、CALM2、HSP90AA1、PPARG、GSK3B 等靶點(diǎn)。同時(shí)，藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果表明，多巴胺能突觸與單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)的變化密切相關(guān)，在失眠和抑郁癥的發(fā)生以及治療中發(fā)揮著重要的作用。

5 討論

本研究結(jié)果表明，酸棗仁湯具有促進(jìn)睡眠、抗抑郁的作用，并且這種作用與其劑量相關(guān)。首先，通過(guò)藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)闡明酸棗仁湯可以改善模型小鼠失眠、抑郁行為，并且失眠、抑郁模型小鼠腦組織中NE、DA 和5-HT 的含量變化并不一致，酸棗仁湯的干預(yù)作用也存在差異。其次，通過(guò)借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，預(yù)測(cè)酸棗仁湯治療失眠和抑郁癥的核心靶點(diǎn)，分別篩選出18 和34 個(gè)核心靶點(diǎn)，將核心靶點(diǎn)進(jìn)行GO 和KEGG 富集分析。最后構(gòu)建“成分-核心靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)，并進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治觥＝?jīng)過(guò)分析篩選出治療失眠的5個(gè)核心靶點(diǎn)CALM2、ADRB2、ADRA1B、SLC6A3、ADRA1D以及治療抑郁癥的核心靶點(diǎn)PTGS2、CALM2、HSP90AA1、PPARG、GSK3B。

KEGG 富集分析顯示，SZRD 治療失眠與cGMPPKG 信號(hào)通路密切相關(guān)。cGMP-PKG 信號(hào)通路中的環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷（Cyclic guanosine monophosphate，cGMP）可被G 蛋白偶聯(lián)受體活化發(fā)揮信息傳遞作用，參與細(xì)胞膜離子通道的開(kāi)啟、糖原分解以及細(xì)胞凋亡等[27]。很多存在于腦中的神經(jīng)遞質(zhì)，包括5-HT，多巴胺，γ-氨基丁酸和谷氨酸等，通常作用于G 蛋白偶聯(lián)受體發(fā)揮作用。因此，cGMP-PKG 信號(hào)通路參與了復(fù)雜的中樞神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)過(guò)程，在控制神經(jīng)元興奮性與高級(jí)神經(jīng)功能中具有重要作用[28]。IL-17 信號(hào)通路與神經(jīng)炎癥有關(guān)，其中的白介素-17（IL-17）是一種促炎細(xì)胞因子，可以促進(jìn)T 細(xì)胞的激活，介導(dǎo)組織炎癥反應(yīng)[29]。動(dòng)物研究表明，反復(fù)的環(huán)境應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)遞質(zhì)調(diào)節(jié)失調(diào)[30]，產(chǎn)生抑郁樣行為，導(dǎo)致血液和大腦中促炎癥細(xì)胞因子表達(dá)增加[31]。神經(jīng)炎癥在抑郁癥的發(fā)生中起著關(guān)鍵作用，抑郁癥與慢性炎癥性疾病具有較高的共患病率，包括心血管疾病、糖尿病和癌癥等，長(zhǎng)期的炎癥過(guò)程是這些全身性疾病發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因素[32]。因此，IL-17信號(hào)通路在SZRD 治療抑郁癥的過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。

在SZRD 治療失眠和抑郁癥的KEGG 富集分析中，均富集出了多巴胺能突觸這一條通路，表明該通路在失眠和抑郁癥的治療中發(fā)揮著重要的作用。多巴胺能突觸與多巴胺的釋放密切相關(guān)，多巴胺作為NE 合成的前身，調(diào)控著中樞神經(jīng)系統(tǒng)的多種生理功能，在自主運(yùn)動(dòng)和學(xué)習(xí)記憶中起著重要的生理作用，并且參與多種神經(jīng)疾病的發(fā)生[33]。因此，通過(guò)研究NE、DA 和5-HT 的含量變化，一定程度上驗(yàn)證了多巴胺能突觸參與了失眠和抑郁癥的發(fā)生。單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)NE、DA 以及5-HT 參與人和動(dòng)物多種精神活動(dòng)的調(diào)節(jié)，是腦內(nèi)重要的神經(jīng)遞質(zhì)，眾多研究認(rèn)為，多種神經(jīng)精神疾病的發(fā)生與腦內(nèi)單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)的水平有關(guān)[34]。本研究在前期工作基礎(chǔ)上，認(rèn)為酸棗仁湯可能通過(guò)調(diào)節(jié)腦內(nèi)NE、DA 和5-HT 的含量，表現(xiàn)出治療失眠、抗抑郁的作用。藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)表明，失眠、抑郁模型小鼠腦組織中NE、DA、5-HT 的含量變化并不一致，SZRD 在發(fā)揮治療作用時(shí)存在差異，低劑量干預(yù)失眠模型小鼠，高劑量干預(yù)抑郁模型小鼠可以更好地發(fā)揮療效。酸棗仁湯促進(jìn)睡眠、抗抑郁作用與腦組織中NE、DA、5-HT 的表達(dá)有關(guān)，并且cGMP-PKG 信號(hào)通路和IL-17 信號(hào)通路可能也參與了這種作用，后續(xù)課題組將進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究驗(yàn)證。