基于網(wǎng)絡(luò)藥理及動物實驗研究盧健棋教授強心湯治療慢性心力衰竭分子機制＊

林 浩，盧健棋，熊 沖，王光耀，吳曉東，龐 延＊＊

（1. 儋州市中醫(yī)醫(yī)院 儋州 571700；2. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 南寧 530000；3. 南昌市洪都中醫(yī)院 南昌 330000）

慢性心力衰竭（Chronic heart failure，CHF）是一組因心臟功能或結(jié)構(gòu)異常導(dǎo)致射血功能受損或心室過度充盈為特征的臨床綜合征，通常為各類心臟疾病的嚴重或末期階段，在臨床表現(xiàn)上以呼吸困難、液體潴留（外周水腫、體循環(huán)淤血與肺淤血）及疲乏等癥狀最為常見[1]。盡管隨著CHF 的標準化西醫(yī)治療方案不斷更新和進步，CHF 患者的生存率及住院率得到一定改善，但遠期預(yù)后仍不理想[2-3]。隨著祖國中醫(yī)藥的不斷發(fā)展，目前在改善心衰評價指標及心血管復(fù)合終點事件相關(guān)指標（因心衰入院、心衰惡化需靜脈用藥、死亡、心臟驟停行心肺復(fù)蘇、心衰惡化患者放棄治療）等領(lǐng)域成果顯著。鑒于此，中醫(yī)治療方案也被添加至《2018年中國心力衰竭診斷和治療指南》[4-5]。

中醫(yī)認為“心主血脈”，心氣和即可促進血行，血行通暢，全身形體官竅得以滋養(yǎng)。若心氣疲乏，血行無力，無法榮養(yǎng)形神，可見乏力、喘息，勞則加重，且陽氣耗損久之而致陽虛，日久累其陰，陰陽俱虛而生心衰病。廣西名老中醫(yī)、岐黃學(xué)者盧健棋教授提出，CHF的發(fā)病機制主要以本虛標實為主，病機之本為氣虛，標為瘀、水、痰，并且在CHF 的整個形成及進程中發(fā)揮重要作用。因此，益氣、溫陽、活血、利水等法常作為CHF 的基本治則，但結(jié)合嶺南地域高濕高溫的環(huán)境特點，易聚濕生痰，同時此地飲食上偏嗜肥甘厚味，多種因素致使患者體內(nèi)痰、水、濕等濁邪的蘊結(jié)難以化解，久病不愈。鑒于此，盧教授結(jié)合多年臨證經(jīng)驗，在前基本治則上加之祛瘀濕毒、通調(diào)水道之法，并以此為理論創(chuàng)立強心湯。方中由黃芪、黨參、柏子仁、炙甘草、桂枝、熟附子、玉竹、丹參、葶藶子、茯苓、川芎、白術(shù)等中藥組成，全方合用則能瞬息化氣于烏有之鄉(xiāng)，頃刻生陽于命門之內(nèi)，具有益氣溫陽、活血利水、通調(diào)祛濁之功。溫志浩等[6]探討了強心湯治療CHF 氣虛血瘀證患者的療效，在常規(guī)西藥基礎(chǔ)上加用強心湯的75例患者在生存質(zhì)量內(nèi)容中的生理功能、角色限制和活力等3 個維度明顯優(yōu)于僅應(yīng)用西藥常規(guī)的對照組。強心膠囊是以強心湯處方用法為基礎(chǔ)結(jié)合組成藥物有效成分的性質(zhì)，進行水提正交實驗、稠膏濃縮、滅菌工藝研究、成型工藝實驗等嚴密工藝所制，在臨床中廣泛應(yīng)用，其高效、低毒、方便的優(yōu)點并獲得廣大患者肯定[7]。

由于中藥具有多化合物、多靶點的特點，很難全面闡明其潛在作用機制。由于存在協(xié)同機制，天然草藥一般由幾十種甚至上百種可針對多個目標的成分組成[8]。因此，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方法與中醫(yī)學(xué)的特點無縫銜接，該方法結(jié)合了中醫(yī)遺傳表型疾病的多層次信息，可用于揭示基于復(fù)雜生物系統(tǒng)的中藥方劑作用機制和科學(xué)依據(jù)[9]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是大數(shù)據(jù)時代發(fā)展下的產(chǎn)物，此新興學(xué)科集合了藥理學(xué)、分子生物學(xué)、系統(tǒng)生物學(xué)與各類網(wǎng)絡(luò)計算平臺，其由宏觀層次至微觀層次開展多層網(wǎng)絡(luò)篩選與構(gòu)建，依托多種數(shù)據(jù)庫平臺與計算機軟件實現(xiàn)數(shù)據(jù)的可視化，能夠?qū)χ兴幏絼┖图膊〉年P(guān)聯(lián)性做出更為直觀的剖析，即多靶點、多分子和多通路分子機制[10-11]。鑒于此，清華大學(xué)的李梢等研究者更是倡議使用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探索中藥作用機制并制定了評價指南[12-13]。分子對接，即基于受體特性，經(jīng)由受體與藥物分子間的相互作用對其結(jié)合模式與親和力進行預(yù)測的一類技術(shù)[14]。本文擬借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對接技術(shù)，對強心湯治療CHF 的潛能進行挖掘，并采用動物實驗驗證部分靶點及信號通路，對強心湯治療CHF 的療效及其相關(guān)作用機制進行剖析。

1 材料

1.1 動物

清潔級健康雄性SPF級大鼠40只，6-8周齡，體質(zhì)量（230±20）g，購自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，許可證號SCXK（京）2019-0010。在溫度20-26℃，濕度40%-70%通風(fēng)干凈的環(huán)境中飼養(yǎng)。本研究符合廣西中醫(yī)藥大學(xué)動物倫理委員會相關(guān)規(guī)定，倫理號：DW20220511-078。

1.2 藥物

強心湯組方：湖南省宋齡堂中藥飲片有限公司：黨參15 g（批號20210801）、炮附片（先煎）10 g（批號20200618）、川芎10 g（批號20210401）、丹參10 g（批號20200701）、葶藶子10 g（批號20200701）、茯苓10 g（批號20210801）、玉竹10 g（批號20210701）、白術(shù)10 g（批號20210801）；亳州市京皖中藥飲片廠：黃芪30 g（批號20210601）；海南國瑞堂中藥制藥有限公司：桂枝10 g（批號20210801）；廣東匯群中藥飲片股份有限公司：柏子仁（打）12 g（批號20210401）、炙甘草6 g（批號20210201）。在藥物中加入適量水使總?cè)萘孔? L，通過煎煮、濾過制成0.665 g·mL-1的煎煮液?？ㄍ衅绽▏幖瘓F汕頭金石制藥有限公司，批號220215，規(guī)格：25 mg/片）。

1.3 試劑和儀器

高效RIPA 組織裂解液（Solarbio，貨號：R0024）、BCA 法蛋白濃度測定試劑盒（Solarbio，貨號：PC0036）、脫脂奶粉（Solarbio，貨號：D8350）、ECL 化學(xué)發(fā)光底物（超敏）（Biosharp，貨號：BL548A）、內(nèi)參一抗Mouse Anti-GAPDH（TransGen Biotech，貨號：HC301）、二抗HRP conjugated Goat Anti-Mouse IgG（H+L）（Servicebio，貨號：GB23301），STAT3、p-STAT3、MAPK1、p-MAPK1 抗體（Cell Signaling Technology，貨號分別為9142、9146、4655、4360）；IL6 抗體（Santacruz，貨號：52646）；低溫離心機（eppendorf，型號：5418R）、恒溫水浴鍋（上海齊欣，型號：HWS-28）、電泳儀（PowerPacTMBasic，型號：Bio-Rad），凝膠成像儀（型號：Fusion FX5 Spectra，Vilber），臺式恒溫培養(yǎng)振蕩器搖床（空氣）（上海智誠，型號：ZWYR-2102C）。

2 資料與方法

2.1 強心湯關(guān)鍵活性成分檢索及篩選

經(jīng)TCMSP（網(wǎng)址為https://tcmspw.com）數(shù)據(jù)庫對強心湯成分分別進行檢索：黃芪、熟附子、黨參、桂枝、玉竹、茯苓、白術(shù)、丹參、川芎、柏子仁、葶藶子、炙甘草，查詢強心湯組成的相關(guān)化學(xué)成分。此中藥湯劑為口服，故設(shè)置藥代動力學(xué)參數(shù)（ADME）：藥物口服生物利用度（OB）≥30%，藥物相似度（DL）≥0.18[15]，以此為標準篩選出強心湯中組成的重要活性化合物。并通過檢索相關(guān)文獻，統(tǒng)計、記錄，將雖未出現(xiàn)于上述數(shù)據(jù)庫或OB、DL不滿足上述標準，但有研究證實與CHF相關(guān)的化學(xué)成分也計為重要活性化合物，綜上，獲得強心湯組成的重要活性化合物數(shù)據(jù)庫。

2.2 強心湯組成相關(guān)作用靶點的獲取

通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫和STITCH 數(shù)據(jù)庫查詢強心湯各中藥組分中重要活性化合物的作用靶標。其中STITCH 數(shù)據(jù)庫檢索物種為“Homosapiens”，置信度>0.4。將TCMSP和STITCH數(shù)據(jù)庫中獲取的靶點基因進行并集，剔重，同時刪除沒有相關(guān)靶標的化學(xué)成分，使用UniProt數(shù)據(jù)庫查詢蛋白質(zhì)的標準基因名，并對靶點基因統(tǒng)一化，最后統(tǒng)計出強心湯的靶點基因數(shù)據(jù)庫。

2.3 CHF相關(guān)靶點的獲取與篩選

檢索數(shù)據(jù)庫OMIM（網(wǎng)址https://www.omim.org）、DisGeNET（網(wǎng)址http://www.disgenet.org）與GeneCards（網(wǎng)址https://www.genecards.org）等，以“chronicheartfailure”為檢索詞，查詢與CHF 相關(guān)的靶點蛋白。搜索完成后選出Relevance score>20 的靶點基因，將3 個數(shù)據(jù)庫中的靶點信息進行合并、去重，導(dǎo)入UniProt 數(shù)據(jù)庫獲得標準化的蛋白質(zhì)靶點信息。

2.4 “成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

將2.2 中的強心湯藥物組成成分作用靶點基因與2.3中的CHF 疾病靶點基因?qū)霐?shù)據(jù)庫Venny2.1.0（網(wǎng)址為https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/），得到強心湯治療CHF 的作用交集靶點。為進一步明確強心湯治療CHF 的核心活性成分，將獲取的強心湯組成的重要活性成分及上述交集靶點導(dǎo)入Cytoscape3.6.1，構(gòu)建“成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)，并進行相關(guān)拓撲學(xué)分析。在此類網(wǎng)絡(luò)圖中，節(jié)點（node）表示活性成分或者作用靶點，邊（edge）表示活性成分與靶點之間相互關(guān)系，與節(jié)點直接相連的其他節(jié)點的數(shù)目稱為該節(jié)點的度值（degree），節(jié)點的度值越大，說明該節(jié)點所代表的活性成分或者靶點在交集網(wǎng)絡(luò)中越重要。本研究以活性成分在網(wǎng)絡(luò)中的度值水平分析強心湯治療CHF 的核心活性成分。

2.5 強心湯靶點-CHF 靶點的蛋白互作（Proteinproteininteraction，PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

向STRING（網(wǎng)址為http://string.db.org）平臺導(dǎo)入強心湯和CHF 的交集靶點，完成PPI 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建。將最低互作評分值設(shè)置為0.900，隱藏孤立蛋白，下載tsv文件，并通過Cytoscape3.6.1 對結(jié)果進行拓撲學(xué)分析。為了使結(jié)果更直觀，研究以節(jié)點大小和顏色深淺表示度值大小，依據(jù)度值大小篩選出強心湯治療CHF 的核心靶點。

2.6 強心湯治療CHF相關(guān)作用靶點的GO和KEGG富集分析

為了研究強心湯治療CHF 靶點的主要生物基因功能及KEGG 代謝通路，將強心湯與CHF 的共同作用靶點蛋白導(dǎo)入DAVID6.8（https://david.ncifcrf.gov）數(shù)據(jù)庫，設(shè)置閾值P<0.05，對強心湯治療CHF 的靶基因開展GO（基因功能注釋分析）、KEGG（京都基因組百科全書）通路富集分析。以生物過程（BP）、分子功能（MF）以及細胞組分（CC）對強心湯治療CHF 的靶點進行GO 生物過程富集分析。以P對GO 過程及KEGG通路進行功能排序，分別選取前20 位用微生信軟件（http://www.bioinformatics.com.cn）進行可視化分析，綜合預(yù)測強心湯治療CHF的分子作用機制。

2.7 分子對接技術(shù)預(yù)測強心湯核心成分與作用靶點的結(jié)合能力

采用分子對接技術(shù)驗證強心湯治療CHF 的核心活性成分與主要作用靶點之間的相互作用關(guān)系。通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫查找核心活性成分的mol2 分子結(jié)構(gòu)，將結(jié)果導(dǎo)入AutoDockTools 數(shù)據(jù)庫；通過PDB（https://www.rcsb.org）數(shù)據(jù)庫查詢后，下載主要作用靶點的PDB格式文件，兩次結(jié)果輸出均為pdbqt格式。最后將2個文件導(dǎo)入AutoDockVina軟件，檢驗結(jié)合活性。當(dāng)結(jié)合能<-4.25 kcal·mol-1時，表示強心湯核心活性分子與核心作用靶點可以結(jié)合，但結(jié)合水平較弱；當(dāng)結(jié)合能<-5.0 kcal·mol-1時，表示強心湯核心活性分子與核心作用靶點結(jié)合的比較好；當(dāng)結(jié)合能<-7.0 kcal·mol-1時，表明強心湯核心活性分子與核心作用靶點之間的結(jié)合極為強烈。為直觀的展示配體與蛋白之間的相互作用，本研究選取3 組結(jié)合能較低的活性組分與核心靶點構(gòu)建分子對接模式圖。

2.8 動物造模、分組及給藥

將大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，按隨機數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組、卡托普利組、強心湯低劑量組、強心湯高劑量組（每組8 只），采用結(jié)扎大鼠左冠狀動脈前降支法建立AMI 后CHF 模型[16]。大鼠稱取體質(zhì)量，腹腔麻醉固定在鼠板上。四肢皮下固定針形心電極，持續(xù)心電監(jiān)護，氣管切開，連接呼吸機。沿肋骨走向作橫切口，打開肋間肌，暴露心臟，挑破心包膜后，用6-0 絲線在距左心耳下緣約2 mm 處結(jié)扎左冠狀動脈前降支，觀察生理記錄儀，以心電圖出現(xiàn)ST 段弓背向上抬高為AMI 模型的成功標志。術(shù)后層層關(guān)胸，消毒，撤去儀器，編號，蘇醒后送回鼠籠。假手術(shù)組穿線但不結(jié)扎冠狀動脈。術(shù)后2 周后予心臟彩超檢測，射血分數(shù)（EF）值下降20%-30%可判斷為AMI后CHF模型成功。強心湯組通過將強心湯組成水煮醇沉標準工藝制成濃縮煎劑，參考《實驗動物學(xué)》[17]進行換算，強心湯高濃度組每只大鼠按12.25 g·kg-1強心湯混懸液罐胃，強心湯低濃度組強心湯高濃度組每只大鼠按6.125 g·kg-1強心湯混懸液罐胃，卡托普利組每只大鼠按10.38 mg·kg-1卡托普利混懸液罐胃；假手術(shù)組與模型組均予等量生理鹽水灌胃，每組每日灌胃2次，持續(xù)28天。術(shù)后第4周完成心臟彩超檢查后頸椎脫位處死實驗動物，再將心臟取出，對全心、心室與左心室的重量進行稱定并記錄。與左心室長軸保持垂直，對其行切片操作，厚度為2 mm，根據(jù)后續(xù)用于制作相應(yīng)標本并保存。

2.9 Western blot法檢測蛋白表達水平

干預(yù)28天對各組大鼠進行安樂死，選取各組大鼠左心室組織置入液氮內(nèi)取出，裂解、研磨、離心取上清液；根據(jù)BCA 蛋白定量試劑盒說明測定蛋白濃度，經(jīng)壓膠、濃縮凝固、電泳后，用配制好的5%脫脂奶粉作為封閉液，按各抗體說明書的推薦比例使用封閉液將一抗進行稀釋和孵育以及洗膜3 次，再進行二抗孵育后，使用ECL 顯色劑對膜進行顯色，于凝膠成像系統(tǒng)中進行曝光成像，使用Image J 1.52對條帶進行定量分析，各指標灰度值通過GAPDH 均一化后，計算蛋白相對表達量。

3 統(tǒng)計學(xué)分析

使用GraphPad Prism 8.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，結(jié)果用均數(shù)±標準差（±s）描述，組間對比實施單因素ANOVA（方差分析）。具顯著區(qū)別的條件為P<0.05。

4 結(jié)果

4.1 強心湯組成重要活性成分及靶點的獲取

在TCMSP 數(shù)據(jù)庫中初步檢索到強心湯組成中OB與DL 符合要求的有：黃芪（20 個）、熟附子（21 個）、黨參（21 個）、桂枝（7 個）、玉竹（8 個）、茯苓（15 個）、白術(shù)（7 個）、丹參（65 個）、川芎（7 個）、柏子仁（5 個）、葶藶子（12個）、炙甘草（92個），篩除重復(fù)有效活性成分，共得到強心湯組成有效活性成分254 個，各中藥組成成分及靶點信息見表1。通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫與STITCH數(shù)據(jù)庫共獲取強心湯組成成分作用靶點2936個，篩除重復(fù)值之后獲得強心湯組成成分作用靶點256個。使用Cytoscape 3.6.0 軟件構(gòu)建“強心湯組成-重要化合物-靶點”網(wǎng)絡(luò)，見圖1，每條邊則表示強心湯各中藥組成所含化合物及化合物與靶點之間的相互作用關(guān)系。篩選出degree排名前10位的化合物及其信息見表2。

圖1 強心湯組成-重要化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)圖

表1 強心湯各中藥組成的成分數(shù)目及其作用靶點數(shù)目

表2 強心湯組成重要活性成分

4.2 CHF相關(guān)靶點的獲取

在GeneCards、DisGeNET、OMIM 等數(shù)據(jù)庫分別獲得CHF靶點（578個）、（223個）、（579個）。合并3個數(shù)據(jù)庫中的靶點，刪除重復(fù)，最終得到CHF相關(guān)靶點（1229）個。

4.3 “成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

通過Venny2.1.0 平臺得到強心湯與CHF 的交集靶點（100）個，見圖2，對應(yīng)強心湯的化合物（185）個。利用Cytoscape3.6.1 構(gòu)建“成分-靶點”的可視化網(wǎng)絡(luò)，見圖3。網(wǎng)絡(luò)中共有285 個節(jié)點（化合物185 個，靶點100 個），80940 條相互作用的邊。拓撲學(xué)分析結(jié)果顯示，強心湯組成中潛在靶點數(shù)目排名靠前的活性成分為槲皮素（Quercetin）、山柰酚（Kaempferol）、木犀草素（Luteolin）、丹參酮（Tanshinone Iia）與柚皮素（Naringenin），推測這5 種成分可能是強心湯治療CHF的關(guān)鍵成分。

圖2 強心湯和CHF的交集靶點

圖3 強心湯重要組成成分-交集靶點網(wǎng)絡(luò)

4.4 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

通過STRING 平臺與Cytoscape3.6.1 軟件生成PPI網(wǎng)絡(luò)，見圖4。圖中共有84 個節(jié)點（其中16 個蛋白未參與相互作用），6972 條邊。節(jié)點的顏色越深，面積越大，其節(jié)點度值越大。結(jié)果顯示，度值排名靠前的靶點為STAT3[18]、RELA[19]、AKT1[20]、MAPK1[21]及IL6[22]，可推斷為強心湯治療CHF的核心作用靶點。

圖4 強心湯和CHF相關(guān)靶點蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)PPI圖

4.5 GO和KEGG富集分析

通過DAVID 數(shù)據(jù)庫中的GO 分析獲得GO 條目617 個，其中BP 條目、CC 條目、MF 條目分別為480 個、59 個及78 個，每個種類分別選取前20項進行可視化，并繪制出GO 富集分析條形圖，見圖5。結(jié)果表明，強心湯治療CHF 的靶點主要集中于細胞因子介導(dǎo)的信號通路、基因表達的正向調(diào)控、對缺氧的反應(yīng)、對脂多糖的反應(yīng)及對藥物的反應(yīng)等生物過程，細胞外空間、細胞外區(qū)、質(zhì)膜的組成部分、膜筏與小窩等細胞組分以及相同的蛋白質(zhì)結(jié)合、酶結(jié)合、蛋白質(zhì)同二聚化活性、蛋白質(zhì)結(jié)合、細胞因子活性等分子功能上。KEGG分析得到細胞信號通路144 條，選擇前30 條通路作為強心湯治療CHF 的重要途徑進行可視化，并繪制KEGG 富集氣泡圖，見圖6。結(jié)果表明，富集靶點較多的通路為脂質(zhì)與動脈粥樣硬化（AS）[23]、C 型凝集素受體（CLRs）信號通路[24]、流體剪切應(yīng)力與AS[25]、松弛素（Relaxin）信號通路[26]、腫瘤壞死因子（TNF）信號通路[27]、HIF-1 信號通路[28]、IL-17 信號通路[29]等通路，提示強心湯可能主要通過上述信號通路發(fā)揮治療CHF的作用。

圖5 核心靶點的GO富集分析

圖6 核心靶點的 KEGG信號通路富集分析

4.6 分子對接驗證

活性成分與靶點的分子對接結(jié)果見表3。在25對分子對接關(guān)系中，結(jié)合能<-7.0 kcal·mol-1的共有15 對（60%），位于(-7)-(-5) kcal·mol-1的有10 對（40%），即本研究預(yù)測出的核心靶點與潛在成分均有良好的結(jié)合特性。分子對接模式見圖7。

圖7 藥物靶點與作用蛋白對接模式圖

表3 強心湯治療CHF重要化合物與作用靶點的分子對接結(jié)果

4.7 免疫蛋白印跡法檢測CHF大鼠相關(guān)蛋白表達

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠心臟組織p-STAT3、STAT3、IL6 表達量和p-MAPK1/MAPK1 比值明顯升高，經(jīng)給強心湯藥后，p-STAT3、STAT3、IL6 蛋白表達水平與p-MAPK1/MAPK1 比值顯著降低，見圖8。對組間療效進行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，強心湯高劑量組在降低p-STAT3表達量方面優(yōu)于強心湯低劑量組（P<0.05），在降低STAT3、IL6 表達量，p-MAPK1/MAPK1比值方面，略優(yōu)于強心湯低劑量組（P>0.05），強心湯高劑量組在降低p-STAT3、STAT3、IL6 表達量、p-MAPK1/MAPK1 比值方面均與卡托普利組效果相當(dāng)。強心湯低劑量組在降低STAT3、IL6 表達量方面劣于卡托普利組（P<0.05），在降低p-STAT3 表達量、p-MAPK1/MAPK1比值方面與卡托普利組相當(dāng)。結(jié)果提示強心湯可以通過作用于STAT3、MAPK1 和IL6 等靶點發(fā)揮治療CHF 的作用，且與強心湯給藥劑量呈一定正相關(guān)性，進一步證實了預(yù)測的準確性。

圖8 強心湯對核心蛋白表達的影響

5 討論

強心湯中以黃芪、熟附子為君，共須補氣溫陽之功；黨參益氣、桂枝助陽為臣，四藥君臣相配取于《醫(yī)學(xué)金典》中“補后天之氣無如人參，補先天之氣無如附子”之寓；玉竹養(yǎng)陰，茯苓健脾養(yǎng)心利水，合黃芪、黨參可增其補氣養(yǎng)陰之功，加之茯苓可滲濕利水，可助桂枝溫化滲利之效，且玉竹配茯苓尚能防病久傷陰；佐以白術(shù)健脾燥濕化痰，而丹參、川芎可行氣活血祛瘀，經(jīng)脈通利，瘀滯漸消；柏子仁養(yǎng)心安神，配葶藶子通調(diào)水道、瀉肺利水；炙甘草補中益氣，尚可調(diào)和諸藥為使，且配桂枝可辛甘化陽，能扶心陽以祛濁陰，全方合用可奏益氣溫陽、活血通脈、祛瘀濕毒之功。

現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，黃芪主要有效成分黃芪甲苷可通過抑制心肌組織炎性反應(yīng)水平、改善心肌微血管功能等途徑，發(fā)揮抗大鼠心肌損傷作用，且高劑量黃芪甲苷可抑制TGF-β1/Smad3 信號通路激活，從而改善內(nèi)皮細胞功能，降低心肌細胞凋亡率，減緩CHF的發(fā)展進程[30-31]，且黃芪與黨參的藥對中含有黃酮類化合物可通過調(diào)節(jié)TNF 通路及其下游PI3K/Akt 或ERK1/2 信號通路緩解內(nèi)皮功能障礙和心臟肥大進展過程[32]；茯苓的功能為利尿[33]、提升心肌收縮力、改善血流動力學(xué)[34]，且研究表明，茯苓多糖不僅可通過AVP-V2R-AQP2 軸發(fā)揮利尿作用，改善CHF 大鼠心功能，同時相對于呋塞米注射液，引起的電解質(zhì)紊亂發(fā)生機率明顯低于后者[33]；玉竹可提升脂質(zhì)代謝[35]，且高濃度的玉竹乙醇提取物對結(jié)扎大鼠冠狀動脈前降支可引起心肌梗死，繼而造成心衰大鼠有明顯的負性肌力、負性頻率作用，提示玉竹可降低CHF 患者心率，抑制心室重塑的進程[36]；國外研究表明，熟附子配炙甘草可通過調(diào)控TLR4/NF-κB通路降低小鼠的炎癥水平和心室重塑[37]，桂枝通過擴張冠狀動脈，增加血流量，調(diào)節(jié)血壓，提高平均心率，糾正心臟自主神經(jīng)失衡[38]。國外研究表明，自主神經(jīng)達到穩(wěn)態(tài)可為CHF 患者的遠期預(yù)后獲益[39]。白術(shù)可抑制氧化應(yīng)激和RAAS 系統(tǒng)的激活，使被異丙腎上腺素（ISO）誘導(dǎo)的SD 大鼠血流動力學(xué)參數(shù)水平逐漸正?；@著減輕心肌病理損傷，降低腦利鈉肽N 末端激素原水平及心肌發(fā)生肥厚及纖維化等重構(gòu)事件，降低CHF 發(fā)生機率[40]；丹參中的主要有效成分丹參素可降低受損心臟的氧化應(yīng)激炎癥反應(yīng)和細胞凋亡水平[41]，而Chen等[42]的研究發(fā)現(xiàn)，丹參酮ⅡA 也可抑制可逆轉(zhuǎn)心肌缺血大鼠心臟和AngⅡ-處理的心肌成纖維細胞（CFs）Ⅰ、Ⅲ型膠原、TGFβ、α-SMA、MMP2和MMP9等因子表達水平，達到改善心功能及延緩纖維化進程抑制CHF 進展的作用。川芎配丹參對心臟有明顯協(xié)同作用，可顯著提高心臟組織中丹酚酸B（Sal B）、迷迭香酸（RA）、精酸（LA）和阿魏酸（FA）等4 種酚酸含量，對心肌缺血損傷和抗心肌缺血再灌注效果明顯[43]；葶藶子能改善心室重構(gòu)及心功能[44-45]，而葶藶子配黃芪的藥對可通過改善心功能、影響線粒體電子傳遞和線粒體內(nèi)膜及抗細胞凋亡的靶點等有效途徑治療CHF[46]；此外，柏子仁可增加海馬組織GABA 的水平和降低Glu 的水平對CHF 患者發(fā)揮一定抗焦慮效能[47]。

本研究經(jīng)過構(gòu)建“成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖與蛋白互作網(wǎng)絡(luò)PPI圖預(yù)測強心湯治療CHF的重要活性化合物為槲皮素、木犀草素、山柰酚、丹參酮與柚皮素，核心靶點為STAT3、RELA、AKT1、MAPK1 和IL6。分子對接結(jié)果顯示，篩選出的重要活性化合物成分與核心作用蛋白靶點均能較好的結(jié)合，其中活性組分槲皮素、木犀草素和丹參酮與CHF 疾病作用靶點的結(jié)合能普遍低于其他成分，表明這3 個重要化合物成分與核心蛋白靶點結(jié)合能力更強，提示這三者是強心湯治療CHF的關(guān)鍵物質(zhì)組成基礎(chǔ)。研究表明，槲皮素可以下調(diào)NF-κB 蛋白的表達，從而延緩大鼠心室肥大進展[48-50]。槲皮素通過干預(yù)CHF 模型中多種調(diào)節(jié)蛋白的表達，包括抑制MAPK 通路、抑制炎癥反應(yīng)、抑制氧化應(yīng)激等作用機制，提高線粒體能量代謝水平，調(diào)節(jié)線粒體融合/裂變與線粒體生物合成，以發(fā)揮抑制心肌纖維化，改善心臟功能的作用[51]。研究表明，丹參酮具有預(yù)防CHF 并發(fā)心房顫動（Atrial fibrillation，AF）的作用，并可適度增加心房間傳導(dǎo)時間，同時在AF 的實驗?zāi)Ｐ椭?，丹參酮也被證明可有效降低AF 的可誘發(fā)性，而丹參酮抗心律失常作用主要為適度延長了心房復(fù)極后不應(yīng)期及心房間傳導(dǎo)時間[52]。STAT3是細胞內(nèi)關(guān)鍵的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白和轉(zhuǎn)錄因子，IL-6 和IL-11 可通過細胞膜受體與配體結(jié)合后，引起構(gòu)象變化，形成同源二聚體或異源二聚體，參與于細胞信號向STAT3 的傳遞過程[53]。研究表明，提高STAT3表達水平，可有效降低線粒體損傷水平，改善線粒體功能，可能也是改善或延緩CHF 患者病情的重要機制之一[54]。Akt 是參與調(diào)控血管生成的關(guān)鍵信號分子，Schiekofer S 等人的[55]研究表明，通過對Akt1 信號分子6 周的誘導(dǎo)可導(dǎo)致小鼠毛細血管密度增加33%，且對整體心臟生長水平無明顯影響，同時內(nèi)皮細胞內(nèi)Akt 信號通路的激活還可促進心肌內(nèi)的血管生成。CHF 患者血清IL-6 水平與心功能存在顯著相關(guān)性，可作為評估老年CHF 患者病情嚴重程度及預(yù)后的重要指標，且抑制IL-6 升高水平在CHF 的治療中也發(fā)揮重要作用[56-57]。在病毒性心肌炎中，IL-6 的持續(xù)和過量產(chǎn)生會不斷破壞細胞因子網(wǎng)絡(luò)和病毒清除，加速心肌損傷。

GO 生物過程分析表明，強心湯的靶點主要與細胞因子介導(dǎo)的信號通路、基因表達的正向調(diào)控、對缺氧的反應(yīng)、對脂多糖的反應(yīng)、對藥物的反應(yīng)等生物過程相關(guān)，提示強心湯的有效成分可能通過以調(diào)節(jié)細胞炎癥、抑制細胞氧化應(yīng)激及調(diào)節(jié)細胞凋亡在CHF 治療中發(fā)揮作用。KEGG 通路富集分析結(jié)果表明，強心湯治療CHF 以脂質(zhì)和動脈粥樣硬化、流體剪切應(yīng)力與AS、TNF 信號通路、CLRs 信號通路、IL-17 信號通路、Relaxin 信號通路、HIF-1 信號通路相關(guān)。流體剪切應(yīng)力和動脈粥樣硬化是治療CHF 的重要途徑。冠狀動脈疾病是一種嚴重的心血管疾病，由于動脈粥樣硬化會阻礙血液的流動，使心臟無法獲得足夠的營養(yǎng)供應(yīng)，最終誘發(fā)心臟衰竭[58]。HIF-1 信號通路是一種僅在人體缺氧條件下才會被激活的信號通路，它是人體內(nèi)各種生物過程的重要調(diào)節(jié)通路，同時對CHF 的潛在治療價值也得到驗證[59]。HIF 及其下游基因的表達可通過調(diào)節(jié)線粒體代謝、調(diào)節(jié)細胞功能、控制血管生成等方式，在缺氧條件下調(diào)節(jié)缺氧細胞，從而達到保護心肌細胞的效果[60]。研究表明，HIF-1 信號通路在缺氧病理條件下可誘導(dǎo)缺氧誘導(dǎo)增強子RNA1（HERNA1），而HERNA1 的病后發(fā)育可保護小鼠左心室正常生長，調(diào)節(jié)其功能障礙，抑制病理改變，進而防止小鼠心肌病態(tài)肥大[61]。

通過采用結(jié)扎大鼠左冠狀動脈前降支法造成AMI后CHF 模型驗證強心湯對CHF 的治療作用，結(jié)果顯示強心湯可顯著降低心臟組織中STAT3 和MAPK1蛋白的磷酸化水平和IL6 蛋白表達水平，同時強心湯高劑量組在降低心臟組織中STAT3 和MAPK1 蛋白的磷酸化水平和IL6 蛋白表達水平方面略優(yōu)于強心湯低劑量組，與卡托普利組效果相當(dāng)，進一步證實強心湯可以通過調(diào)控STAT3、MAPK1 和IL6 等核心靶點發(fā)揮抗氧化和抑制炎癥的作用，從而發(fā)揮治療CHF 的作用，并且與強心湯劑量大小呈一定的正相關(guān)性。

綜上所述，本課題基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法與技術(shù)，對強心湯治療CHF 的潛在作用機制進行整體的分析預(yù)測，發(fā)現(xiàn)強心湯治療CHF 是經(jīng)由多靶點、多成分以及多通路的協(xié)同效應(yīng)實現(xiàn)的。該研究預(yù)測的潛在重要活性化合物、核心作用靶點、GO 生物功能富集和KEGG 信號通路與已有的文獻報道基本一致，本研究的分子對接結(jié)果亦展現(xiàn)了其預(yù)測的準確性與可靠性，體內(nèi)動物實驗初步證實了強心湯對CHF 的發(fā)生進展具有一定的干預(yù)及改善作用，且可調(diào)控CHF疾病的主要靶點的活性。本研究為強心湯治療CHF的深入相關(guān)研究提供一定的線索和依據(jù)，也為基于強心湯治療CHF 的新藥研發(fā)提供相應(yīng)的前期理論基礎(chǔ)。