黃芪總皂苷抑制膽管反應(yīng)抗膽汁性肝纖維化的作用機(jī)制研究＊

方 靜，胡永紅，梁 悅，慕永平，劉 偉，劉 平，3，呂 瑩，陳佳美＊＊

（1. 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院 上海 201203；2. 上海市中醫(yī)藥研究院肝病研究所，肝腎疾病病證教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海市中醫(yī)臨床重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 上海 201203；3. 上海中醫(yī)藥大學(xué)交叉科學(xué)研究院 上海 201203）

膽汁性肝纖維化是慢性肝病尤其是膽汁淤積性肝病累及膽管的特征性病理變化，可進(jìn)一步發(fā)展為膽汁性肝硬化，甚至引起肝衰竭[1]?？刂撇∫颉⑺幬镏委熅徑饣蜃钄嗄懼俜e以及抗肝纖維化治療是其主要治療手段。熊去氧膽酸或奧貝膽酸等藥物治療面臨著應(yīng)答不完全、劑量依賴(lài)性瘙癢、以及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)重等問(wèn)題[2]。因此，探索膽汁性肝纖維化發(fā)生發(fā)展的病理機(jī)制及其治療手段具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。

膽管反應(yīng)（Ductular reaction，DR）的病理特點(diǎn)包括膽管增生、基質(zhì)變化和炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)，是膽汁性肝纖維化發(fā)生發(fā)展的重要病理環(huán)節(jié)[3]。DR 可通過(guò)分泌促炎介質(zhì)和促纖維化細(xì)胞因子促進(jìn)炎癥反應(yīng)和肝纖維化進(jìn)展[4-5]，而抑制DR可治療膽汁性肝纖維化[6]。

黃芪總皂苷（Astragalosides，ASTs）是中藥黃芪的主要有效組分。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)ASTs 可顯著抑制膽管結(jié)扎（Bile duct ligation，BDL）誘導(dǎo)的大鼠膽汁性肝纖維化的進(jìn)展，且主要與抑制膽管反應(yīng)有關(guān)[7]。然而ASTs如何抑制膽汁性肝纖維化中的膽管反應(yīng)，其主要作用機(jī)制尚未十分明確，深度解析ASTs抗膽汁性肝纖維化的作用機(jī)制可為臨床研發(fā)新藥奠定良好的科學(xué)基礎(chǔ)。因此，本研究旨在探索ASTs 抑制DR 改善膽汁性肝纖維化的部分作用機(jī)制。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

Sprague-Dawley（SD）雄性大鼠24只，SPF 級(jí)，體質(zhì)量160-180 g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，許可證號(hào)：SCXK（滬）2017-0005。所有大鼠飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，環(huán)境溫度25±2℃，相對(duì)濕度40%-60%，自由飲水飲食。本研究動(dòng)物實(shí)驗(yàn)由上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批，倫理審查號(hào)：PZSHUTCM190531003，符合實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物管理與使用準(zhǔn)則。

1.2 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

大鼠肝祖細(xì)胞株WB-F344 購(gòu)于復(fù)祥生物技術(shù)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)藥物及主要試劑

黃芪總皂苷（ASTs）：購(gòu)自西安鴻生生物技術(shù)有限公司，純度>90%。蛋白酶磷酸酶抑制劑混合液（貨號(hào)：P1050），RIPA 裂解液（貨號(hào)：P0013B），APS（貨號(hào)：ST005），封閉液（貨號(hào)：P0220），BSA（貨號(hào)：ST023），30% Acr-Bis（貨號(hào)：ST003），SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液（5×）（貨號(hào)：P0015L），均購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所。丁酸鈉（Sodium butyrate，SB）（貨號(hào)：B5887），購(gòu)自Sigma公司。PVDF 膜（貨號(hào)：162-0177），購(gòu)自Bio-Rad公司。羥脯氨酸試劑盒（貨號(hào)：A030-2），購(gòu)自南京建成生物工程研究所。RNA 提取試劑盒（貨號(hào)：742100），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（貨號(hào)：831300），均購(gòu)自日本TOYOBO 公司。α-平滑肌肌動(dòng)蛋白抗體（alphasmooth muscle actin，α-SMA，貨號(hào)：ab124964）、上皮細(xì)胞粘附分子抗體（Epithelial cell adhesion molecule，Epcam，貨號(hào)：ab71916）、結(jié)蛋白抗體（Desmin，貨號(hào)：ab152500），均購(gòu)自美國(guó)Abcom 公司。細(xì)胞角蛋白19抗體（Cytokeratin 19，CK19，貨號(hào)：10712-1-AP）和CK7抗體（貨號(hào)：15539-1-AP）購(gòu)自美國(guó)Proteintech 公司。卵圓細(xì)胞標(biāo)記物6 抗體（Oval Cell Marker 6，OV6，貨號(hào)：sc-101863）和LOXL1 抗體（貨號(hào)：sc-166632）購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。

2 方法

2.1 膽管結(jié)扎模型制備及分組

將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組和模型組，模型組大鼠根據(jù)課題組常用的膽管結(jié)扎方法制備膽汁性肝纖維化模型[8]。膽管結(jié)扎造模后第2周首日，BDL模型組大鼠隨機(jī)分為2 組：模型組（8 只），ASTs 組（8 只）。ASTs溶于雙蒸水中，給予大鼠160 mg·kg-1·d-1體質(zhì)量灌胃，每天1 次，連續(xù)給藥3 周。假手術(shù)組和模型組大鼠予以同體積的雙蒸水灌胃。第4周末處死取材。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)和處理

WB-F344在含有10% FBS的高糖DMEM 中培養(yǎng)，培養(yǎng)箱37℃，5% CO2。采用丁酸鈉（Sodium butyrate，SB）（終濃度為3.75 μmol·L-1）誘導(dǎo)WB-F344 細(xì)胞向膽管上皮細(xì)胞表型轉(zhuǎn)分化模型。同時(shí)給予ASTs（100 μg·mL-1）干預(yù)，4天后收集細(xì)胞檢測(cè)。

2.3 血清生化學(xué)檢測(cè)

血清天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（Aspartate aminotransferase，AST）和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（Alanine aminotransferase，ALT）活性由上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院檢驗(yàn)科采用全自動(dòng)生化分析儀東芝TBA-40FR檢測(cè)。

2.4 肝組織羥脯氨酸（Hydroxyproline，Hyp）含量測(cè)定

使用試劑盒堿水解法測(cè)定大鼠肝組織Hyp 含量。取50-80 mg 肝組織，加入1 mL 堿水解液，調(diào)整pH=6.0-6.8，定容至10 mL，取4 mL 稀釋水解液加活性炭30 mg 混勻，用3500 r·min-1轉(zhuǎn)速離心后取1 mL 上清檢測(cè)。按照說(shuō)明書(shū)步驟將樣品與試劑混勻，放置60℃水浴15 min，自然冷卻后，用3500 r·min-1轉(zhuǎn)速離心后取200 μL 上清測(cè)吸光度。測(cè)吸光度條件：550 nm，1 cm光徑，雙蒸水調(diào)零。

2.5 肝組織蘇木精-伊紅染色、天狼猩紅染色

肝組織福爾馬林浸泡后，常規(guī)脫水，石蠟包埋。切4 μm 厚度切片，做蘇木精-伊紅染色（Hematoxylin and eosin staining，HE）、天狼猩紅染色（Sirius red，SR），光鏡下觀察大鼠肝組織炎癥與膠原沉積情況。并使用Leica LAS Image Analysis 圖像分析軟件對(duì)SR染色的全片膠原陽(yáng)性面積進(jìn)行定量分析。

2.6 免疫組織化學(xué)染色

石蠟切片后，梯度酒精脫水，PBS清洗，檸檬酸溶液抗原修復(fù)，3% H2O2滅活內(nèi)源性酶，封閉后一抗（α-SMA 1∶1000、Desmin 1∶200、CK19 1∶400、CK7 1∶400、Epcam 1∶800、OV6 1∶400）孵育過(guò)夜，第2 天孵育二抗，37℃孵育30 min，DAB顯色，染核，脫水，封片，光鏡下觀察。

2.7 蛋白免疫印跡法

肝組織勻漿后提取蛋白，BCA 法測(cè)定蛋白濃度，蛋白制樣后使蛋白充分變性。根據(jù)蛋白分子量大小制備分離膠和堆積膠，蛋白上樣后恒壓80V 電泳至結(jié)束；根據(jù)濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜法進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，用快速封閉液室溫封閉15 min 后加一抗（Epcam 1∶1000、LOXL1 1∶250）孵育過(guò)夜；第2 天二抗孵育后，使用Odyssey 儀器進(jìn)行顯影，保存圖像。

2.8 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）

從肝組織中提取總RNA，測(cè)樣品RNA 濃度，按500 ng，10 μL體系進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。按照說(shuō)明書(shū)步驟和實(shí)驗(yàn)條件，逐步加入樣品含量，4×DN Master Mix 和5×RT Master Mix II，結(jié)束取出逆轉(zhuǎn)錄后的cDNA 樣本。然后用試劑盒SYBR Green PCR Master Mix，10 μL 體系進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，采用ΔΔCT 法定量。引物序列見(jiàn)表1。引物由BioTNT公司設(shè)計(jì)及合成。

表1 引物序列

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 22.0 for Windows 統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較，采用單因素方差分析（One-way ANOVA），符合方差齊性檢驗(yàn)（P>0.05），兩兩比較采用LSD-t法；方差不齊（P<0.05），采用Dunnett T3法，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 BDL 大鼠肝組織和體外細(xì)胞中賴(lài)氨酰氧化酶家族蛋白的變化情況

HE和SR染色顯示，BDL組大鼠肝組織已形成明顯的肝纖維化（見(jiàn)圖1A）。qRT-PCR結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，BDL 組大鼠肝組織LOX、LOXL1、LOXL2 和LOXL3 的mRNA 表達(dá)顯著上調(diào)（P<0.01），而LOXL4 的mRNA表達(dá)顯著下降（P<0.01）（見(jiàn)圖1B）。體外用丁酸鈉誘導(dǎo)WB-F344細(xì)胞后，細(xì)胞CK19的蛋白表達(dá)顯著增加（見(jiàn)圖1C），提示丁酸鈉可成功誘導(dǎo)WB-F344細(xì)胞向膽管上皮細(xì)胞表型轉(zhuǎn)分化。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，丁酸鈉組細(xì)胞LOXL1、LOXL2和LOXL4的mRNA表達(dá)顯著升高（P<0.01），而LOX 和LOXL4 的mRNA 表達(dá)顯著降低（P<0.01）（見(jiàn)圖1D）。提示在BDL誘導(dǎo)的膽汁性肝纖維化肝組織和體外肝祖細(xì)胞向膽管上皮細(xì)胞表型分化中LOXL1和LOXL2的表達(dá)變化一致。

圖1 BDL大鼠肝組織和體外細(xì)胞中賴(lài)氨酰氧化酶家族蛋白的變化情況

3.2 黃芪總皂苷對(duì)BDL 大鼠肝損傷和肝纖維化程度的影響

HE 染色顯示，假手術(shù)組肝組織肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝索排列整齊；與假手術(shù)組比較，BDL 組大鼠肝細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)破壞，匯管區(qū)周?chē)梢?jiàn)大量不規(guī)則膽管增生和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。與BDL組比較，ASTs組肝組織膽管增生和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減輕（見(jiàn)圖2A）。與假手術(shù)組比較，BDL 組大鼠血清ALT 和AST 活性顯著升高（P<0.01）。與BDL 組比較，ASTs 組大鼠血清ALT 和AST活性顯著降低（P<0.01）（見(jiàn)圖2B和2C）。提示ASTs可顯著改善BDL大鼠肝損傷。

圖2 黃芪總皂苷對(duì)BDL大鼠肝損傷和肝纖維化程度的影響

SR 染色顯示，與假手術(shù)組比較，BDL 組大鼠肝組織可見(jiàn)大量膠原纖維沉積，呈團(tuán)簇狀分布于匯管區(qū)周?chē)⑾蚋螌?shí)質(zhì)區(qū)域延伸。與BDL 組比較，ASTs 組大鼠肝組織膠原沉積顯著減少（見(jiàn)圖2A）。與假手術(shù)組比較，BDL組大鼠肝組織Hyp含量和SR陽(yáng)性染色面積百分比均顯著增加（P<0.01）。與BDL 組比較，ASTs組大鼠肝組織Hyp 含量和SR 陽(yáng)性染色面積百分比均顯著降低（P<0.01）（見(jiàn)圖2D 和2E）。結(jié)果表明，ASTs 可顯著降低BDL大鼠肝組織膠原沉積，減輕肝纖維化。

3.3 黃芪總皂苷對(duì)BDL 大鼠肝組織肝星狀細(xì)胞活化的影響

免疫組化染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組肝組織僅血管壁表達(dá)α-SMA和Desmin；與假手術(shù)組比較，BDL組肝組織α-SMA 和Desmin 陽(yáng)性表達(dá)增多，α-SMA 和Desmin陽(yáng)性表達(dá)主要圍繞著異常增生的膽管細(xì)胞（見(jiàn)圖3A）。Western blot 和qPCR 結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，BDL組肝組織α-SMA 蛋白表達(dá)顯著增加（P<0.01），而ASTs 可顯著減少肝組織α-SMA 蛋白表達(dá)（P<0.05）（見(jiàn)圖3B 和3C）。結(jié)果提示，ASTs 可顯著抑制BDL 大鼠肝組織肝星狀細(xì)胞活化。

圖3 黃芪總皂苷對(duì)BDL大鼠肝組織肝星狀細(xì)胞活化的影響

3.4 黃芪總皂苷對(duì)BDL 大鼠肝組織膽管反應(yīng)的影響

免疫組化染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠肝組織中僅固有膽管上可見(jiàn)CK19、CK7、Epcam 和OV6 陽(yáng)性表達(dá)。與假手術(shù)組比較，BDL 組大鼠肝組織CK19、CK7、Epcam 和OV6 陽(yáng)性表達(dá)增多，呈團(tuán)簇狀不規(guī)則分布，并向門(mén)靜脈和肝實(shí)質(zhì)區(qū)域延伸；與BDL 組比較，ASTs組大鼠肝組織CK19、CK7、Epcam 和OV6 陽(yáng)性表達(dá)減少（見(jiàn)圖4A）。qRT-PCR 結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，BDL 組大鼠肝組織CK7 的mRNA 表達(dá)明顯升高（P<0.01），ASTs 組肝組織CK7 的mRNA 表達(dá)較BDL 組顯著降低（P<0.05）（見(jiàn)圖4B）。Western blot結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，BDL 組肝組織Epcam 蛋白表達(dá)顯著增加，ASTs干預(yù)后顯著降低了肝組織Epcam 的蛋白表達(dá)（見(jiàn)圖4C）。結(jié)果顯示，ASTs 可顯著抑制BDL 大鼠肝組織膽管反應(yīng)。

圖4 黃芪總皂苷對(duì)BDL大鼠肝組織膽管反應(yīng)的影響

3.5 黃芪總皂苷對(duì)BDL 大鼠肝組織賴(lài)氨酰氧化酶樣蛋白家族表達(dá)的影響

qPT-PCR 結(jié)果顯示，與BDL 組比較，ASTs 組肝組織LOX 和LOXL1 的mRNA 表達(dá)顯著下降（P<0.05，P<0.01），LOXL4 的mRNA 表達(dá)顯著升高（P<0.01）（見(jiàn)圖5A-5E）。LOXL1 的Western blot 結(jié)果與qPCR 結(jié)果一致（見(jiàn)圖5F）。

圖5 黃芪總皂苷對(duì)BDL大鼠肝組織賴(lài)氨酰氧化酶樣蛋白家族表達(dá)的影響

圖6 黃芪總皂苷對(duì)肝祖細(xì)胞向膽管上皮細(xì)胞表型轉(zhuǎn)分化的影響

3.6 黃芪總皂苷對(duì)肝祖細(xì)胞向膽管上皮細(xì)胞表型轉(zhuǎn)分化的影響

qRT-PCR 結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，丁酸鈉模型組細(xì)胞CK19、LOXL1 和LOXL2 的mRNA 表達(dá)顯著升高（P<0.01），而ASTs 組細(xì)胞CK19、LOXL1 和LOXL2的mRNA 表達(dá)顯著降低（P<0.05），提示ASTs可抑制肝祖細(xì)胞向膽管上皮細(xì)胞表型轉(zhuǎn)分化，且與下調(diào)細(xì)胞LOXL1和LOXL2的表達(dá)有關(guān)。

4 討論

DR 被認(rèn)為是膽汁性肝纖維化發(fā)生、發(fā)展的重要起始病理環(huán)節(jié)。膽汁淤積時(shí)，膽管細(xì)胞大量增殖，新生的膽管細(xì)胞可分泌促纖維化因子，刺激靜止的肝星狀細(xì)胞和成纖維細(xì)胞活化、遷移與增殖[4]，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)的過(guò)度沉積，促進(jìn)肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展。因此，抑制DR可部分甚至完全逆轉(zhuǎn)膽汁性肝纖維化[9]。

ASTs 是黃芪的主要有效組分，對(duì)心肌、肝、肺、腎間質(zhì)及腹膜纖維化等發(fā)揮一定的抗纖維化作用[10-12]。前期研究發(fā)現(xiàn)ASTs 可能是通過(guò)抑制DR 發(fā)揮改善BDL 誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化作用[7]。本研究中證實(shí)ASTs可顯著改善BDL 誘導(dǎo)的大鼠肝損傷、減少肝組織膠原沉積，抑制肝星狀細(xì)胞活化。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)ASTs干預(yù)后可顯著降低BDL 大鼠肝組織膽管反應(yīng)標(biāo)記物CK19、CK7、Epcam 和OV6 的表達(dá)；且對(duì)丁酸鈉誘導(dǎo)肝祖細(xì)胞向膽管上皮細(xì)胞表型轉(zhuǎn)分化過(guò)程中給予ASTs干預(yù)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞CK19 表達(dá)顯著減少，提示ASTs 可顯著抑制DR，改善膽汁性肝纖維化。

賴(lài)氨酰氧化酶（Lysyl oxidase，LOX）家族蛋白又稱(chēng)蛋白賴(lài)氨酸-6-磷酸酶家族蛋白，包括5種蛋白（LOX，LOX 樣蛋白（LOXL1-4）），是一種可催化包括肝臟在內(nèi)的纖維化器官細(xì)胞外基質(zhì)組成（如膠原和彈性蛋白）的銅依賴(lài)酶[13-14]。大量的實(shí)驗(yàn)研究表明，LOX，LOXL1或LOXL2是治療肝纖維化的潛在靶點(diǎn)[15-17]。研究報(bào)道，膽道閉鎖嬰兒的肝內(nèi)膽管大量表達(dá)LOXL2[18]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究也發(fā)現(xiàn)在Mdr2敲除的纖維化肝組織中，LOXL2 主要表達(dá)在膽管反應(yīng)細(xì)胞（即肝祖細(xì)胞和新生膽管上皮細(xì)胞）和肌成纖維樣細(xì)胞上；且給予LOXL2抗體干預(yù)即抑制LOXL2的表達(dá)可抑制膽管反應(yīng)、改善肝纖維化[17]。膽管癌患者血清及肝組織中LOXL1 均高表達(dá)，且LOXL1 可介導(dǎo)膽管癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[19]。這些報(bào)道說(shuō)明LOXL1 和LOXL2 均表達(dá)在膽管細(xì)胞，且可促進(jìn)肝纖維化的進(jìn)展。本研究也發(fā)現(xiàn)，BDL誘導(dǎo)的膽汁性肝纖維化肝組織和體外肝祖細(xì)胞向膽管上皮細(xì)胞表型轉(zhuǎn)分化中LOXL1 和LOXL2 的表達(dá)變化一致，提示LOXL1和LOXL2參與了膽管反應(yīng)導(dǎo)致的膽汁性肝纖維化的發(fā)生發(fā)展。而進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)給予BDL 大鼠ASTs 干預(yù)后肝組織LOXL1 的表達(dá)顯著降低；體外結(jié)果也顯示對(duì)丁酸鈉誘導(dǎo)肝祖細(xì)胞向膽管上皮細(xì)胞表型轉(zhuǎn)分化模型給予ASTs 干預(yù)后細(xì)胞LOXL1和LOXL2 的表達(dá)顯著降低，提示ASTs 可能通過(guò)下調(diào)LOXL1的表達(dá)抑制膽管反應(yīng)減輕膽汁性肝纖維化。

本研究表明，ASTs通過(guò)抑制膽管反應(yīng)改善膽汁性肝纖維化，其作用機(jī)制可能與下調(diào)LOXL1的表達(dá)有關(guān)。