宣肺達郁顆粒質(zhì)量標準研究*

祁慶瑞，翟秉濤，田 歡，岳寶森，趙 鋒△

（1. 陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，陜西 西安 712046； 2. 陜西省西安市中醫(yī)醫(yī)院，陜西 西安 710021）

宣肺達郁方由黨參、桂枝、醋鱉甲、茯苓、炙甘草、陳皮、炒苦杏仁等15味材藥組方，其由國醫(yī)大師楊震教授所創(chuàng)，可升肝脾、降肺胃，調(diào)節(jié)氣機郁滯、痰濕阻滯，從而恢復(fù)人體正氣，達到陰平陽秘，繼而加速康復(fù)，應(yīng)用前景較好［1］。為便于該方的推廣使用，將其開發(fā)為顆粒劑，前期已完成制備工藝研究。在此，以薄層色譜（TLC）法定性鑒別制劑中的陳皮、白芍、百合、干姜，以高效液相色譜（HPLC）法同時測定制劑中苦杏仁苷、芍藥苷、甘草苷、桂皮醛、橙皮苷的含量，為宣肺達郁顆粒質(zhì)量標準的建立提供參考?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC - 20A 型高效液相色譜系統(tǒng)（日本Shimadzu 公司）；SHZ-D 型循環(huán)水式多用真空泵（河南省予華儀器有限公司）；CQ-150A-DST 型超聲波清洗機（上海躍進醫(yī)用光學(xué)器械廠）；KHW - S - 4 型電熱恒溫水浴鍋（上海科恒實業(yè)發(fā)展有限公司）；101 型電熱鼓風(fēng)干燥箱（北京科偉永興儀器有限公司）；UV - A 型手提暗箱式紫外分析儀（上?？岛坦怆妰x器有限公司）；ZA305AS型分析天平、JA200R3 型電子精密天平（上海贊維衡器有限公司，精度分別為0.1 mg，1 mg）。

1.2 試藥

宣肺達郁顆粒（西安市中醫(yī)醫(yī)院制劑室，批號分別為20221120，20221130，20221214，記為S1，S2，S3）；橙皮苷對照品（批號為110721-202019，含量95.3%），桂皮醛對照品（批號為110710-202022，含量99.5%），甘草苷對照品（批號為111610-201908，含量95.0%），苦杏仁苷對照品（批號為110820-201808，含量88.2%），芍藥苷對照品（批號為110736-201943，含量95.1%），以及百合對照藥材（批號為121100 - 201605）、干姜對照藥材（批號為120942 - 201510），均購于中國食品藥品檢定研究院；硅膠G薄層板（青島海洋化工有限公司，批號為2021028）；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 TLC 鑒別

陳皮：取樣品10 g，加甲醇20 mL超聲（功率150 W、頻率40 kHz，下同）提取20 min，濾過，濾液蒸干，加入甲醇2 mL，作為供試品溶液。按宣肺達郁顆粒處方和工藝制備缺陳皮的陰性樣品，同供試品溶液制備方法制成陰性對照品溶液。另取橙皮苷對照品適量，加甲醇制成對照品溶液。吸取上述溶液，點于同一硅膠G 薄層板上（以0.5%氫氧化鈉溶液制備），分別以水-甲醇-乙酸乙酯（13∶17∶100，V/V/V）和水- 甲酸- 乙酸乙酯-甲苯（1∶1∶10∶20，V/V/V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以三氯化鋁溶液，置紫外光燈（365 nm）下檢視。結(jié)果供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應(yīng)位置顯相同顏色的斑點，且陰性對照無干擾。詳見圖1 A。

圖1 薄層色譜圖1.Reference solution 1'.Reference medicinal solution 2 - 4.Test solution 5.Negative reference solutionA.Citri Reticulatae Pericarpium B.Paeoniae Radix Alba C.Lilii Bulbus D.Zingiberis RhizomaFig.1 TLC chromatograms

白芍：取樣品15 g，加甲醇40 mL 加熱回流60 min，濾過，濾液蒸干，加水20 mL，另取水飽和正丁醇25 mL振搖提取3次，合并正丁醇液，再用正丁醇飽和的水25 mL洗2 次，合并正丁醇液，蒸干，殘渣加甲醇1 mL 溶解，作為供試品溶液。按宣肺達郁顆粒處方和工藝制備缺白芍的陰性樣品，同供試品溶液制備方法制成陰性對照品溶液。取芍藥苷對照品適量，加甲醇制成質(zhì)量濃度為1 mg/ mL 的對照品溶液。吸取上述溶液，點于同一硅膠G 薄層板上，以甲酸- 甲醇- 乙酸乙酯- 三氯甲烷（0.2∶10∶5∶40，V/V/V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，加熱至斑點顯色清晰，置日光燈下檢視。結(jié)果供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應(yīng)位置顯相同顏色的斑點，且陰性對照無干擾。詳見圖1 B。

百合：取樣品10 g，加甲醇30 mL，超聲處理20 min，濾過，濾液蒸干，加入1 mL甲醇，作為供試品溶液。按宣肺達郁顆粒處方和工藝制備缺百合的陰性樣品，同供試品溶液制備方法制成陰性對照品溶液。取百合對照藥材1 g，加甲醇10 mL，同供試品溶液制備方法制成對照藥材溶液。吸取上述溶液，點于同一硅膠G薄層板上，以甲酸-乙酸乙酯-石油醚（1∶5∶15，V/V/V）的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%磷鉬酸乙醇溶液，加熱至斑點顯色清晰，置日光燈下檢視。結(jié)果供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應(yīng)位置顯相同顏色的斑點，且陰性對照無干擾。詳見圖1 C。

干姜：取樣品10 g，加乙酸乙酯30 mL，超聲處理20 min，濾過，濾液濃縮至1 mL，作為供試品溶液。按宣肺達郁顆粒處方和工藝制備缺干姜的陰性樣品，同供試品溶液制備方法制成陰性對照品溶液。另取干姜對照藥材1 g，加乙酸乙酯15 mL，同供試品溶液制備方法制成對照藥材溶液。吸取上述溶液，點于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯- 三氯甲烷- 石油醚（1∶1∶2，V/V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以香草醛硫酸試液，105 ℃加熱至斑點顯色清晰，置日光燈下檢視。結(jié)果供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應(yīng)位置顯相同顏色的斑點，且陰性對照無干擾。詳見圖1 D。

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent 5 TC-C18柱（150 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：甲醇（A）- 0.2%乙酸水溶液（B），梯度洗脫（0～5 min 時10%A，5～10 min 時15%A，10～20 min 時20%A，20～35 min 時25%A，35～45 min 時30%A，45～55 min 時35%A，55～65 min 時36%A，65～75 min 時45%A，75～80 min 時50%A，80～85 min 時10%A）；流速：1.0 mL/ min；檢測波長：220 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：15μL。

2.2.2 溶液制備

取苦杏仁苷、芍藥苷、甘草苷、橙皮苷、桂皮醛對照品各適量，精密稱定，加甲醇溶解，制成質(zhì)量濃度分別為5.60，4.10，2.30，4.80，0.10 mg/ mL 的混合對照品溶液。取樣品1 g，研細，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇5 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，放冷，再次稱定質(zhì)量，用50%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，經(jīng)0.22μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。按宣肺達郁顆粒處方及工藝制備同時缺苦杏仁、桃仁、芍藥、甘草、桂枝、陳皮的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制得陰性對照品溶液。

2.2.3 方法學(xué)考察

系統(tǒng)適用性及專屬性試驗：分別取2.2.2項下混合對照品溶液、供試品溶液、陰性對照品溶液各適量，按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果各待測成分分離良好，分離度均大于1.5，且陰性對照無干擾。詳見圖2。

圖2 高效液相色譜圖1.Amygdalin 2.Paeoniflorin 3.Liquiritin 4.Cinnamaldehyde 5.HesperidinA.Mixed reference solution B.Test solution C.Negative reference solutionFig.2 HPLC chromatograms

線性關(guān)系考察：精密量取2.2.2項下混合對照品溶液，稀釋，取1，2，6，10，14，18μL，分別按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，以各待測成分質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸。結(jié)果見表1。

表1 線性關(guān)系考察結(jié)果Tab.1 Results of the linear relation test

精密度試驗：取2.2.2 項下供試品溶液適量，按2.2.1項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果苦杏仁苷、芍藥苷、甘草苷、桂皮醛、橙皮苷峰面積的RSD分別為1.78%，2.04%，0.94%，1.55%，0.12%（n=6），表明方法精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取供試品（批號為20221214）溶液適量，分別于室溫下放置0，2，4，6，8，12，24 h時按2.2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果苦杏仁苷、芍藥苷、甘草苷、桂皮醛、橙皮苷峰面積的RSD分別為1.64%，2.10%，1.21%，1.82%，0.20%（n= 7），表明供試品溶液室溫放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗：取同一批（批號為20221214）樣品6份，精密稱定，按2.2.2項下方法制備供試品溶液，按2.2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算含量。結(jié)果苦杏仁苷、芍藥苷、甘草苷、桂皮醛、橙皮苷含量的RSD分別為1.91%，2.76%，1.44%，2.50%，0.49%（n= 6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗：取已知含量樣品適量，各6份，分別加入與各成分含量相近的對照品溶液適量（含苦杏仁苷1.920 0 mg、芍藥苷0.738 0 mg、甘草苷0.149 5 mg、桂皮醛0.000 3 mg、橙皮苷1.200 mg），按2.2.2 項下方法制備供試品溶液，再按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算加樣回收率。結(jié)果見表2。

表2 加樣回收試驗結(jié)果（n=6）Tab.2 Results of the recovery test（n = 6）

2.2.4 多指標成分含量測定

取3 批樣品各適量，按2.2.2 項下方法制備供試品溶液，再按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算各成分含量。結(jié)果見表3。

表3 樣品含量測定結(jié)果（mg/g，n=3）Tab.3 Results of the content determination of five components in samples（mg / g，n = 3）

3 討論

本研究中參考2020 年版《中國藥典（一部）》，對宣肺達郁顆粒中的主要藥味進行了TLC定性鑒別，其中陳皮、白芍、百合、干姜的色譜斑點清晰、分離度好且陰性對照無干擾，故均可列入質(zhì)量標準；而前期研究中發(fā)現(xiàn)方中黨參等其他藥材TLC圖效果欠佳，炙甘草和法半夏中均含有甘草，苦杏仁和桃仁中均含有苦杏仁苷，陰性對照色譜會產(chǎn)生干擾，故均不作為質(zhì)量標準定性考察項。

預(yù)試驗中建立測定制劑有效成分含量的HPLC 法時，分別考察了不同體積分數(shù)的提取溶劑、檢測波長和流動相對提取率和色譜圖的影響。分別以50%，60%，70%，80%，90%，100%的甲醇溶液作提取溶劑［2］，結(jié)果以50%甲醇的提取率較高，色譜圖雜峰較少。全波段掃描結(jié)果顯示，在210～260 nm 波長范圍內(nèi)吸收峰最多且受末端吸收影響較小，基線平穩(wěn)；進一步比較了210，220，225，230，240，250，260 nm 波長處的色譜峰，其中220 nm 波長處各色譜峰的峰面積較大，分離度較好。同時考察了甲醇- 水、乙腈- 水、甲醇- 0.1%甲酸水溶液、甲醇-0.1%乙酸水溶液作為流動相系統(tǒng)時的圖譜效果［3］，其中以甲醇-0.1%甲酸水溶液為流動相時，色譜圖分離度和峰形均較好且基線平穩(wěn)。

宣肺達郁顆粒中藥味較多，在建立含量測定方法過程中，以2020 年版《中國藥典（一部）》為依據(jù)，結(jié)合藥味特點和組方選擇指標成分。方中苦杏仁和黨參共為君藥，以調(diào)節(jié)氣機；桂枝、茯苓、半夏三藥共為臣藥，以助陽健脾祛濕；炙甘草、干姜、陳皮、白芍、醋鱉甲為佐藥，輔助君臣藥發(fā)揮作用；百合為使藥，可養(yǎng)陰潤燥、解郁安神［4］。研究表明，溫度在60 ℃以上時，黨參中的基礎(chǔ)物質(zhì)黨參炔苷［5］隨溫度的升高及受熱時間的延長含量顯著降低［6］，因此，君藥中選擇苦杏仁中的苦杏仁苷作為指標成分。茯苓的主要活性成分為多糖和三萜類［7-8］，半夏的主要活性成分為生物堿、有機酸類化合物［9-10］，均不適宜進行含量測定，因此在臣藥中選擇了桂皮中的桂皮醛為指標成分。佐藥中以陳皮中的橙皮苷和白芍中的芍藥苷作為指標成分，而干姜中的活性物質(zhì)6-姜辣素［11-12］由于其脂溶性較大，提取率受限，且其在貯存過程中易發(fā)生熱解、水解及氧化反應(yīng)，穩(wěn)定性較差［13］；炙甘草中的甘草苷峰形欠佳，未能與其他雜峰徹底分離；故未將后兩者作為含量測定的指標成分。使藥百合中的活性物質(zhì)主要為百合多糖［14-15］，糖類為大分子化合物，無法用C18柱分離，故也未將其作為指標性成分。

綜上所述，本研究中將TLC 法與HPLC 法相結(jié)合，初步建立了宣肺達郁顆粒的質(zhì)量標準。其中，多指標成分含量測定和TLC 鑒別互相補充，待測成分基本涉及了制劑組方中君、臣、佐、使等藥味，且該方法操作簡便，專屬性強，結(jié)果準確，可用于該方的質(zhì)量控制。