米口袋染色體制片技術(shù)優(yōu)化及其核型分析

李玉萍 歐香 苗淑杏 朱士農(nóng)

李玉萍，歐香，苗淑杏，等.米口袋染色體制片技術(shù)優(yōu)化及其核型分析[J].福建農(nóng)業(yè)科技，2023，54（8）：40-44

摘?要：以米口袋根尖為供試材料，用常規(guī)壓片法探討不同預(yù)處理方法和預(yù)處理時(shí)間對(duì)染色體制片的影響，優(yōu)化染色體制片技術(shù)，并對(duì)其進(jìn)行染色體核型分析，旨在為米口袋的分類、種質(zhì)資源保存和利用及育種提供細(xì)胞學(xué)依據(jù)。結(jié)果表明：（1）當(dāng)預(yù)處理時(shí)間為3 h時(shí)，0.1%秋水仙素溶液預(yù)處理效果最好；當(dāng)預(yù)處理時(shí)間為6 h時(shí)，0.01%秋水仙素溶液預(yù)處理效果最好。得到的分裂相多，染色體濃縮程度適宜，分散性較好，形態(tài)清晰；（2）米口袋體細(xì)胞染色體數(shù)目為2n=2x=14，為二倍體植物。核型公式K（2n）=2x=14=10m+4sm，具中部著絲點(diǎn)染色體（m）的為第1、2、3、4、7對(duì)染色體，具近中部著絲點(diǎn)染色體（sm）的為第4、5對(duì)染色體。染色體相對(duì)長(zhǎng)度組成為2n=14=2L+8M2+ 4M1，染色體長(zhǎng)度比1.30，沒(méi)有臂比大于2的染色體，屬“1A”類型，為對(duì)稱型核型，說(shuō)明米口袋在進(jìn)化上屬于比較原始的類型。

關(guān)鍵詞：米口袋；染色體；核型分析；制片技術(shù)

中圖分類號(hào)：R 284.2???文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A???文章編號(hào)：0253-2301（2023）08-0040-05

DOI：10.13651/j.cnki.fjnykj.2023.08.006

Optimization of the Chromosome Production Technology of Gueldenstaedtia vernaand Its Karyotype Analysis

LI Yu-ping， OU Xiang， MIAO Shu-xing， ZHU Shi-nong*

（College of Horticulture & Landscape， Jinling Institute of Technology， Nanjing， Jiangsu 210038， China）

Abstract：The effects of different pretreatment methods and pretreatment time on the chromosome production were explored by using the conventional tabletting method with Gueldenstaedtia verna as the tested material， in order to optimize the chromosome production technology. And the chromosome karyotype analysis was carried out to provide the cytological basis for the classification of Gueldenstaedtia verna， the preservation & utilization of germplasm resources and its breeding. The results showed that： （1） When the pretreatment time was 3 h， the pretreatment effect of 0.1% colchicine solution was the best， while when the pretreatment time was 6 h， the pretreatment effect of 0.01% colchicine solution was the best. There were many division phases， the degree of chromosome condensation was suitable， the dispersion was better， and the morphology was clear. （2） The chromosome number of somatic cells of Gueldenstaedtia verna was 2n=2x=14， which was a diploid plant. The karyotype formula was K（2n）=2x=14=10m+4sm. The chromosomes with the metacentric chromosome （m） were the 1st， 2nd， 3rd， 4th and 7th pairs of chromosomes， and the chromosomes with the submetacentric chromosome （sm） were the 4th and 5th pairs of chromosomes. The composition of the relative length of chromosome was 2n=14=2L+8M2+4M1， the length ratio of chromosome was 1.30， and there were no chromosomes with the arm ratios greater than 2， which belonged to the ″1A″ type and was a symmetrical karyotype， indicating that the Gueldenstaedtia verna was a relatively original type in the evolution.

Key words：Gueldenstaedtia verna； Chromosome； Karyotype analysis； Production technology

米口袋Gueldenstaedtia verna（Georgi）Boriss.又名米布袋、地丁、大米口袋，為豆科Leguminosae米口袋屬Gueldenstaedtia多年生草本植物。米口袋屬植物約有20種，分布于中亞和亞洲東部，中國(guó)有15種，主要分布在東北、華東、華北、陜西中南部、甘肅東部等地區(qū)。米口袋植株矮小，全株被白色長(zhǎng)柔毛；分莖極縮短，葉和總花梗叢生其上；單數(shù)羽狀復(fù)葉，小葉呈橢圓形或長(zhǎng)圓形，灰綠色；傘形花序有2～6朵花，花冠蝶形，紫色。莢果圓筒狀，棕色；種子多數(shù)，三角狀腎形，小如米粒，因此得名。花期4月，果期5月至6月。米口袋全草及根可入藥，能清熱解毒、消腫散結(jié)；地上部分可食用，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高于白菜等蔬菜，有重要的開(kāi)發(fā)利用價(jià)值。米口袋喜冷涼濕潤(rùn)的氣候，耐寒、耐旱、耐貧瘠，具有較強(qiáng)的抗性。目前對(duì)米口袋屬植物的研究主要集中在種名考證及其分布、化學(xué)成分的種類和含量及其藥理作用、生態(tài)習(xí)性及園林應(yīng)用、電鏡掃描花粉形態(tài)觀察等方面，有關(guān)染色體的核型分析卻是鮮有報(bào)道，而核型分析可為植物區(qū)系起源和進(jìn)化提供重要依據(jù)，同時(shí)有利于探索植物系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程中屬種之間的親緣和進(jìn)化關(guān)系。本試驗(yàn)擬從細(xì)胞學(xué)水平出發(fā)，采用染色體常規(guī)壓片技術(shù)對(duì)江蘇省南京市野生米口袋進(jìn)行核型分析，以期為我國(guó)米口袋屬植物的分類及種間親緣關(guān)系、種質(zhì)資源鑒定提供細(xì)胞遺傳學(xué)基礎(chǔ)和依據(jù)。

1?材料與方法

1.1?試驗(yàn)材料

以金陵科技學(xué)院幕府校區(qū)綠地野生的米口袋種子為試驗(yàn)材料，于2020年6月至7月間采摘自然成熟的種子在通風(fēng)的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)陰干，然后貯藏在4℃的冰箱中備用。

1.2?試驗(yàn)方法

1.2.1?根尖培養(yǎng)?2020年12月選取成熟飽滿的米口袋種子，用水浸泡44 h（每隔8 h換1次水），使其充分吸水，然后將種子轉(zhuǎn)入平鋪有濾紙的培養(yǎng)皿中，加入適量清水，蓋上皿蓋后置于25℃的恒溫箱內(nèi)，每天澆水以保持種子正常的生命活動(dòng)。待根長(zhǎng)至1～2 cm時(shí)，于上午9：0～10：00剪取根尖0.5～1.0 cm。

1.2.2?預(yù)處理及固定?剪取的根尖，用蒸餾水清洗干凈，吸水紙吸去水分，置于小玻璃瓶中，然后向瓶中滴加適量預(yù)處理液。預(yù)處理液分別為：0.001mol·L 8-羥基喹啉、0.002 mol·L 8-羥基喹啉、0.01% 秋水仙素和0.1% 秋水仙素。然后于4℃冰箱分別處理3 h和6 h。以不做任何預(yù)處理直接在4℃冰箱固定做對(duì)照。將經(jīng)過(guò)預(yù)處理的根尖，用蒸餾水清洗3～4次，用卡諾固定液在4℃冰箱中固定24 h，然后用蒸餾水清洗3～4次后轉(zhuǎn)入70%酒精中，于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3?解離與染色?將冰箱內(nèi)保存的根尖用蒸餾水清洗3～4次，用1 mol·L的HCl在60℃的恒溫水浴鍋中解離8 min。將解離后的根尖用蒸餾水清洗3～4次，置于干凈的載玻片上，滴加1～2滴卡寶品紅溶液，染色2 min。

1.2.4?壓片與鏡檢?蓋上蓋玻片，然后用濾紙包住玻片吸取多余染色液，用大拇指在上面施加少量壓力，勿使蓋玻片移動(dòng)，用鉛筆輕敲，使細(xì)胞舒展，染色體散開(kāi)。用Nikon DS-Ri2光學(xué)顯微鏡進(jìn)行鏡檢。

1.2.5?數(shù)據(jù)分析?參照李懋學(xué)等植物核型分析的標(biāo)準(zhǔn)，染色體數(shù)目以體細(xì)胞染色體數(shù)目為主，要求統(tǒng)計(jì)的細(xì)胞數(shù)目在30個(gè)以上，其中85%以上的細(xì)胞具有恒定一致的染色體數(shù)，即可認(rèn)為是該植物的染色體數(shù)目。因此，本試驗(yàn)選取50個(gè)染色體分散良好、收縮適宜的中期分裂相細(xì)胞進(jìn)行觀察和分析，統(tǒng)計(jì)各個(gè)細(xì)胞染色體數(shù)目，從而得出米口袋染色體數(shù)目。選擇5個(gè)染色體分散良好、收縮適宜且形態(tài)清晰的中期分裂相細(xì)胞，分別測(cè)量各個(gè)細(xì)胞的染色體長(zhǎng)臂長(zhǎng)度、短臂長(zhǎng)度及染色體總長(zhǎng)度，并取其平均值。

以測(cè)量和計(jì)算得到的各項(xiàng)參數(shù)為基礎(chǔ)，利用Adobe Photoshop 6.0圖像處理軟件對(duì)染色體進(jìn)行復(fù)制剪貼、排列和同源染色體配對(duì)等分析，并將配對(duì)好的同源染色體按從長(zhǎng)到短的順序依次從左往右排列，并依次命名。染色體類型采用Levan、孫浩男等的方法，核型不對(duì)稱性按Stebbins的分類標(biāo)準(zhǔn)。

2?結(jié)果與分析

2.1?米口袋染色體制片的優(yōu)化

由圖1、表1可知，不同預(yù)處理方法及預(yù)處理時(shí)間，米口袋根尖染色體制片的效果不同。當(dāng)預(yù)處理時(shí)間為3 h時(shí)，0.1%秋水仙素溶液預(yù)處理效果最好，得到的分裂相多，染色體濃縮程度適宜，分散性較好，形態(tài)清晰；當(dāng)預(yù)處理時(shí)間為6 h時(shí)，0.01%秋水仙素溶液預(yù)處理效果最好，得到的分裂相多，染色體濃縮程度適宜，分散性較好，形態(tài)清晰。

2.2?米口袋染色體核型分析

2.2.1?染色體數(shù)目?選取米口袋根尖分生組織細(xì)胞分裂相中染色體分散較好的細(xì)胞50個(gè)觀察并統(tǒng)計(jì)，結(jié)果顯示：米口袋染色體數(shù)目在12～16條，其中有44個(gè)細(xì)胞染色體數(shù)目為14條，占計(jì)數(shù)細(xì)胞的90%，4個(gè)細(xì)胞染色體為12條，占計(jì)數(shù)細(xì)胞的8%，2個(gè)細(xì)胞染色體為16條，占計(jì)數(shù)細(xì)胞的4%。根據(jù)李懋學(xué)等的標(biāo)準(zhǔn)，確定米口袋體細(xì)胞染色體數(shù)目為2n=14（圖2）。

2.2.2?染色體形態(tài)?根據(jù)圖2、圖3和表2可知，米口袋體細(xì)胞染色體數(shù)目為2n=14，共7對(duì)染色體，為二倍體植物。米口袋核型公式為K（2n）=2x=14=10m+4sm，具中部著絲點(diǎn)染色體（m）的為第1、2、3、4、7對(duì)染色體，具近中部著絲點(diǎn)染色體（sm）的為第4、5對(duì)染色體。最長(zhǎng)染色體為0.48 μm，最短染色體為0.37 μm，染色體長(zhǎng)度變化在0.48～0.37 μm，最長(zhǎng)染色體是最短染色體的1.30倍。相對(duì)長(zhǎng)度變異范圍為13.60～17.91，染色體相對(duì)長(zhǎng)度組成為2n=14=2L+8M2+4M1。染色體長(zhǎng)度比1.30，沒(méi)有臂比大于2的染色體，屬“1A”類型，核型對(duì)稱性明顯。

3?結(jié)論與討論

本試驗(yàn)從優(yōu)化染色體制片技術(shù)幵始，探索米口袋染色體核型特征，為該屬植物及該區(qū)域植物的研究提供細(xì)胞學(xué)依據(jù)。植物染色體核型研究的首要環(huán)節(jié)是染色體制片技術(shù)，因而制片技術(shù)的好壞直接影響核型分析的成功與否。良好的染色體制片受多種因素影響，其中合適的預(yù)處理液及其濃度和處理時(shí)間是制片的關(guān)鍵，對(duì)染色體制片的質(zhì)量至關(guān)重要。預(yù)處理效果好，不僅可以獲得較多的處于中期分裂相的染色體，而且可以使染色體分散開(kāi)，有助于核型分析。因此，在試驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)該特別注意預(yù)處理的方法。本研究結(jié)果顯示當(dāng)預(yù)處理時(shí)間為3 h時(shí)，0.1%秋水仙素溶液預(yù)處理效果最好；當(dāng)預(yù)處理時(shí)間為6 h時(shí)，0.01%秋水仙素溶液預(yù)處理效果最好。得到的中期分裂相多，染色體濃縮程度適宜，分散性較好，形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰，有助于米口袋染色體核型分析。

染色體核型對(duì)細(xì)胞遺傳學(xué)和細(xì)胞分類學(xué)具有重要的意義，為植物分類及種間親緣關(guān)系、種質(zhì)資源鑒定提供細(xì)胞遺傳學(xué)基礎(chǔ)和依據(jù)。本研究從細(xì)胞學(xué)水平出發(fā)，采用染色體常規(guī)壓片技術(shù)對(duì)江蘇省南京市野生米口袋進(jìn)行核型分析。結(jié)果表明，米口袋的染色體數(shù)目為14條，與楊德奎的研究結(jié)果一致。但米口袋染色體核型公式及染色體相對(duì)長(zhǎng)度組成有別于本研究結(jié)果，楊德奎的研究結(jié)果顯示，米口袋核型公式為K（2n）=2x=14=14m，染色體相對(duì)長(zhǎng)度組成為2n=14=6M2+8M1；而本試驗(yàn)的研究表明，米口袋核型公式為K（2n）=2x=14=10m+4sm，染色體相對(duì)長(zhǎng)度組成為2n=14=2L+8M2+4M1，造成這種差異的原因可能是試驗(yàn)材料來(lái)源不同。本研究表明米口袋屬“1A”類型，核型對(duì)稱性明顯，說(shuō)明其進(jìn)化程度較低。

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（責(zé)任編輯：柯文輝）

收稿日期：2023-07-20

作者簡(jiǎn)介：李玉萍，女，1976年生，博士，副教授，主要從事園林植物遺傳育種和應(yīng)用研究。

*通信作者：朱士農(nóng)，男，1963年生，博士，教授，主要從事園藝植物栽培、新品種選育的研究（E-mail：zsn@ jit.edu.cn）。

基金項(xiàng)目：南京市綠化園林局科技項(xiàng)目（YLKJ202111JH）。