川陜花椒根皮提取物對人角質(zhì)形成細(xì)胞輻射損傷的防護作用

王成芳,齊雪松,邵 帥,杜樹山,茍 巧

(1.中國疾病預(yù)防控制中心輻射防護與核安全醫(yī)學(xué)所,輻射防護與核應(yīng)急中國疾病預(yù)防控制中心重點實驗室,北京 100088; 2.北京師范大學(xué)地理科學(xué)學(xué)部,北京 100875)

放射性皮膚損傷是放射治療(簡稱放療)中常見的并發(fā)癥之一。據(jù)統(tǒng)計,臨床上約有90%的腫瘤患者在放療中或放療后出現(xiàn)不同程度的皮膚損傷[1],輕癥表現(xiàn)為脫屑、紅腫、瘙癢,引發(fā)皮膚炎癥,重癥時發(fā)生潰瘍,導(dǎo)致皮膚組織壞死,甚至癌變[2-3]。放療所致皮膚損傷可能面積并不大,但其損傷嚴(yán)重時可到達軟組織、肌肉組織甚至是骨組織,易遷延不愈反復(fù)發(fā)作,不僅降低患者的生存質(zhì)量,也影響患者的治療進程和效果[4]。盡管臨床上已經(jīng)對放射性皮膚損傷的發(fā)病機制做了大量的探索與研究,研發(fā)了多種用于防治皮膚不良反應(yīng)的藥物,但是由于放射損傷機制復(fù)雜、患者個體化差異大等因素,療效并不穩(wěn)定,現(xiàn)行的臨床治療方案還沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)[5]。因此,仍需積極開發(fā)療效顯著且穩(wěn)定的放射性皮膚損傷防治藥物。

花椒屬植物富含萜類、生物堿、香豆素、木脂素、酰胺、黃酮和脂肪酸類化合物[6],除果實外,其根、莖、葉均可入藥,無論是中醫(yī)臨床還是基礎(chǔ)研究,花椒屬植物被應(yīng)用于皮膚疾病由來已久[7-8]。然而,川陜花椒(ZanthoxylumpiasezkiiMaxim.)根皮提取物(ZPE)在放射性皮膚損傷中的作用研究目前未見相關(guān)報道。因此,本研究以人皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT為受試對象,探討川陜花椒根皮提取物(ZPE)對其輻射損傷的影響及其機制,旨在為ZPE作為放射性皮膚損傷防治藥物的研發(fā)提供理論依據(jù),也為擴大川陜花椒的藥用價值提供新的方向。

1 材料與方法

1.1 儀器、材料與主要試劑

CCK-8 試劑盒(日本同仁化學(xué)研究所);Annexin V-PE/7AAD細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(南京凱基生物有限公司);DCFDA Cellular ROS檢測試劑盒(美國Abcam公司);人IL-1β、人IL-6 ELISA試劑盒(武漢華美生物工程有限公司);磷酸化p38、SAPK/JNK抗體套裝,GAPDH抗體(arigo上海帛龍生物科技有限公司);β-actin抗體(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司);辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記山羊抗兔抗體(北京中杉金橋公司);總蛋白提取、蛋白定量及ECL 發(fā)光檢測試劑盒、標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker(美國Thermo公司)。Multiskan GO型連續(xù)波長酶標(biāo)儀(美國Thermo公司);FACS Cabular流式細(xì)胞儀(美國BD公司);Axiocam ERC5S型倒置顯微鏡(德國ZEISS公司);電泳儀、化學(xué)發(fā)光檢測系統(tǒng)(美國Bio-Rad 公司)。

1.2 藥物配制

ZPE為川陜花椒根皮提取物,由北京師范大學(xué)地理科學(xué)學(xué)部杜樹山教授實驗室提供,植物樣本采集于甘肅文縣,經(jīng)北京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院劉全儒教授鑒定,自然陰干粉碎。提取方法如下:藥材粉碎后取粗粉樣品100 g,按照料液比1∶10加入甲醇,超聲提取3次,每次超聲30 min,減壓抽濾,合并濾液并減壓濃縮至浸膏,稱其浸膏重量,并計算出膏率為13%。用高糖DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液為溶劑,配制成10 mg/mL的ZPE溶液,-20 ℃凍存?zhèn)溆谩＜?xì)胞實驗時用細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋成不同濃度作用于細(xì)胞。

1.3 照射條件

北京師范大學(xué)化學(xué)學(xué)院鈷源60Co γ射線照射,源強5 000 Ci,照射距離為79 cm,劑量率為1.0 Gy/min。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)

人皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT(購自廣州吉妮歐生物科技有限公司),用含10%胎牛血清、1%青鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)液于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。每2～3 d換1次培養(yǎng)基,每周傳代1～2次。

1.5 CCK-8檢測細(xì)胞存活率

取對數(shù)生長期的HaCaT細(xì)胞(6×103個/孔)接種于96孔板,每組設(shè)6個復(fù)孔,分別給予0、2、4、6、8、10、15 Gyγ射線照射,于照后24、48、72、96 h進行檢測,或在照射前用含不同濃度(0、62.5 μg/mL、125 μg/mL、250 μg/mL、500 μg/mL、1 mg/mL、2 mg/mL、4 mg/mL)ZPE的培養(yǎng)基預(yù)處理細(xì)胞1 h,經(jīng)0、8.0 Gy γ射線照射(設(shè)立空白對照組和照射對照組),照后72 h進行檢測,按照CCK-8試劑盒說明書操作,全波長酶標(biāo)儀測定各孔450 nm波長下吸光度值(OD),計算細(xì)胞存活率,細(xì)胞存活率(%)=100×(OD處理組-OD培養(yǎng)液對照組)/(OD空白對照組-OD培養(yǎng)液對照組)。

1.6 克隆形成實驗

取對數(shù)生長期的細(xì)胞分別接種于培養(yǎng)瓶內(nèi),實驗分為4組:(1) 空白對照組;(2) ZPE組,藥物濃度為2 mg/mL;(3) 照射對照組;(4) 照射對照組+ZPE組。待細(xì)胞貼壁后繼續(xù)培養(yǎng),照射前1 h加藥處理,(3)、 (4)組細(xì)胞分別給予4.0 Gy 的照射劑量。照射后各組細(xì)胞懸液按比例稀釋分別接種于6孔板中,并輕輕轉(zhuǎn)動,使細(xì)胞分散均勻,靜置培養(yǎng)12天。棄去培養(yǎng)液,PBS清洗兩遍,加1∶3醋酸/甲醇固定10 min,去固定液,加適量Giemsa應(yīng)用染色液染色30 min,用流水緩慢洗去染色液,空氣干燥。低倍光學(xué)顯微鏡下計數(shù)≥50個細(xì)胞的克隆數(shù),以0 Gy組集落形成率為對照,計算不同照射劑量下的細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)(surviving fraction,SF),每組6個復(fù)孔。

細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)按公式計算:細(xì)胞貼瓶率(plating efficiency,PE)=100%×克隆數(shù)/細(xì)胞接種數(shù);細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)(SF)= 100% ×受照射細(xì)胞的貼瓶率(PE)/對照細(xì)胞的貼瓶率(PE)。

1.7 細(xì)胞凋亡和細(xì)胞內(nèi)ROS檢測

取對數(shù)生長期的HaCaT細(xì)胞(1.8×105個/孔)接種于6 孔板中,每組設(shè)3個復(fù)孔,用含2 mg/mL ZPE的培養(yǎng)基預(yù)處理細(xì)胞1 h后,經(jīng)8.0 Gy γ射線照射(設(shè)立空白對照組和照射對照組),照后繼續(xù)培養(yǎng)24 h和48 h,按照Annexin V-PE/7AAD細(xì)胞凋亡和DCFDA Cellular ROS檢測試劑盒說明書操作。經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測,計算細(xì)胞凋亡率和壞死率;ROS以流式細(xì)胞儀檢測熒光強度的幾何均值(Geo Mean)計算結(jié)果,進行各組比較分析。

1.8 細(xì)胞分泌IL-1β和IL-6檢測

細(xì)胞接種、實驗分組、照射劑量以及ZPE濃度同1.7細(xì)胞凋亡檢測,分別于照射后24 h和48 h收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液。按ELISA檢測試劑盒說明書步驟操作。IL-1β和IL-6以濃度(pg/mL)計算結(jié)果,進行各組比較分析。

1.9 Western blot檢測蛋白表達

細(xì)胞接種、實驗分組、照射劑量以及ZPE濃度同1.7細(xì)胞凋亡檢測,照射后24 h收獲細(xì)胞。提取細(xì)胞總蛋白40 μg進行聚丙烯酰胺凝膠電泳及轉(zhuǎn)膜。5%BSA封閉液封閉1 h,一抗(兔抗人p38、磷酸化p38、JNK、磷酸化JNK)1∶1 000稀釋,4 ℃孵育過夜;二抗(辣根酶標(biāo)記山羊抗兔)1∶5 000 稀釋,常溫孵育1 h。分別用β-actin(1∶3 000 稀釋)和GAPDH(1∶40 000稀釋)抗體作為內(nèi)參照。經(jīng)化學(xué)發(fā)光液孵育,Bio-Rad ChemiDoc XRS+化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)顯影拍照,圖片采用Image J圖像處理軟件進行灰度分析。

1.10 統(tǒng)計學(xué)方法

所有計量資料均采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。所有數(shù)據(jù)均進行方差齊性檢驗:方差齊,多組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析,兩組數(shù)據(jù)比較采用q檢驗;方差不齊,采用秩和檢驗。p<0.05時認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 60Co γ射線照射對HaCaT細(xì)胞存活率的影響

檢測不同劑量(0、2、4、6、8、10、15 Gy)γ射線照射后24～96 h,HaCaT細(xì)胞的存活情況示于圖1。圖1結(jié)果顯示,隨著受照劑量的增加以及受照后時間的延長,細(xì)胞的存活率顯著降低(p=2.3×10-6～5.2×10-3),在受照后72 h和96 h,細(xì)胞的劑量效應(yīng)梯度明顯。細(xì)胞經(jīng)8.0 Gy照射后72 h的存活率為50%,為HaCaT細(xì)胞的半數(shù)致死劑量。因此,選擇8.0 Gy和72 h作為后續(xù)ZPE抗輻射作用濃度篩選實驗的照射劑量點和照射后檢測時間點。

**與空白對照組比較,p<0.01。

2.2 ZPE對60Co γ射線照射后HaCaT細(xì)胞存活的影響

不同濃度的ZPE對4 mg/mL 細(xì)胞的細(xì)胞毒性結(jié)果如圖2所示。由圖2可見,1 mg/mL 和2 mg/mL ZPE作用后72 h,細(xì)胞的存活率略有增高(104%和105%,p=0.035和p=0.007),當(dāng)藥物濃度達到4 mg/mL時,與空白組比較,細(xì)胞的存活率為53%,細(xì)胞存活顯著降低(p=5.4×10-5),說明4 mg/mL ZPE對HaCaT具有細(xì)胞毒性。

*與空白對照組比較,p<0.05; **與空白對照組比較,p<0.01。

HaCaT細(xì)胞照射前經(jīng)不同濃度ZPE(0、62.5 μg/mL、125 μg/mL、250 μg/mL、500 μg/mL、1 mg/mL、2 mg/mL、4 mg/mL)處理后,再進行8.0 Gy γ射線照射。結(jié)果顯示,ZPE對HaCaT細(xì)胞具有明顯的輻射防護作用,且藥物在0～2 mg/mL濃度范圍內(nèi),與細(xì)胞的存活率具有良好的濃度-效應(yīng)關(guān)系,即隨著濃度升高,細(xì)胞存活率逐漸增加(見圖3,p=1.2×10-4～9.2×10-3)。在藥物濃度為2 mg/mL時,受照細(xì)胞的存活率達到79%,顯著降低了細(xì)胞的輻射損傷。

△△與照射對照組比較,p<0.01。

HaCaT細(xì)胞經(jīng)8.0 Gy γ射線照射72 h后,細(xì)胞存活率降低50%。與相應(yīng)濃度ZPE預(yù)處理組未受照細(xì)胞相比,62.5 μg/mL ～ 1 mg/mL預(yù)處理組受照細(xì)胞存活率降低幅度仍達40%～49%,而2 mg/mL ZPE預(yù)處理組受照細(xì)胞的存活率僅降低26%,4 mg/mL ZPE預(yù)處理組受照細(xì)胞的存活率僅降低11%,但該濃度ZPE對HaCaT具有細(xì)胞毒性。因此,選擇2 mg/mL的ZPE作為后續(xù)的實驗藥物濃度。

2.3 ZPE對60Co γ射線照射后HaCaT細(xì)胞克隆形成的影響

圖4為ZPE對60Co γ射線照射后HaCaT細(xì)胞克隆形成的影響結(jié)果。由圖4可見,細(xì)胞經(jīng)4.0 Gy的γ射線照射后,細(xì)胞克隆數(shù)顯著降低,照射(IR)組細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)僅為9.58%;經(jīng)ZPE作用后,細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)為26.50%,與IR組比較顯著升高(p=0.006)。

圖4 ZPE對γ射線照射后HaCaT細(xì)胞克隆形成的影響

2.4 ZPE對60Co γ射線照射后HaCaT細(xì)胞凋亡和壞死的影響

圖5和表1分別給出了ZPE對60Co γ射線照射后HaCaT細(xì)胞凋亡和壞死的影響結(jié)果。如圖5和表1所示,HaCaT細(xì)胞經(jīng)8.0 Gy γ射線照射后24 h和48 h,細(xì)胞凋亡率分別為14.98%和19.99%,顯著高于空白對照組(p=0.001,p=3.2×10-4);照射前1 h給予2 mg/mL ZPE后,細(xì)胞凋亡率和壞死率均顯著降低(p=7.5×10-4～2.1×10-3)。以上結(jié)果表明,ZPE預(yù)處理減少了受照細(xì)胞的凋亡和壞死。

表1 ZPE對受照HaCaT細(xì)胞的凋亡率和壞死率的影響

圖5 ZPE對受照HaCaT細(xì)胞凋亡和壞死的影響(流式細(xì)胞儀散點圖)

2.5 ZPE對60Co γ射線照射后HaCaT細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測受照后24 h和48 h HaCaT細(xì)胞內(nèi)ROS水平,結(jié)果如圖6所示。由圖6可見,受照HaCaT細(xì)胞內(nèi)ROS熒光強度顯著增加(與空白組比較,p=6.3×10-4,p=2.3×10-4);在2 mg/mL ZPE的作用下,細(xì)胞內(nèi)ROS熒光強度顯著降低(與照射組比較,p=0.001),且與空白對照組水平相近,其差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p=0.133,p=0.125)。

**與空白對照組比較,p<0.01;△△與照射對照組比較,p<0.01。

2.6 ZPE對60Co γ射線照射后HaCaT細(xì)胞分泌IL-1β和IL-6的影響

表2為ZPE對γ射線照射后HaCaT細(xì)胞分泌IL-1β和IL-6的影響結(jié)果。由表2可見,照射后24 h和48 h細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-1β和IL-6的濃度均顯著升高(p=5.2×10-6～2.3 ×10-4)。照后48 h,2 mg/mL ZPE預(yù)處理組的細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-1β和IL-6的濃度均顯著降低(p=0.001);其中,ZPE組與空白對照組的相比,細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-6的濃度水平無統(tǒng)計學(xué)差異(p=0.241)。表明ZPE干預(yù)可顯著抑制受照細(xì)胞內(nèi)炎癥因子IL-1β和IL-6的分泌。

表2 ZPE對γ射線照射后HaCaT細(xì)胞分泌IL-1β和IL-6的影響

2.7 ZPE對60Co γ射線照射后HaCaT細(xì)胞內(nèi)p38和JNK蛋白表達水平的影響

p38和JNK蛋白同屬應(yīng)激激活的蛋白激酶,其磷酸化會影響細(xì)胞生長、周期和凋亡等細(xì)胞過程,并參與炎癥、應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)控,圖7給出了 ZPE對60Co γ射線照射后HaCaT細(xì)胞內(nèi)p38和JNK蛋白表達水平的影響結(jié)果。如圖7所示,HaCaT細(xì)胞經(jīng)8.0 Gy γ射線照射后,p38和JNK蛋白磷酸化水平顯著上升(p=2.6×10-4,p=5.5×10-4);細(xì)胞受照前經(jīng)2 mg/mL ZPE作用后,二者蛋白磷酸化水平明顯降低(p=4.2×10-4,p=0.021)。表明ZPE可能通過調(diào)節(jié)p38和JNK蛋白磷酸化水平,減輕γ射線照射引起的HaCaT細(xì)胞凋亡。

**與空白對照組比較,p<0.01;△與照射對照組比較,p<0.05;△△與照射對照組比較,p<0.01。

3 討論

中醫(yī)認(rèn)為放射性皮炎的發(fā)生機制為熱毒侵膚、脈絡(luò)阻滯,從發(fā)病機制入手采用涼血解毒、清熱燥濕、祛腐生肌類的中藥制劑進行整體辨證治療[9]。川陜花椒不僅具有溫中止痛、散寒除濕、止癢殺蟲的功效,在化妝品中作為植物原料,可促進皮膚新陳代謝,具有抗皺、抗氧化等作用。有文獻報道,花椒樹皮提取物及其活性成分可以抑制紫外線UVB誘導(dǎo)的炎癥因子和MMP的表達,進而抵抗皮膚老化,可用作防曬霜的活性成分[10]。本文研究顯示,8.0 Gy γ射線照射可對人角質(zhì)形成細(xì)胞產(chǎn)生較嚴(yán)重的輻射損傷,照后24 h和48 h大量細(xì)胞發(fā)生凋亡和壞死,照后72 h細(xì)胞的存活率降低至50%。細(xì)胞在照射前經(jīng)川陜花椒根皮提取物(ZPE)作用后,不僅減少了細(xì)胞凋亡和壞死,也大幅提升了HaCaT細(xì)胞的存活率,表明川陜花椒根皮對輻射引起的人角質(zhì)形成細(xì)胞損傷具有預(yù)防作用,這可能與花椒中富含酰胺、生物堿、黃酮等抗輻射活性成分有關(guān)[7,10]。同時,細(xì)胞平板克隆實驗表明,在照射劑量為4.0 Gy的條件下,ZPE組細(xì)胞的增殖情況顯著高于照射組,也佐證了ZPE對HaCaT細(xì)胞的輻射防護作用。

抑制ROS的產(chǎn)生是中藥作用于機體抗輻射的主要途徑之一[11]。人體受到射線照射后會產(chǎn)生大量的活性氧自由基(ROS),ROS會誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生脂質(zhì)過氧化連鎖反應(yīng),損傷核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子和糖脂類等生物小分子[12],進而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡,抑制細(xì)胞增殖等而產(chǎn)生皮膚損傷,從而引發(fā)一系列炎癥[13]。本文的研究結(jié)果顯示,γ射線照射會顯著升高HaCaT細(xì)胞內(nèi)的ROS水平;在照射前經(jīng)川陜花椒提取物ZPE預(yù)處理后,可清除輻射產(chǎn)生的ROS,減少輻射誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞氧化損傷。

放射性皮膚損傷以炎性反應(yīng)為主。早期炎性反應(yīng)主要是由促炎細(xì)胞因子如IL-1、IL-6、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α、趨化因子如IL-8、酪氨酸激酶受體和粘附分子ICAM-1、VCAM、E-選擇蛋白等引起[14]。表皮是皮膚組織的最外層,其中角質(zhì)形成細(xì)胞(keratinocytes,KC)含量最為豐富,占表皮細(xì)胞90%以上,KC可通過釋放細(xì)胞因子間接地影響機體免疫功能。IL-1β和IL-6是KC分泌的重要細(xì)胞因子,皮膚組織液中的IL-1β和IL-6主要來自KC。因此,本研究對HaCaT細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-1β和IL-6的分泌水平進行研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn),HaCaT細(xì)胞經(jīng)8.0 Gy γ射線照射后24 h和48 h,細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-1β和IL-6濃度顯著升高;受照前經(jīng)ZPE作用的HaCaT細(xì)胞分泌IL-1β和IL-6的水平均顯著降低,提示ZPE可能通過抑制受照人角質(zhì)形成細(xì)胞內(nèi)炎癥因子IL-1β和IL-6的分泌減輕放射性皮膚損傷。

MAPK級聯(lián)是細(xì)胞內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)之一,MAPK信號通路中的JNK和p38主要對炎性因子和多種類型的細(xì)胞應(yīng)激信號進行傳導(dǎo),與細(xì)胞的炎癥反應(yīng)密切相關(guān)[15]。根據(jù)文獻報道花椒屬植物及其活性物質(zhì)在一些炎癥疾病中,藥物作用與下調(diào)MAPK(JNK、ERK 和 p38)信號通路磷酸化密切相關(guān)[16-17]。本研究發(fā)現(xiàn),HaCaT細(xì)胞在受照后24 h,照射組p38與JNK蛋白磷酸化水平明顯升高,經(jīng)過預(yù)防給予ZPE后,受照細(xì)胞的p38和JNK磷酸化水平則顯著降低。有文獻報道[18],皮膚炎癥性疾病的炎癥反應(yīng)可通過MAPK信號通路進行調(diào)控,促進細(xì)胞炎癥因子如IL-1β、IL-6和IL-8的釋放。這與本研究中受照細(xì)胞的培養(yǎng)液內(nèi)IL-1β、IL-6的濃度檢測結(jié)果相一致,即電離輻射激活MAPK信號通路,促進炎癥反應(yīng)發(fā)生;ZPE可通過降低JNK和p38蛋白磷酸化水平,減少IL-1β、IL-6等炎性因子的分泌,從而減輕皮膚炎癥反應(yīng)。

綜上所述,本文初步探索了ZPE對HaCaT細(xì)胞輻射損傷的防護作用,其機制與減少細(xì)胞炎癥因子IL-1β和IL-6分泌、降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平、降低p38和JNK蛋白磷酸化有關(guān)。但川陜花椒的化學(xué)成分研究報道很少,關(guān)于其活性物質(zhì)基礎(chǔ)還需要進一步的探索挖掘,為研究預(yù)防和治療放射性皮炎的藥物提供依據(jù)。