四氫生物蝶呤對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖、遷移及凋亡的影響

馬文婷，張晨，謝青

1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院三全學(xué)院臨床學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003； 2.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院三全學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003

胰腺癌是一種發(fā)病隱匿、惡性程度極高的消化系統(tǒng)腫瘤，是癌癥相關(guān)死亡的第4 大因素，且患者死亡率以每年1%的速度上升，患者總體的5 年生存率為10%，晚期患者5 年生存率不足3%[1]。由于胰腺癌起病隱匿、早診困難，大多患者就診時(shí)已是晚期而失去手術(shù)機(jī)會(huì)，主要靠藥物治療。目前胰腺癌治療的一線用藥是吉西他濱，然而其單獨(dú)用藥的緩解率不足10%，吉西他濱與其他藥物組成的二聯(lián)療法或5-氟尿嘧啶+奧沙利鉑+伊立替康+亞葉酸鈣（FOLFIRINOX）四聯(lián)化療藥物療效稍有改善但副反應(yīng)也大大增加[2,3]，其有限的療效與難以避免的毒副反應(yīng)促使研究者尋找新的藥物以提高治療效果，改善患者預(yù)后。四氫生物蝶呤（tetrahydrobiopterin，BH4）屬于芳香族氨基酸羥化酶的輔酶，是一氧化氮合成的輔因子，參與NO合成等許多生理過程，也參與炎癥、心血管疾病等病理過程[4～6]。墨蝶呤（sepiapterin）為四氫生物蝶呤的前體，其可通過促進(jìn)NO 產(chǎn)生而促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞凋亡，抑制乳腺癌細(xì)胞增殖，抑制腫瘤生長(zhǎng)[7,8]，墨蝶呤通過下調(diào)p70s6k依賴的血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體2（vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR-2）表達(dá)來抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖和遷移[9]。BH4 處理黑色素瘤細(xì)胞使NO 濃度升高，可降低腫瘤細(xì)胞活力、細(xì)胞增殖能力和腫瘤細(xì)胞形成黑色素瘤球形體的能力[10]，然而，BH4 在人胰腺癌細(xì)胞（human pancreatic cancer cells，HPAC）中的作用及可能機(jī)制尚未見報(bào)道。本文初步研究BH4 對(duì)HPAC 與人原位胰腺腺癌細(xì)胞（biopsy xenograft of pancreatic carcinoma line-3，BxPC-3）增殖、凋亡和遷移等生物學(xué)特性的影響，為胰腺癌的臨床治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞培養(yǎng) HPAC 細(xì)胞株，BxPC-3 細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心細(xì)胞庫(kù)。培養(yǎng)液分別為DMEM 與RPMI-1640（含10% FBS，100 U/L 青霉素及100 μg/mL 鏈霉素），37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱，每2～3 d 傳代1 次，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 主要試劑 四氫生物蝶呤（tetrahydrobiopterin）購(gòu)自上海芮暉化工科技有限公司，RPMI-1640 培養(yǎng)基，DMEM 高糖培養(yǎng)基，胎牛血清（Fetal Bovine Serum，F(xiàn)BS）購(gòu)自美國(guó)Hyclone 公司，CCK-8 細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒，細(xì)胞凋亡-Hoechst 染色試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，E-cadherin 抗體，N-cadherin 抗體，GAPDH 抗體購(gòu)自武漢三鷹生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 CCK-8 檢測(cè) 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HPAC 與BxPC-3接種于96 孔中培養(yǎng)12 h，細(xì)胞分為對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組，對(duì)照組正常培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)組分別加入終濃度為2、4、8、12 μmol/L 的BH4 培養(yǎng)24 h，每孔加入100 μL CCK-8，37 ℃培養(yǎng)2 h 后，酶標(biāo)儀450 nm 處測(cè)OD。

1.2.2 Hoechst 染色 分別將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HPAC 與BxPC-3 接種于6 孔板中（內(nèi)含無菌蓋玻片）培養(yǎng)12 h，對(duì)照組正常培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)組分別加入終濃度為2、4、8、12 μmol/L 的BH4 培 養(yǎng)24 h，按 照 使 用 說 明 書 進(jìn) 行Hoechst 染色，封片，顯微鏡下選擇視野，觀察染色結(jié)果并拍照，每組設(shè)置5 個(gè)副孔，計(jì)算凋亡指數(shù)，凋亡指數(shù)=凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.2.3 劃痕實(shí)驗(yàn) 分別將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HPAC 與BxPC-3 接 種 于6 孔 板 中，培 養(yǎng)12 h 后 用1 mL 無 菌 藍(lán)色吸頭在孔的中間劃痕，盡量保證劃痕的寬度一致，棄去培養(yǎng)液，每孔加入1 mL 無血清培養(yǎng)液以洗去懸浮的細(xì)胞，培養(yǎng)24 h 鏡下觀察細(xì)胞愈合面積，利用Image J 軟件測(cè)量愈合面積。

1.2.4 RT-qPCR 檢測(cè) 提取對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的總RNA，Trizol Reagent 裂解細(xì)胞利用三氯甲烷，異丙醇及75%乙醇提取RNA，無RNA 酶水溶解RNA，檢測(cè)RNA 濃度及純度（OD 260/280 應(yīng)為1.9～2.1），將提取的RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA 為模板，應(yīng)用qRT-PCR 檢測(cè)試劑盒進(jìn)行PCR 擴(kuò)增反應(yīng)，最后以2-ΔΔCt法對(duì)獲取的相應(yīng)數(shù)據(jù)實(shí)施相對(duì)定量分析。PCR 反應(yīng)按照說明書采用兩步法進(jìn)行，反應(yīng)條件：94 ℃30 s；94 ℃5 s；56 ℃15 s；72 ℃10 s，設(shè)置40 個(gè)循環(huán)。Notch1 引物序列正向：5'-CAATGTGGATGCC GCAGTTGTG-3'，反向：5'-CAGCACCTTGGCGGTCT CGTA-3'，內(nèi)參引物正向：5'-GGCACCACACCTTCTA CAAT-3'，反向：5'-GTGGTGGTGAAGCTGTAGCC-3'。

1.2.5 Western blotting 檢測(cè) 培養(yǎng)24 h 的對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞（12 μM BH4 培養(yǎng)），棄去培養(yǎng)液，每皿加入500 μL RIPA 裂解液裂解細(xì)胞，提取總蛋白。常規(guī)SDS-PAGE 電泳、轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，ECadherin 抗 體（1：500），N-cadherin 抗 體（1：500）及GAPDH 抗體（1：10000）4 ℃孵育過夜，熒光二抗室溫孵育2 h 后，ECL 顯影、曝光，Image J 軟件分析灰度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

利用SPSS19.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組之間比較利用t檢驗(yàn)，P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BH4 對(duì)HPAC 及BxPC-3 細(xì)胞活力影響

CCK-8 測(cè)定不同濃度的BH4 對(duì)胰腺癌細(xì)胞HPAC 和BxPC-3 細(xì)胞活力的影響，結(jié)果如表1 所示，隨著BH4 濃度的增加，細(xì)胞的活力逐漸降低，與對(duì)照組相比，8 μmol/L 和12 μmol/L 的BH4 處理的HPAC細(xì)胞活力下降明顯，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.05）；8 μmol/L 和12 μmol/L 的BH4 處理的BxPC-3 細(xì)胞活力下降明顯，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，P＜0.05）。提示BH4 可降低胰腺癌細(xì)胞的活力。

表1 BH4 對(duì)HPAC 和BxPC-3 細(xì)胞活力的影響（OD）Tab.1 The effect of BH4 on the viability of HPAC cells and BxPC-3 cells (OD, )

表1 BH4 對(duì)HPAC 和BxPC-3 細(xì)胞活力的影響（OD）Tab.1 The effect of BH4 on the viability of HPAC cells and BxPC-3 cells (OD, )

注：*P＜0.05，**P＜0.01，與對(duì)照組比較Note:*P＜0.05, **P＜0.01, vs control group

BxPC-3 0.913±0.010 0.892±0.013 0.853±0.022 0.536±0.024*0.507±0.026*組別Group對(duì)照組Control group 2 μmol/L BH4 4 μmol/L BH4 8 μmol/L BH4 12 μmol/L BH4 HPAC 0.974±0.023 0.848±0.037 0.811±0.025 0.623±0.018*0.512±0.021**

2.2 BH4 對(duì)HPAC 和BxPC-3 細(xì)胞凋亡影響

Hoechst 法檢測(cè)不同濃度的BH4 對(duì)胰腺癌細(xì)胞HPAC 和BxPC-3 細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果如圖1、表2 所示，隨著BH4 濃度的增加，細(xì)胞的凋亡率逐漸增加，與對(duì)照組相比，8 μmol/L 和12 μmol/L 的BH4 處理的HPAC 細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0.05，P＜0.05）；8 μmol/L 和12 μmol/L 的BH4 處 理 的BxPC-3 細(xì) 胞 凋 亡 率 顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）。提示BH4 可促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞凋亡。

圖1 BH4 對(duì)HPAC 和BxPC-3 細(xì)胞凋亡影響B(tài)ar=50 μmFig.1 The effect of BH4 on the apoptosis of HPAC cells and BxPC-3 cells (Bar=50 μm)

表2 BH4 對(duì)HPAC 和BxPC-3 細(xì)胞凋亡影響（%）Tab.2 The effect of BH4 on apoptosis of HPAC cells and BxPC-3 cells (%)

2.3 BH4 對(duì)HPAC 及BxPC-3 細(xì)胞遷移能力影響

利用劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)BH4 對(duì)胰腺癌細(xì)胞HPAC 和BxPC-3 細(xì)胞遷移的影響，結(jié)果如圖2，表3 顯示，與對(duì)照組細(xì)胞的愈合面積（55.46%）相比較，8 μmol/L 與12 μmol/L 的BH4 處理的HPAC 愈合面積下降明顯（P＜0.05，P＜0.01）；與對(duì)照組細(xì)胞的愈合面積（50.75%）相比較，8 μmol/L 與12 μmol/L 的BH4 處理的BxPC-3愈合面積下降明顯（P＜0.05，P＜0.05）。提示BH4 可降低胰腺癌細(xì)胞的遷移能力。

圖2 BH4 對(duì)HPAC 和BxPC-3 細(xì)胞遷移影響B(tài)ar=50 μmFig.2 The effect of BH4 on migration ability of HPAC cells and BxPC-3 cells (Bar=50 μm)

表3 BH4 對(duì)HPAC 和BxPC-3 細(xì)胞遷移影響（%）Tab.3 The effect of BH4 on migration ability of HPAC cells and BxPC-3 cells (%)

2.4 BH4 對(duì)Notch1 mRNA 表 達(dá) 影 響

檢測(cè)細(xì)胞活性，發(fā)現(xiàn)隨著BH4 濃度的增加，細(xì)胞活性逐漸降低，在8 μmol/L 與12 μmol/L 細(xì)胞活性顯著降低，利用RT-qPCR 檢測(cè)12 μmol/L BH4 對(duì)胰腺癌細(xì)胞HPAC 和BxPC-3 中Notch1 mRNA 的影響，結(jié)果如圖3 所示，與對(duì)照組相比較，12 μmol/L BH4 誘導(dǎo)24 h，細(xì)胞中Notch1 mRNA 的表達(dá)均顯著降低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖3 BH4 對(duì)HPAC 與BxPC-3 細(xì) 胞 中Notch1 mRNA 表達(dá)影響 注：*P＜0.05，與對(duì)照組比較Fig.3 The effect of BH4 on Notch1 mRNA expression in HPAC cells and BxPC-3 cells Note: *P＜0.05, vs control group

2.5 BH4 對(duì)E-cadherin 與N-cadherin 蛋白表達(dá)影響

利用Western blotting 檢測(cè)BH4 對(duì)胰腺癌細(xì)胞HPAC 和BxPC-3 細(xì) 胞 中E-cadherin 與N-cadherin 蛋 白表達(dá)的影響，結(jié)果如圖4，表4 所示，與對(duì)照組相比較，12 μmol/L 的BH4 處 理 的HPAC 和BxPC-3 細(xì) 胞 中Ecadherin 蛋白的相對(duì)表達(dá)量均升高（P＜0.05，P＜0.01），而N-cadherin 蛋白的相對(duì)表達(dá)量均降低（P＜0.05，P＜0.05）。提示BH4 可抑制胰腺癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，降低胰腺癌細(xì)胞的惡性表型。

圖4 BH4 對(duì)HPAC 與BxPC-3 細(xì) 胞 中E-cadherin 與N-cadherin 表 達(dá) 影 響Fig.4 The effect of BH4 on the expression of E-cadherin and N-cadherin in HPAC and BxPC-3 cells

表4 BH4 對(duì)HPAC 與BxPC-3 細(xì) 胞 中E-cadherin 與N-cadherin 表 達(dá) 影 響Tab.4 The effect of BH4 on the expression of E-cadherin and N-cadherin in HPAC and BxPC-3 cells

3 討論

胰腺癌的生存率是所有實(shí)體腫瘤中最差的，近40 年來胰腺癌5 年生存率僅從3%上升至10%，生存率如此低的原因主要包括其惡性程度高、起病隱匿、無典型癥狀、切除率低、復(fù)發(fā)率高、現(xiàn)有治療方法不足等[2,11]。研究者進(jìn)行了大量的研究，胰腺癌仍然是一種致命的疾病，只有少數(shù)患者有機(jī)會(huì)進(jìn)行手術(shù)切除，獲得較好的治療效果。

傳統(tǒng)的吉西他濱或5-氟尿嘧啶（5FU）化療只有0～10%的緩解率，盡管吉西他濱加白蛋白-紫杉醇或吉西他濱聯(lián)合放療或FOLFIRNOX 四聯(lián)療法在臨床得以應(yīng)用[12]，患者的生存率并沒有得到較大的提高，且其毒副作用較大，患者的預(yù)后沒有較大改善。因此，尋找新的藥物期能提高治療效果，改善患者預(yù)后，具有極其重要的意義。

BH4 是一氧化氮合酶（包括內(nèi)皮型一氧化氮合酶eNOS，神經(jīng)元型一氧化氮合酶nNOS，誘導(dǎo)型一氧化氮合酶iNOS）的輔助因子，生理狀態(tài)下，充足的BH4參與NO 合成，當(dāng)其利用度不足時(shí)，可引起一系列的病理變化。

近年研究顯示，BH4 及BH4 的前體墨蝶呤在腫瘤的生長(zhǎng)中發(fā)揮重要作用。補(bǔ)充墨蝶呤可使精氨酸代謝正常，促進(jìn)NO 合成，提高乳腺腫瘤免疫原性，抑制乳腺腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)[8]。墨蝶呤通過下調(diào)p70s6k依賴的VEGFR-2 表達(dá)抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖和遷移[9]。補(bǔ)充外源性BH4 可顯著提高肝癌細(xì)胞內(nèi)BH4 水平，抑制細(xì)胞活力，降低Ki-67 表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[13]。外源性BH4 處理黑色素瘤細(xì)胞可使細(xì)胞內(nèi)NO 濃度升高，超氧負(fù)離子水平降低，進(jìn)而降低細(xì)胞活力與增殖能力，增強(qiáng)黑素瘤細(xì)胞對(duì)凋亡的敏感性，降低黑色素瘤細(xì)胞形成黑色素瘤球形體的能力[10]。提高BH4 水平可以增強(qiáng)免疫，抑制腫瘤生長(zhǎng)[14]。然而，BH4 對(duì)胰腺癌細(xì)胞的作用尚未見報(bào)道。

本研究選取2 種胰腺癌細(xì)胞株，檢測(cè)BH4 對(duì)其作用，CCK-8 結(jié)果顯示，隨著BH4 濃度增加，癌細(xì)胞的活力逐漸降低；Hoechst 染色結(jié)果顯示，隨著BH4 濃度增加，癌細(xì)胞的凋亡數(shù)目逐漸增多，凋亡率提高；劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，BH4 可降低兩種癌細(xì)胞的愈合面積；上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是上皮細(xì)胞來源的惡性腫瘤細(xì)胞獲得遷移和侵襲能力的重要生物學(xué)過程，在腫瘤的發(fā)生和侵襲轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用。E-cadherin 為上皮組織的標(biāo)記物，N-cadherin 為間葉組織的標(biāo)記物，E-cadherin 表達(dá)下調(diào)，N-cadherin 表達(dá)上調(diào)與腫瘤的發(fā)生與轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[15～17]。本 研 究 中Western blotting 結(jié) 果 顯 示，BH4 可促進(jìn)癌細(xì)胞中E-cadherin 表達(dá)，抑制N-cadherin 表達(dá)，提示BH4 可抑制胰腺癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，降低癌細(xì)胞的惡性表型，從而降低癌細(xì)胞遷移侵襲的能力。Notch 受體家族（Notch 1～4）在細(xì)胞的增殖，分化，凋亡和干細(xì)胞維護(hù)等活動(dòng)中發(fā)揮重要作用[18]，Notch 受體已被證實(shí)是幾種類型癌癥的致癌基因，Notch1 在胰腺癌組織表達(dá)升高，參與胰腺癌的進(jìn)展[19～21]。本研究中RT-qPCR 結(jié)果顯示，使用12 μM BH4 誘導(dǎo)24 h，可顯著降低細(xì)胞中Notch1 mRNA 的表達(dá)，這就提示BH4可能通過調(diào)節(jié)Notch1信號(hào)通路的激活而發(fā)揮作用。

綜上所述，本文首次探討B(tài)H4 對(duì)胰腺癌細(xì)胞的影響，BH4 可抑制胰腺癌細(xì)胞增殖活力和細(xì)胞遷移的能力，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而降低癌細(xì)胞的惡性表型，這些作用可能是通過抑制Notch1 信號(hào)通路激活而發(fā)揮，其作用機(jī)制需要進(jìn)一步研究。