消炎止痛膏對脂多糖誘導的C2C12 分化肌管影響

鐘偉興，諶祖江，李俊樺，鄺珊珊，王寧，張璇，李義凱，*

1.南方醫(yī)科大學中醫(yī)藥學院，廣州 510515； 2.南方醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院，廣州 510630

骨骼肌急性鈍挫傷（acute skeletal muscle blunt trauma）指骨骼肌因外界突然直接的暴力作用造成肌纖維損害，出現(xiàn)局部腫脹瘀血，肌纖維斷裂，肌細胞溶解崩塌等，從而導致骨骼肌功能和結構的不可逆損害。由于骨骼肌損傷及修復機制極其復雜，國內(nèi)外學者對其進行了大量的研究，尚未得到統(tǒng)一觀點和意見[1,2]。膏摩療法（ointment massage therapy）[3]是將中藥外用膏藥與按摩手法相結合的治療方法，是中醫(yī)外治法的重要組成部分。本團隊從事膏摩療法對急慢性軟組織疼痛的機制研究和臨床研究，本實驗在臨床研究和動物實驗基礎上開展體外細胞實驗，觀察消炎止痛膏成分對脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導的C2C12 骨骼肌細胞炎癥模型的影響，包括炎癥反應和氧化應激狀態(tài)，探討膏摩療法的膏藥成分對骨骼肌鈍挫傷的療效。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞培養(yǎng) C2C12 細胞系購自中國科學院昆明細胞所，培養(yǎng)于含DMEM/F12 培養(yǎng)基（含10%胎牛血清，1%青霉素-鏈霉素溶液）的培養(yǎng)瓶，置于37 ℃，體積分數(shù)5% CO2孵箱中，隔天換液，觀察細胞形態(tài)和生長情況。

1.2 主要試劑 雙氯芬酸鈉（diclofenac sodium）購自ACMEC 公 司，DMEM/F12 培 養(yǎng) 基 購 自 美 國Gibco 公司，馬血清購自美國Hyclone 公司，胎牛血清購自Biological Industries，胰酶細胞消化液（含0.25%胰酶、0.02% EDTA 和酚紅）和青霉素-鏈霉素溶液購自Beyotime 公司，LPS 購自Solarbio 公司，小鼠IL-1β 和IL-6 的ELISA 檢測試劑盒購自Multisciences 公司。CCK-8 試劑盒購自Fdbio science 公司，超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試 劑 盒 和 丙 二 醛（malondialdehyde, MDA）試劑盒購自南京建成生物工程研究有限公司。

1.3 主要儀器與軟件 正置白光拍照顯微鏡（日本Nikon），酶標檢測儀（美國BioTek），臺式高速冷凍離心機（中國Dragon），Image-Pro Plus 6.0（美國Media Cybemetics）等。

1.2 實驗方法

1.2.1 C2C12 誘導分化模型建立 用胰酶消化增殖培養(yǎng)至80%～90%融合的C2C12 細胞，更換為分化培養(yǎng)基（含2%馬血清），置于37 ℃，體積分數(shù)5% CO2孵箱中培養(yǎng)，每天更換分化培養(yǎng)基，觀察細胞形態(tài)和生長情況，直至出現(xiàn)肌管，并確定最佳分化時間。

1.2.2 實驗分組 C2C12 細胞誘導分化完全后，設置空白組、模型組、雙氯芬酸鈉（陽性對照藥物）組、消炎止痛膏組進行實驗。消炎止痛膏組將中藥血竭、冰片、乳香、沒藥、紅花、兒茶各稱取10 g，放置于潔凈煎藥鍋中，加雙蒸水至沒過藥材1 橫指，浸泡30 min；武火煎煮，沸騰后繼續(xù)煎煮30 min；將熬制好的藥液倒入潔凈的燒杯中，再向煎藥鍋加入適量雙蒸水，武火煎煮30 min；將兩次熬出的藥液混合，用200 目篩過濾2 次后置入坩堝；用水浴鍋蒸發(fā)直至變?yōu)楹隣钏幬铮D移至無菌培養(yǎng)皿，用保鮮膜覆蓋并戳出數(shù)孔，放置-80 ℃冰箱中冷凍24 h；將冷凍好的藥液置于真空冷凍干燥機干燥；收集凍干粉，-80 ℃密閉保存?zhèn)溆?。以上步驟在南方醫(yī)科大學中藥藥理實驗室完成。凍干粉稱重，用含DMEM/F12 的完全培養(yǎng)基配成10 mg/mL 溶液，4 ℃保存。實驗時將溶液稀釋成需要的濃度，現(xiàn)用現(xiàn)配。

雙氯芬酸鈉組將購置的雙氯芬酸鈉粉劑用含DMEM/F12 的完全培養(yǎng)基配成1000 μg/mL 溶液，4 ℃保存。實驗時將溶液稀釋成需要的濃度，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2.3 LPS 介導C2C12 細胞炎癥模型建立 根據(jù)誘導分化模型結果，用96 孔板分化培養(yǎng)C2C12 細胞，加入LPS 溶液并分為低、中、高濃度組（0.1、1、10 μg/mL），分別作用30 min、3 h、12 h、24 h 后用CCK-8 法測定各組細胞活性，用IL-6 ELISA 試劑盒檢測各組各時間點IL-6 濃度，以確定LPS 致炎的最佳濃度及作用時間。

1.2.4 篩選藥物對C2C12 細胞炎癥模型最佳干預濃度 設立雙氯芬酸鈉（陽性對照藥物）組和消炎止痛膏組干預LPS 介導的C2C12 細胞炎癥模型。雙氯芬酸鈉濃度梯度為200、100、50、25、12.5、6.25、3.125 μg/mL，消炎止痛膏濃度梯度50、25、12.5、6.25、3.125、1.5625、0.78125 mg/mL，分別作用24 h，CCK-8 測定各組細胞活性，IL-6 ELISA 試劑盒檢測各組IL-6 濃度，確定雙氯芬酸鈉和消炎止痛膏的最佳干預濃度。

1.2.5 CCK-8 測定細胞活性 調(diào)整C2C12 細胞濃度為1×104/mL，在96 孔板中接種細胞懸液（100 μL/孔），將孔板放置于培養(yǎng)箱（37 ℃，5% CO2）培養(yǎng)至貼壁后給予干預措施。每孔加入CCK-8 溶液10 μL，并重新將孔板放置培養(yǎng)箱中孵育2 h、4 h，分別用酶標儀測定450 nm 處的OD 值。根據(jù)CCK-8 說明書計算細胞存活率。

1.2.6 ELISA 試劑盒檢測IL-1β、IL-6 含量 從孔板中吸出各組細胞培養(yǎng)基，3000 r/min 離心10 min，收集上清，即刻檢測。采用100 μL 反應體系，每組設置3 個復孔，具體操作按Multisciences 公司試劑盒說明書進行。最后使用酶標儀進行雙波長檢測，測定450 nm最大吸收波長和630 nm 參考波長的OD 值。校準后的OD 值為450 nm 的測定值減去630 nm 的測定值。

1.2.7 檢測SOD、MDA 含量 從孔板中吸出各組細胞培養(yǎng)基，3500 r/min 離心10 min，收集上清進行SOD、MDA 測定。取出96 孔板，按照說明書加入標準孔、空白孔、測定孔、對照孔相應試劑及樣品，渦旋混勻器混勻，95 ℃水浴30 min，取出冷卻，3500 r/min離心10 min，取上清，于相應波長處，用酶標儀測定各管吸光度，并根據(jù)公式：血清MDA 含量（nmol/mL）=（測定OD-對照OD）/（標準OD-空白OD）×標準品濃度（10 nmol/mL）×樣本測試前稀釋倍數(shù)，計算出對應含量。

1.3 統(tǒng)計分析

采用IBM SPSS 22.0 版軟件進行統(tǒng)計學分析，Graph Pad Prism 8 制圖軟件制圖，計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，符合正態(tài)分布且方差齊用One-Way ANOVA 檢驗，各組間比較采用LSD 檢驗，非正態(tài)分布用非參數(shù)檢驗（Mann-Whitney U 檢驗、Wilcoxon 符號秩和檢驗、Kruskal-Wallis H 檢驗）；計數(shù)資料以頻數(shù)表示，比較采用Chi-square 檢驗，檢驗水準α=0.05，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 C2C12 細胞增殖與分化培養(yǎng)

C2C12 在含10%胎牛血清的DMEM/F12 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，開始時細胞稀疏形態(tài)呈梭形；增殖過程中，細胞密度增大，形態(tài)變長變細，呈纖維狀，4～5 d 后細胞基本增殖完全，未見肌管出現(xiàn)（圖1）。

圖1 增殖培養(yǎng)6、12、24 及96 h 的C2C12 細胞形態(tài)（標尺100 μm）Fig.1 Morphology of C2C12 cells cultured for 6h, 12h, 24h and 96h (bar=100 μm)

C2C12 細胞在含2%馬血清的DMEM/F12 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，4～5 d 后顯微鏡下觀察到細胞變大變長出現(xiàn)融合，融合漸多，形成許多有兩個以上似串珠樣細胞核的肌管，分化培養(yǎng)至第9～10 d 達高峰（圖2），之后細胞逐漸衰老死亡，細胞成片脫落[4]。

圖2 分化培養(yǎng)1、5、8 及10 d 的C2C12 細胞形態(tài)（標尺100 μm）Fig.2 Morphology of C2C12 cells differentiated and cultured for 1d, 5d, 8d and 10d (bar=100 μm)

2.2 LPS 作用C2C12 肌管細胞最佳炎癥模型

運用CCK-8 和IL-6 ELISA 試劑盒分別檢測0.1、1、10 μg/mL 的LPS 刺激C2C12 肌管細胞30 min、3 h、12 h、24 h，0.1 μg/mL 作用30 min 細胞活性無明顯改變（P＞0.05）；1 μg/mL LPS 作用C2C12 肌管細胞24 h炎性細胞因子IL-6 水平最高（圖3）。因此，LPS 刺激C2C12 肌管細胞的最佳時間為24 h，最佳濃度為1 μg/mL。

2.3 藥物干預最佳濃度

CCK-8 實驗結果表明，與模型組比較，濃度低于1.25 mg/mL 的消炎止痛膏組細胞活性無明顯變化（P＞0.05），5 mg/mL 和2.5 mg/mL 消炎止痛膏組細胞活性明顯下降（P=0.005，P=0.002），因此濃度低于1.25 mg/mL 的消炎止痛膏較為安全；IL-6 ELISA 實驗結果表明，安全濃度1.25 mg/mL 消炎止痛膏組的IL-6 濃度最低（P=0.001）（圖4A）。

圖4 不同濃度消炎止痛膏溶液（A）和雙氯芬酸鈉溶液（B）作用C2C12 肌管炎癥模型24 h 細胞活性和IL-6 表達情況Fig.4 Cell activity and IL-6 expression of C2C12 myofibers inflammation model treated with Xiaoyanzhitong Ointment solution and diclofenac sodium solution at different concentrations for 24h.A: 5.0 mg/ml, 2.5 mg/ml, 1.25 mg/ml, 0.625 mg/ml, 0.3125 mg/ml, 0.15625 mg/ml, 0.078125 mg/ml Xiaoyanzhitong Ointment solution solution; B: 200 μg/ml, 100 μg/ml, 50 μg/ml, 25 μg/ml, 12.5 μg/ml, 6.25 μg/ml, 3.125 μg/ml diclofenac sodium solution

CCK-8 實驗結果表明，與模型組比較，3.125～200 μg/mL 雙氯芬酸鈉組細胞活性無明顯變化（P＞0.05）；IL-6 ELISA 實驗結果表明，6.25 μg/mL 雙氯芬酸鈉組的IL-6 濃度最低（P=0.077）（圖4B）。

2.4 消炎止痛膏對C2C12 肌管影響

與模型組比較，1.25 mg/mL 消炎止痛膏顯著抑制LPS 誘 導 的C2C12 肌 管 細 胞 的IL-1β（P=0.006）和MDA 水平（P=0.002），提高SOD 水平（P=0.0001）；與雙氯芬酸鈉組比較，1.25 mg/mL 消炎止痛膏抑制LPS誘導的C2C12 肌管IL-1β 水平無顯著性差異（P=0.188），但提高SOD（P=0.0001）和抑制MDA 水平（P=0.014）的效果有顯著性差異（圖5）。

圖5 不同濃度消炎止痛膏（2.5、1.25、0.625、0.3125、0.15625 mg/mL）和雙氯芬酸鈉（6.25 μg/mL）作用C2C12 肌管炎 癥 模 型24 h 的IL-1β、SOD和MDA 水平A：ELISA 檢 測 各 組 細 胞IL-1β 水平 B：各組細胞SOD 含量 C：各組細胞MDA 含量Fig.5 Different concentrations of anti-inflammatory pain relief ointment (2.5 mg/ml, 1.25 mg/ml, 0.625 mg/ml, 0.3125 mg/ml, 0.15625 mg/ml) and diclofenac sodium (6.25 μg/ml),the levels of IL-1β, SOD and MDA in C2C12 myofibers inflammation model for 24h A: Cell IL-1β level in each group detected by ELISA; B: SOD level in each group; C:MDA levels in each group

3 討論

本團隊從事膏摩療法對急慢性軟組織疼痛的機制研究和臨床研究，前期臨床研究表明以消炎止痛膏為代表的膏摩療法對軟組織損傷患者有良好的治療效果。本實驗在臨床研究和動物實驗基礎上進一步開展體外細胞實驗，通過建立LPS 誘導的C2C12 肌管炎癥模型[5]，觀察不同濃度的消炎止痛膏溶液對LPS誘導的C2C12 肌管致炎過程中的炎癥水平和氧化應激狀態(tài)的影響，探討膏摩療法的膏藥成分對骨骼肌鈍挫傷可能的療效機制。研究表明，合適濃度的消炎止痛膏溶液可降低C2C12 肌管的IL-1β、IL-6 和MDA 水平，提高SOD 水平。

骨骼肌急性鈍挫傷，造成損傷局部腫脹瘀血，肌纖維斷裂，肌細胞溶解崩塌，從而導致局部組織炎癥反應劇烈。研究表明，骨骼肌損傷和修復是非常復雜的過程，包括逐步的壞死和凋亡、炎癥反應、纖維化與肌衛(wèi)星細胞增殖、血管再生[2,6]。本研究發(fā)現(xiàn)，合適濃度的消炎止痛膏溶液可降低C2C12 肌管的IL-1β 和IL-6 水平，從而減輕炎癥反應對C2C12 的損害。

機體內(nèi)氧化劑與抗氧化劑不平衡所產(chǎn)生的氧化應激具有雙刃劍作用[7]，低中水平自由基具有充當分子信號調(diào)節(jié)系列生理過程的作用，如維持血管張力、抵御感染、控制通氣等。同時自由基也是脂質(zhì)、細胞膜和蛋白質(zhì)及DNA 等細胞結構損傷的中介，可產(chǎn)生次級反應物，誘導細胞壞死、凋亡，最終導致發(fā)病。本研究通過對LPS 誘導的C2C12 肌管癥模型SOD 和MDA 含量的檢測發(fā)現(xiàn)，合適濃度的消炎止痛膏溶液可提高C2C12 肌管細胞的SOD 含量，降低MDA 含量，從而減少氧化應激對C2C12 的損害，促進損傷修復。

綜上所述，消炎止痛膏成分可降低LPS 誘導的C2C12 肌管炎癥模型IL-1β、IL-6 和MDA 水平，提高SOD 水平，可能與減輕組織炎癥反應、降低機體氧化應激損害有關。本研究存在一些不足之處，如未開展藥物細胞毒性實驗等。此外，可運用細胞力學刺激模擬細胞層面的膏摩療法等。