魚(yú)類(lèi)低值副產(chǎn)物制備抗菌肽研究進(jìn)展

李海藍(lán)，陳亞楠，2，劉文博，3，趙青，2，廖濤，4，鉏曉艷，4*

（1.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工與核農(nóng)技術(shù)研究所，湖北 武漢 430064；2.湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品學(xué)院，湖北 武漢 430000；3.武漢工程大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，湖北 武漢 430205；4.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品冷鏈物流技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430000）

抗生素是20世紀(jì)最偉大的發(fā)現(xiàn)之一，但由于傳統(tǒng)抗生素的長(zhǎng)期過(guò)量使用，使得耐藥變異菌株泛濫，對(duì)人類(lèi)的健康造成一定的威脅。目前，抗菌肽被認(rèn)為是最具有潛力代替抗生素的天然物質(zhì)[1]，其作為具有廣譜抗微生物活性的小分子多肽，由20～50 個(gè)氨基酸殘基組成，且通常富含陽(yáng)離子，具有兩親性，廣泛分布于動(dòng)物、植物與微生物中，如天蠶[1]、綿羊[2]、林蛙[3]、虹鱒魚(yú)[4]、豇豆[5]、乳酸鏈球菌[6]等，在它們的宿主先天防御功能中起到重要的作用[7]。其中，種類(lèi)繁多的魚(yú)類(lèi)是抗菌肽的重要來(lái)源，同時(shí)，魚(yú)類(lèi)來(lái)源抗菌肽也有一些獨(dú)有的特性，它即使在非常高的鹽濃度下也能發(fā)揮作用，這成為開(kāi)發(fā)治療性抗菌劑的良好潛在靶點(diǎn)[8]。

近年來(lái)，隨著國(guó)內(nèi)外魚(yú)類(lèi)加工技術(shù)的不斷進(jìn)步，魚(yú)類(lèi)加工產(chǎn)業(yè)也處在持續(xù)發(fā)展階段。但對(duì)于一些低值魚(yú)類(lèi)，其雖然具有體型小、營(yíng)養(yǎng)豐富、種類(lèi)繁多及產(chǎn)量大的優(yōu)點(diǎn)，但卻因?yàn)槠浼庸ぎa(chǎn)業(yè)鏈短，經(jīng)濟(jì)效益低而造成了資源浪費(fèi)[9]。同時(shí)，魚(yú)類(lèi)在加工過(guò)程會(huì)產(chǎn)生大量的低值副產(chǎn)物，如魚(yú)頭、魚(yú)骨、魚(yú)皮、魚(yú)鱗、魚(yú)內(nèi)臟等，占原料魚(yú)體質(zhì)量的30%～50%[10]。這些副產(chǎn)物一直沒(méi)有被高效利用，它們大部分被浪費(fèi)丟棄，或者用于生產(chǎn)一些低附加值產(chǎn)品，如飼料魚(yú)粉[11]。然而，近年來(lái)，這些副產(chǎn)物逐漸被用于生產(chǎn)一些蛋白質(zhì)水解物和生物活性肽[9，12-15]，抗菌肽作為其中的一種生物活性肽，因在食品及醫(yī)藥領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景，而受到越來(lái)越多研究者的關(guān)注[7]。

目前，大量研究者開(kāi)始在魚(yú)類(lèi)低值副產(chǎn)物中尋找潛在的抗菌肽，這些抗菌肽可能在其母體蛋白質(zhì)序列中并不活躍，因此需要合適的方法將其釋放出來(lái)[16-19]?？傮w來(lái)說(shuō)，生產(chǎn)抗菌肽的傳統(tǒng)方法包括化學(xué)水解法（酸或堿水解）[20]、酶水解法[21]和微生物發(fā)酵法[22-24]。然而，由于化學(xué)水解法會(huì)引入一些有毒的化學(xué)品，所以酶水解法和微生物發(fā)酵法是生產(chǎn)抗菌肽最廣泛使用的方法[25]。同時(shí)，一些新興的新技術(shù)，如脈沖電場(chǎng)和亞臨界水萃取法，也逐漸被用來(lái)生產(chǎn)一些生物活性肽，以提高生物活性成分的產(chǎn)率[26]。

然而從魚(yú)類(lèi)低值副產(chǎn)物中生產(chǎn)抗菌肽的研究相對(duì)較少，也不夠深入，大多研究?jī)H停留在提取分離階段，只對(duì)微生物的活性進(jìn)行評(píng)價(jià)。因此，本文主要綜述魚(yú)類(lèi)低值副產(chǎn)物中抗菌肽的來(lái)源、制備方法以及對(duì)其抗菌活性的評(píng)價(jià)方法，旨在為魚(yú)類(lèi)低值副產(chǎn)物中抗菌肽的制備生產(chǎn)提供理論參考，并促進(jìn)對(duì)抗菌肽的研究，增加其利用價(jià)值。

1 抗菌肽主要來(lái)源

抗菌肽可能存在于魚(yú)類(lèi)的多個(gè)部位，如器官、黏液、血液或組織中[8]，然而在魚(yú)類(lèi)加工副產(chǎn)物中，抗菌肽的提取原料大多來(lái)源于內(nèi)臟和魚(yú)皮，僅有較少研究從魚(yú)鱗和魚(yú)骨中提取抗菌肽（見(jiàn)表1）。

表1 抗菌肽的來(lái)源和制備方法以及抗菌活性檢測(cè)方法Table 1 Sources and preparation methods of antimicrobial peptides and detection methods of antibacterial activity

1.1 魚(yú)鱗

魚(yú)鱗是對(duì)魚(yú)體具有重要保護(hù)作用的結(jié)構(gòu)，其主要由羥基磷灰石與膠原蛋白組成，其蛋白質(zhì)含量約占總量的50%[43]。由于魚(yú)鱗中存在豐富的膠原蛋白，大多數(shù)研究者使用酸提法或者蛋白酶水解法處理魚(yú)鱗，以從魚(yú)鱗中提取膠原蛋白肽[44]與抗氧化肽[12]，有研究者使用胃蛋白酶水解鯽魚(yú)魚(yú)鱗，并通過(guò)凝膠過(guò)濾層析與陰離子交換層析進(jìn)行分離純化，得到了對(duì)多種致病菌具有良好抗菌活性的抗菌肽[35]。目前，更多的研究是將從魚(yú)鱗中提取的膠原蛋白或羥基磷灰石與某些抗菌活性材料復(fù)合，從而有效提升其抗菌性能[45-46]。Kulkarni 等[47]將麥瑞加拉鯪魚(yú)魚(yú)鱗中提取的膠原蛋白與殼聚糖共混制備出了具有抗菌功效的新型生物降解膜。

1.2 魚(yú)骨

鈣和骨膠原蛋白是魚(yú)骨中的主要組成部分，其蛋白質(zhì)含量約占總量的15%[48]?；曳质囚~(yú)骨中含量最高的成分，其主要成分是鈣，主要以羥基磷灰石結(jié)晶的形式存在，鈣磷比為1.67[49]。有研究表明，從魚(yú)骨和魚(yú)鱗中提取的羥基磷灰石均具有抗菌活性，而魚(yú)骨中的羥基磷灰石抗菌活性更好。目前很少有研究從魚(yú)骨中提取抗菌肽，僅有Ren 等[36]使用胃蛋白酶酶解斑點(diǎn)叉尾鮰（Ictaluruspunctatus）魚(yú)骨，并通過(guò)響應(yīng)面法對(duì)水解條件進(jìn)行優(yōu)化，最后得到了對(duì)大腸桿菌具有較好抗菌活性的抗菌肽，其抑菌圈直徑達(dá)到19.8 mm。

1.3 魚(yú)皮

魚(yú)皮占魚(yú)類(lèi)總質(zhì)量的8%～10%，其總蛋白質(zhì)含量占20%以上，主要為膠原蛋白[50]。和魚(yú)鱗相同，大多數(shù)研究關(guān)注魚(yú)皮中膠原蛋白的提取及生物活性分析。然而，由皮細(xì)胞和表皮杯狀細(xì)胞分泌的表皮黏液也是魚(yú)皮的重要成分，也是先天免疫系統(tǒng)的重要組成部分，其也可能作為豐富抗菌肽的重要來(lái)源[51]。表皮黏液中的抗菌肽的主要提取方法為化學(xué)法和蛋白酶酶解法，經(jīng)凝膠過(guò)濾或離子交換、反相色譜進(jìn)一步純化后，可以得到對(duì)腐敗希瓦氏菌和黃體微球菌等微生物具有抑制作用的抗菌肽[38，41]。

1.4 魚(yú)內(nèi)臟

內(nèi)臟是魚(yú)類(lèi)低值副產(chǎn)物含量最高的，占魚(yú)體總質(zhì)量的12%～18%[52]。內(nèi)臟中含有魚(yú)鰾、魚(yú)腸、精巢組織、魚(yú)子與魚(yú)油等，其是豐富的蛋白質(zhì)來(lái)源，不僅可以用作動(dòng)物飼料，而且可以作為生產(chǎn)脂肪酶與蛋白酶的原料[52]。關(guān)于從魚(yú)類(lèi)內(nèi)臟中提取抗菌肽的研究較多，主要采用蛋白酶酶解與發(fā)酵法提取，Pezeshk 等[29]發(fā)現(xiàn)從黃鰭金槍魚(yú)（Thunnusalbacores）內(nèi)臟水解物中分離得到抗菌肽，可抑制魚(yú)類(lèi)腐敗菌的生長(zhǎng)。Ennaas 等[28]使用不同種類(lèi)的商業(yè)酶水解大西洋鯖魚(yú)（Scomberscombrus）的內(nèi)臟，發(fā)現(xiàn)其粗水解產(chǎn)物對(duì)單增李斯特菌和大腸桿菌具有明顯的抑制作用，同時(shí)，經(jīng)過(guò)純化后的組分可完全抑制上述2 種微生物的生長(zhǎng)。

2 抗菌肽的提取與純化

從魚(yú)類(lèi)低值副產(chǎn)物中提取抗菌肽的傳統(tǒng)方法有化學(xué)水解（酸或堿水解）、酶水解、微生物發(fā)酵，雖然其都能有效促進(jìn)抗菌肽的生產(chǎn)，但其各自都有優(yōu)缺點(diǎn)，總結(jié)見(jiàn)表2。

表2 抗菌肽及生物活性肽的提取方法Table 2 Extraction methods of antimicrobial peptides and bioactive peptides

化學(xué)水解是通過(guò)使用酸或堿來(lái)切割肽鍵以產(chǎn)生多肽與游離氨基酸，雖然其價(jià)格低廉，操作簡(jiǎn)單，但是難以控制的水解過(guò)程，以及易破壞多肽結(jié)構(gòu)與生物活性的缺點(diǎn)限制了其進(jìn)一步的應(yīng)用[20]。

酶水解是利用蛋白酶直接水解魚(yú)類(lèi)低值副產(chǎn)物來(lái)生產(chǎn)生物活性肽，由于其安全性高，水解條件溫和，并且可以有針對(duì)性地以低成本生產(chǎn)特定的肽，成為使用最廣泛的水解方法[19]。Robert 等[30]使用芽孢桿菌蛋白合物在50 ℃下水解羅非魚(yú)（Oreochromisniloticus）副產(chǎn)物（頭部、框架和內(nèi)臟）30 min，發(fā)現(xiàn)其水解產(chǎn)物主要由多肽（46.9%）和寡肽（35.8%）組成，并對(duì)魯氏耶爾森菌具有抗菌活性。由于選用來(lái)自微生物的蛋白酶制劑使得水解過(guò)程具有較高的成本[53]，因此Wald 等[31]通過(guò)使用從虹鱒魚(yú)胃中分離純化得到的胃蛋白酶水解虹鱒魚(yú)的內(nèi)臟，在37 ℃、pH2.0 的條件下進(jìn)行水解，發(fā)現(xiàn)其水解產(chǎn)物對(duì)幾種革蘭氏陽(yáng)性與陰性細(xì)菌皆有抗菌活性，且水解度對(duì)抗菌活性有很大的影響。

微生物發(fā)酵法是指利用產(chǎn)蛋白酶微生物發(fā)酵酶解魚(yú)類(lèi)低值副產(chǎn)物，其安全、環(huán)保、經(jīng)濟(jì)，是生產(chǎn)生物活性肽的另一種有效方法[25，54-55]。Song 等[42]通過(guò)混合微生物（施氏假單胞菌、漠海威芽孢桿菌、黑曲霉等）發(fā)酵棘頭黃魚(yú)（Collichthyslucidus）的副產(chǎn)物（內(nèi)臟、頭、尾和骨骼），并從其發(fā)酵產(chǎn)物中分離純化出具有抗真菌活性的多肽，其可抑制植物病原菌的鼠疫菌屬的生長(zhǎng)。與酶水解相比，微生物發(fā)酵法由于多肽產(chǎn)量低以及多肽形成缺乏特異性，使得在工業(yè)上的開(kāi)發(fā)受到阻礙[56]。

除了上述傳統(tǒng)的方法，目前也有一些新的加工方法替代它們，如脈沖電場(chǎng)[57]與亞臨界水萃取法[26，58]。脈沖電場(chǎng)是一種新型的非熱技術(shù)，采用高強(qiáng)度脈沖電場(chǎng)通過(guò)去折疊、變性或凝膠化促進(jìn)潛在生物活性肽的產(chǎn)生[26]。Franco 等[57]采用脈沖電場(chǎng)從鯛魚(yú)與鱸魚(yú)的副產(chǎn)物（魚(yú)頭、骨骼和鰓）中提取抗氧化劑，發(fā)現(xiàn)脈沖電場(chǎng)輔助水提取提高了提取物的抗氧化能力。亞臨界水萃取被認(rèn)為是一種很有前途的創(chuàng)新技術(shù)，是通過(guò)利用溫度在100～374 ℃之間，壓力低于22 MPa（低于水的臨界點(diǎn)）的亞臨界水水解蛋白質(zhì)，其在較短的時(shí)間內(nèi)以與酶水解相當(dāng)?shù)男仕獾鞍踪|(zhì)[26，59]。Uddin 等[60]利用亞臨界水萃取方法水解魷魚(yú)內(nèi)臟，回收得到了一些有價(jià)值的產(chǎn)物，如氨基酸與還原糖。

經(jīng)不同水解方法提取得到的一般為粗產(chǎn)物，需要進(jìn)一步分離純化。通常，首先通過(guò)膜過(guò)濾對(duì)水解產(chǎn)物進(jìn)行初始分離，之后采用色譜方法進(jìn)一步分離純化，如尺寸排阻色譜法、離子交換色譜法和反相高效液相色譜法[20]。研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)膜超濾分離的黃鰭金槍魚(yú)（Thunnusalb-acores）內(nèi)臟水解液，其最低分子量（＜3 kDa）組分對(duì)單增李斯特菌具有更強(qiáng)的抗菌活性[29]。

3 抗菌活性檢測(cè)方法

經(jīng)提取、分離純化后得到的多肽需進(jìn)一步驗(yàn)證其抗菌活性，其主要評(píng)價(jià)方法有瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)（圓盤(pán)擴(kuò)散分析）[36]、活細(xì)胞計(jì)數(shù)[27]、肉湯微量稀釋[29]、高通量熒光篩選[61]，其各有優(yōu)缺點(diǎn)，總結(jié)見(jiàn)表3。

表3 抗菌活性檢測(cè)方法的優(yōu)缺點(diǎn)Table 3 Advantages and disadvantages of detection methods of antibacterial activity

瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)與肉湯微量稀釋法因具有簡(jiǎn)單方便的優(yōu)點(diǎn)，是抗菌活性研究中常用的方法[62]。Ren 等[36]使用肉湯微量稀釋法研究斑點(diǎn)叉尾鮰魚(yú)骨蛋白酶解產(chǎn)物抗菌活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)鯰魚(yú)骨酶解物對(duì)大腸桿菌的最小抑制濃度為6 mg/mL，并通過(guò)原子力顯微鏡與透射電鏡發(fā)現(xiàn)其可通過(guò)損傷大腸桿菌細(xì)胞膜，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物的外泄，從而抑制并殺死大腸桿菌。由于部分真菌中菌絲體的存在，肉湯微量稀釋法可能不太適用于對(duì)真菌的抗菌活性檢測(cè)，而瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)相比肉湯微量稀釋法更具適用性，且更直觀。Song 等[42]利用瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)檢測(cè)抗菌肽對(duì)鼠疫菌屬抑制活性，發(fā)現(xiàn)在24.62 mg/mL 時(shí)即可形成明顯的抑制圈。與活細(xì)胞計(jì)數(shù)相比，瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)是一種更為直觀的抗菌活性檢測(cè)方法，雖然操作簡(jiǎn)單，但其誤差較大。Cheng 等[27]使用活細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)了鮭魚(yú)精蛋白對(duì)煙熏鮭魚(yú)中單增李斯特氏菌的抑制活性，發(fā)現(xiàn)其在5 mg/g 濃度下即可延緩單增李斯特氏菌在煙熏鮭魚(yú)上的生長(zhǎng)。高通量熒光篩選法是一種快速且具有成本效益的熒光方法，Kodedová 等[61]利用其檢測(cè)抗菌肽對(duì)念珠菌質(zhì)膜的損傷，發(fā)現(xiàn)抗菌肽能夠在15 min 內(nèi)以較低濃度殺死細(xì)胞。

4 抗菌機(jī)制

抗菌肽是魚(yú)類(lèi)為抵御眾多微生物感染的重要防御機(jī)制，雖然其結(jié)構(gòu)具有多樣性，但在本質(zhì)上具有一定的共性[8]，如魚(yú)皮中產(chǎn)生的Cathelicidins，具有典型的整體陽(yáng)離子和兩親性的結(jié)構(gòu)特性[63]；以及可能來(lái)源于魚(yú)類(lèi)各組織中的組蛋白衍生肽，其含有豐富的陽(yáng)離子，同時(shí)具有α-螺旋與無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)[64]；也還有一些未被深入研究的多肽，如從棘頭黃魚(yú)組織中得到的抗菌肽（氨基酸序列TFNTPAMYVAIQAVLSLYASGR），其可以抑制抗真菌的生長(zhǎng)，被推測(cè)具有α-螺旋結(jié)構(gòu)，C 端存在帶正電荷的殘基R，可能有助于通過(guò)靜電相互作用與真菌細(xì)胞膜相互作用[42]。同時(shí)，魚(yú)類(lèi)中富含天冬氨酸和谷氨酸的一些非陽(yáng)離子抗菌肽也相繼被發(fā)現(xiàn)[65]?？傮w來(lái)說(shuō)，抗菌肽的作用機(jī)制主要分為兩種，一種為膜破壞機(jī)制，它們以特定的方式與帶電的細(xì)胞膜結(jié)合，從而穿透膜或形成孔，最終導(dǎo)致微生物因細(xì)胞內(nèi)容物的泄露而死亡，主要存在3 種模型解釋這種作用機(jī)制，即桶柵模型、環(huán)孔模型和地毯模型[66]；另外一種是非膜破壞機(jī)制，它們可以通過(guò)跨膜易位后抑制重要的細(xì)胞過(guò)程，如核酸、蛋白質(zhì)、肽聚糖的生物合成，從而起到殺死微生物細(xì)胞的作用[65]。目前，魚(yú)源抗菌肽的抗菌機(jī)制研究更多的是其對(duì)細(xì)胞膜的作用[67]，如具有疏水或兩親性α-螺旋結(jié)構(gòu)的Piscidins，是通過(guò)典型的環(huán)孔模型與細(xì)胞膜作用而發(fā)揮抑菌作用[68]?？傊?，與抗生素相比，抗菌肽能夠極大程度地降低細(xì)菌耐藥性的概率，同時(shí)，由于魚(yú)類(lèi)比哺乳動(dòng)物更依賴(lài)其先天免疫防御，因此其也更有可能是對(duì)抗哺乳動(dòng)物病毒感染的抗病毒化合物的潛在豐富來(lái)源[51]。

5 展望

魚(yú)類(lèi)低值副產(chǎn)物的高值化利用一直是近年來(lái)關(guān)注的熱點(diǎn)，其富含各類(lèi)蛋白質(zhì)，是生產(chǎn)功能性生物活性肽的優(yōu)質(zhì)來(lái)源。然而，利用魚(yú)類(lèi)低值副產(chǎn)物生產(chǎn)抗菌肽的研究不夠廣泛與深入，需要克服以下困難與挑戰(zhàn)。

第一，雖然魚(yú)類(lèi)低值副產(chǎn)物占比較高，但生產(chǎn)抗菌肽的來(lái)源較少，主要來(lái)源為魚(yú)類(lèi)內(nèi)臟與魚(yú)皮，而魚(yú)鱗、魚(yú)骨相對(duì)較少，其中的一個(gè)重要的原因是大多研究者關(guān)注從魚(yú)鱗、魚(yú)骨中提取膠原蛋白與抗氧化肽，而忽略了抗菌肽的存在。因此，需要更多的研究者對(duì)其進(jìn)行深入的研究。

第二，利用魚(yú)類(lèi)低值副產(chǎn)物制備抗菌肽的方法多種多樣，雖然一些方法已被廣泛研究與應(yīng)用，但在工業(yè)生產(chǎn)上耗時(shí)且昂貴，且其生物活性可能會(huì)受到很多因素的影響，因此需要結(jié)合現(xiàn)代加工工藝開(kāi)發(fā)一種操作簡(jiǎn)便、成本可控的規(guī)模化生產(chǎn)技術(shù)。

第三，從魚(yú)類(lèi)低值副產(chǎn)物中提取的抗菌肽雖然能被證明其具有對(duì)某種微生物的抗菌活性，但關(guān)于抗菌肽的結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系研究較少，同時(shí)，對(duì)其毒性研究也較少，因此需要更關(guān)注抗菌肽的抑菌機(jī)制并評(píng)估其在臨床實(shí)驗(yàn)中的功效影響。