脫脂榛子粉標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備及其過(guò)敏原檢測(cè)方法驗(yàn)證

孫秀艷，洪麟，楊莉莉，石雨婷，徐大軍，陳穎，曹際娟*

（1.大連民族大學(xué)，遼寧 大連 116600；2.大連市檢驗(yàn)檢測(cè)認(rèn)證技術(shù)服務(wù)中心，遼寧 大連 116021；3.中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)，北京 100048；4.中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，北京 102206）

榛子（Corylusavellana）屬于樺木科植物，榛子仁是一種十分常見(jiàn)的食物過(guò)敏原[1-2]。榛子仁中蛋白質(zhì)含量達(dá)到7%～13%，其中多種蛋白質(zhì)是已知的過(guò)敏原[3-4]，例如Cor a 9 和Cor a 11。這些蛋白大多具有高耐熱性，在不同的生產(chǎn)工藝中比較穩(wěn)定[5-6]。對(duì)于榛子過(guò)敏人群，攝入食物中隱藏的榛子過(guò)敏原會(huì)引發(fā)嚴(yán)重后果[7]。極少量的榛子即可引發(fā)過(guò)敏反應(yīng)，嚴(yán)重的會(huì)導(dǎo)致過(guò)敏性休克[8-9]。因此，榛子過(guò)敏者必須避免食用榛子或含有榛子的食物。然而，僅僅通過(guò)查看食品標(biāo)簽并不能完全規(guī)避含有榛子的食品，例如在生產(chǎn)過(guò)程中常發(fā)生的交叉污染情況。因此，在許多情況下均不能排除食物中榛子殘留物的存在[10]。

食物過(guò)敏已成為重要的食品安全問(wèn)題，評(píng)價(jià)和檢測(cè)食品過(guò)敏原逐漸受到重視[11]。目前，在國(guó)內(nèi)外還沒(méi)有研制榛子過(guò)敏原檢測(cè)相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)樣品?，F(xiàn)階段，最常用的過(guò)敏原檢測(cè)方法主要有基于過(guò)敏蛋白檢測(cè)的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）法及基于過(guò)敏原物種源性成分基因檢測(cè)的實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantitative real-timepolymerase chain reaction，qPCR）法[12-13]。上述兩種方法采用的原理不同，無(wú)法直接進(jìn)行測(cè)定值、靈敏度的比較，也鮮見(jiàn)二者檢測(cè)結(jié)果相關(guān)性的研究，導(dǎo)致在檢測(cè)方法選擇方面缺乏有價(jià)值的參考。食品監(jiān)管部門(mén)、食品檢測(cè)機(jī)構(gòu)、食品生產(chǎn)企業(yè)等在食品過(guò)敏原安全控制工作中，始終存在著對(duì)方法選擇的困惑[14]。

標(biāo)準(zhǔn)樣品是一種重要的參考物質(zhì)，經(jīng)常用于儀器校準(zhǔn)和測(cè)量結(jié)果的量值溯源、測(cè)量方法評(píng)價(jià)、給其他材料賦值以及實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量控制和能力驗(yàn)證等技術(shù)活動(dòng)[15-16]，其定義是一種或多種已確定特性值、足夠均勻且穩(wěn)定的材料，已被確定其符合測(cè)量過(guò)程的預(yù)期用途[17]。標(biāo)準(zhǔn)樣品的特性可以是定量或定性的，均勻性、穩(wěn)定性、準(zhǔn)確性、溯源性是標(biāo)準(zhǔn)樣品的基本屬性[18]，在基于不同原理的檢測(cè)方法性能指標(biāo)驗(yàn)證方面，標(biāo)準(zhǔn)樣品發(fā)揮著不可替代的作用。然而，目前缺乏用于食品過(guò)敏原檢測(cè)的堅(jiān)果類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)樣品。

本研究以榛子仁作為原料，經(jīng)粉碎、正己烷脫脂處理、過(guò)篩獲得細(xì)粉，并進(jìn)行脫脂工藝處理前后的比較，在開(kāi)展均勻性、穩(wěn)定性及定值評(píng)估基礎(chǔ)上，制備了大批量的脫脂榛子粉標(biāo)準(zhǔn)樣品，并用于食品過(guò)敏原檢測(cè)的qPCR 和ELISA 方法檢出限的驗(yàn)證及比較，為基于不同原理的分析方法檢出限的驗(yàn)證提供有價(jià)值的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

榛子（顆粒均勻、無(wú)雜質(zhì)，果粒經(jīng)逐個(gè)挑選并感官鑒定均為榛子）：市售。

寶生物病毒核酸提取試劑盒Ver.5.0、探針?lè)╭PCR 試劑：大連TaKaRa 公司；榛子（0～40 mg/kg）ELISA試劑盒：青島普瑞邦公司；正己烷：西隴科學(xué)股份有限公司。試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

ABI QuantStudio 7 定量PCR 儀：美國(guó)賽默飛世爾科技公司；ZHJH-C112B 超凈工作臺(tái)：上海智城分析儀器制造有限公司；Synergy H1 酶標(biāo)儀：美國(guó)伯騰儀器有限公司；34BL99 高速組織搗碎機(jī)、7011S 商用攪拌機(jī)：美國(guó)皇庭公司；BWS-10 恒溫水浴鍋、BPZ-6063LCB 真空干燥箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；SYH-15 三維運(yùn)動(dòng)混合機(jī)：常州市恒邁干燥設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 脫脂榛子粉標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備

榛子去殼清洗干凈，擦干榛子仁表面的水分，使用干凈的搗碎機(jī)打磨成粉。稱(chēng)取約1 kg 榛子粉，以每批50 g 為單位，分批進(jìn)行脫脂處理[19]，使用三維運(yùn)動(dòng)混合機(jī)充分混勻。具體脫脂操作流程：取50 g 榛子粉置于錐形瓶中，按照1∶6（g/mL）的料液比加入正己烷，充分混合，封口后將錐形瓶放置在45 ℃的水浴鍋中浸提20 min[20]。用一次性塑料滴管吸除上方的混合油，反復(fù)浸提3 次。將脫脂后的榛子粉放置在真空干燥箱中脫除溶劑，過(guò)50 目篩，得到干燥、松散狀的脫脂榛子粉。制備好的脫脂榛子粉樣品分裝在西林瓶中，每瓶2 g，加硅膠蓋、鋁箔蓋密封，分裝約500 瓶，于0～4 ℃條件保存。以未經(jīng)脫脂處理的榛子粉樣品為對(duì)照，用于比較正己烷脫脂處理對(duì)榛子特性值的影響。

1.3.2 定性測(cè)定

采用SN/T 1961.8—2013《出口食品過(guò)敏原成分檢測(cè)第8 部分：實(shí)時(shí)熒光PCR 方法檢測(cè)榛果成分》[21]中的方法測(cè)定原料的榛子源性成分，采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）方法檢測(cè)榛子蛋白，其中榛子蛋白的檢測(cè)按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3.3 均勻性檢驗(yàn)

均勻性是指標(biāo)準(zhǔn)樣品特性值在空間分布的均勻程度，是標(biāo)準(zhǔn)樣品的重要指標(biāo)之一[22]。均勻性檢驗(yàn)按照GB/T 15000.3—2008《標(biāo)準(zhǔn)樣品工作導(dǎo)則（3）標(biāo)準(zhǔn)樣品定值的一般原則和統(tǒng)計(jì)方法》[23]中的方法進(jìn)行，從所制備的500 瓶獨(dú)立包裝的標(biāo)準(zhǔn)樣品中隨機(jī)抽取15 瓶用于均勻性檢驗(yàn)（m=15，n=2）。采用qPCR 測(cè)定榛子Oleosin基因的閾值循環(huán)數(shù)（threshold cycle，Ct）值，采用ELISA 法測(cè)定榛子過(guò)敏蛋白含量值，均用于評(píng)估均勻性。

1.3.4 穩(wěn)定性檢驗(yàn)

1.3.4.1 長(zhǎng)期穩(wěn)定性檢驗(yàn)

在適宜的環(huán)境條件下，標(biāo)準(zhǔn)樣品特性值不會(huì)隨著貯存時(shí)間的延長(zhǎng)發(fā)生顯著變化[24]。為確定標(biāo)準(zhǔn)樣品的有效期，需要考察標(biāo)準(zhǔn)樣品的長(zhǎng)期穩(wěn)定性[25]。長(zhǎng)期穩(wěn)定性檢驗(yàn)按照GB/T 15000.3—2008《標(biāo)準(zhǔn)樣品工作導(dǎo)則（3）標(biāo)準(zhǔn)樣品定值的一般原則和統(tǒng)計(jì)方法》[23]中的方法，從長(zhǎng)時(shí)間保存于-20 ℃低溫條件的標(biāo)準(zhǔn)樣品中隨機(jī)抽取樣品，按照第一年每2 個(gè)月、第二年每3 個(gè)月的時(shí)間間隔點(diǎn)，在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)、每次隨機(jī)抽取2 瓶樣品（m=2，n=2）用于長(zhǎng)期穩(wěn)定性的評(píng)估。采用qPCR 法測(cè)定榛子Oleosin基因Ct 值，采用ELISA 法測(cè)定榛子蛋白含量值，均用于檢驗(yàn)長(zhǎng)期穩(wěn)定性。采用直線(xiàn)經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ头治鲈u(píng)價(jià)，當(dāng)測(cè)定值的|b1|＜t(0.95，n-2)×s（b1），表明穩(wěn)定性良好。式中：|b1|為均值斜率的絕對(duì)值；t(0.95，n-2)為t檢驗(yàn)雙邊臨界值；s（b1）為與斜率相關(guān)的不確定度。

1.3.4.2 短期穩(wěn)定性檢驗(yàn)

采用同步設(shè)計(jì)方法在-20～50 ℃條件下進(jìn)行運(yùn)輸條件下短期穩(wěn)定性檢驗(yàn)（選擇-20 ℃7 d、0～4 ℃7 d 和14 d、25 ℃7 d、50 ℃7 d），每個(gè)溫度條件下測(cè)試3 瓶標(biāo)準(zhǔn)樣品（m=3），每瓶重復(fù)測(cè)試2 次（n=2），采用線(xiàn)性回歸方差分析評(píng)價(jià)短期穩(wěn)定性。

1.3.5 定值測(cè)定

按照ISO Guide 35：2017 的典型標(biāo)準(zhǔn)樣品定值模式[26]，鑒于本標(biāo)準(zhǔn)樣品是由精選純榛子仁制備，且制備過(guò)程中已采取措施，為防止特性值成分的變化和其他成分的帶入，因此本研究選擇單一實(shí)驗(yàn)室采用不同原理、獨(dú)立程序的3 種定值方法：基于基因測(cè)序鑒定榛子基因序列[27]、qPCR 方法鑒定榛子特異性O(shè)leosin基因[28]、ELISA 方法測(cè)定榛子蛋白[29]。采用簡(jiǎn)單隨機(jī)抽樣法，從本批標(biāo)準(zhǔn)樣品中抽取9 個(gè)單元，每種方法測(cè)定3 個(gè)單元的標(biāo)準(zhǔn)樣品（m=3），每個(gè)單元進(jìn)行2 次重復(fù)檢測(cè)（n=2）。以基因測(cè)序鑒定榛子基因序列為標(biāo)準(zhǔn)值，其他2 種方法進(jìn)行特性值核對(duì)。

1.3.6 qPCR 和ELISA 方法檢出限的驗(yàn)證

方法的檢出限（limit of detection，LOD6）是通過(guò)試驗(yàn)確定的[30-31]。取脫脂榛子粉標(biāo)準(zhǔn)樣品，按照不同的質(zhì)量比添加到小麥粉中制成5 個(gè)系列的不同質(zhì)量含量（5.0%、3.0%、1.0%、0.5%、0.1%）樣品。具體制備流程（以5.0%脫脂榛子粉樣品制備為例）：稱(chēng)取20 g 脫脂榛子粉標(biāo)準(zhǔn)樣品，加入至380 g 小麥粉中，放置于三維運(yùn)動(dòng)混合機(jī)中充分混勻，時(shí)間不短于20 h；然后將混合粉再經(jīng)過(guò)50 目篩篩分，反復(fù)10 次過(guò)篩，使混合粉全部通過(guò)50 目篩，確保樣品均勻；分裝在西林瓶中，每瓶2 g，每個(gè)質(zhì)量含量樣品分裝約200 瓶。其中，以0.1%榛子粉樣品的待測(cè)液（如DNA 提取液或榛子蛋白待測(cè)液）進(jìn)一步進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)?.01%、0.001%、0.000 1%、0.000 01%、0.000 001%、0.000 000 1%）。隨機(jī)抽取上述所制備的0.000 000 1%～5.0%不同質(zhì)量含量系列榛子粉樣品，用于驗(yàn)證和比較qPCR 和ELISA 方法的LOD6。每個(gè)含量點(diǎn)進(jìn)行6 個(gè)重復(fù)分析（m=6），每個(gè)重復(fù)分析進(jìn)行2 次運(yùn)行（n=2）。最低濃度水平的所有12 個(gè)重復(fù)結(jié)果均顯示陽(yáng)性，可被視為L(zhǎng)OD6。以線(xiàn)性曲線(xiàn)的相關(guān)系數(shù)R2來(lái)衡量反應(yīng)線(xiàn)性度，R2應(yīng)不低于0.98[32]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

樣品的均勻性采用單因素方差分析（F檢驗(yàn)）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，通過(guò)單因素方差分析（Tukey's 檢驗(yàn)）統(tǒng)計(jì)p值，使用OriginPro 2022 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析計(jì)算，使用Medcalc Portable Launcher 進(jìn)行概率回歸分析，通過(guò)graphpad prism 8.4.0 軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 正己烷脫脂處理對(duì)榛子特性值的影響

榛子源性成分（如Oleosin基因、2S 球蛋白基因等）和榛子蛋白是用于食品過(guò)敏原檢測(cè)的脫脂榛子粉標(biāo)準(zhǔn)樣品的特性指標(biāo)。脫脂處理前后的榛子粉中Oleosin基因Ct 值和榛子蛋白的比較如圖1所示。

圖1 脫脂處理前后的榛子粉中Oleosin 基因Ct 值和榛子蛋白含量Fig.1 Ct values of Oleosin gene and hazelnut protein content in hazelnut powder before and after degreasing

由圖1A 可知，脫脂處理前，榛子粉樣品Oleosin基因Ct 值為26.22±0.47，脫脂處理后的Ct 值為25.80±0.31，經(jīng)Tukey's 檢驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)量p=0.009。由圖1B 可知，脫脂處理前，榛子蛋白含量為（5.09±0.01）×105mg/kg，脫脂處理后則為（5.34±0.01）×105mg/kg，統(tǒng)計(jì)量p＜0.000 01。結(jié)果表明，脫脂處理沒(méi)有對(duì)榛子源性成分的特性基因及榛子蛋白造成損失和破壞，樣品單位質(zhì)量?jī)?nèi)的特性含量有所增加且差異極其顯著（p＜0.01）。

2.2 均勻性評(píng)估

采用單因素方差分析法評(píng)估均勻性，結(jié)果如表1。

表1 脫脂榛子粉標(biāo)準(zhǔn)樣品均勻性的方差分析Table 1 Analysis of variance for homogeneity of standard samples of nonfat hazelnut powder

由表1 可知，在剔除個(gè)別離群值后，qPCR 法測(cè)定Oleosin基因Ct 值的總平均值為25.14±0.83，ELISA 法測(cè)定榛子蛋白含量總平均值為（5.32±0.03）×105mg/kg。經(jīng)F檢驗(yàn)，在95%置信概率下，兩種方法測(cè)定值計(jì)算得到的F比分別為2.17 和2.10，均小于F臨界值[F0.05(14，15)=2.42]，表明標(biāo)準(zhǔn)樣品的特性值在瓶間和瓶?jī)?nèi)不存在明顯差異，均勻性良好。

圖2、圖3 分別為基于qPCR、ELISA 測(cè)定的脫脂榛子粉標(biāo)準(zhǔn)樣品均勻性差異分析結(jié)果。

圖2 基于qPCR 測(cè)定的脫脂榛子粉標(biāo)準(zhǔn)樣品均勻性差異分析Fig.2 Uniformity difference analysis of reference material of nonfat hazelnut powder determined by qPCR

由圖2、圖3 可知，統(tǒng)計(jì)量p值分別為0.07 和0.08（p＞0.05），表明樣品群組間標(biāo)準(zhǔn)樣品的特性值無(wú)顯著差異。

2.3 穩(wěn)定性評(píng)價(jià)

2.3.1 長(zhǎng)期穩(wěn)定性

在95%置信概率下，經(jīng)直線(xiàn)經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒y(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)，長(zhǎng)期穩(wěn)定性檢驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2、圖4、圖5。

表2 脫脂榛子粉標(biāo)準(zhǔn)樣品長(zhǎng)期穩(wěn)定性的直線(xiàn)模型分析Table 2 The linear model analysis of long-term stability of reference material of defatted hazelnut powder

圖4 基于qPCR 測(cè)定的長(zhǎng)期穩(wěn)定性的直線(xiàn)模型分析比較Fig.4 Analysis and comparison of long-term stability by linear model based on qPCR determination

圖5 基于ELISA 測(cè)定的長(zhǎng)期穩(wěn)定性的直線(xiàn)模型分析比較Fig.5 Analysis and comparison of long-term stability by linear model based on ELISA assays

由表2、圖4、圖5 可知，在剔除個(gè)別離群值后，脫脂榛子粉標(biāo)準(zhǔn)樣品中Oleosin基因的Ct 值總平均值為25.75±0.39，榛子蛋白含量總平均值為（5.31±0.05）×105mg/kg，兩者測(cè)定值的|b1|分別為0.011 67 和0.000 24，均小于t(0.95，n-2)×s（b1），表明該標(biāo)準(zhǔn)樣品在24個(gè)月內(nèi)穩(wěn)定性良好，標(biāo)準(zhǔn)樣品的特性值沒(méi)有發(fā)生明顯的趨勢(shì)性變化。群組間樣品中Oleosin基因Ct 值和榛子蛋白含量值的統(tǒng)計(jì)量p值分別為0.08 和0.054（p＞0.05），表明在24 個(gè)月的貯存期內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)樣品的特性值穩(wěn)定，且無(wú)顯著差異。

2.3.2 短期穩(wěn)定性

短期穩(wěn)定性分析結(jié)果如表3、圖6、圖7所示。

表3 短期穩(wěn)定性線(xiàn)性回歸方差分析Table 3 The regression analysis of variance of short-term stability

圖7 基于ELISA 測(cè)定的運(yùn)輸條件下短期穩(wěn)定性的單因素方差分析評(píng)價(jià)Fig.7 One-way ANOVA evaluation of short-term stability under transport conditions based on ELISA assays

由表3、圖6、圖7 可知，歷經(jīng)模擬運(yùn)輸條件后，標(biāo)準(zhǔn)樣品中Oleosin基因Ct 值總平均值為25.65±0.25，榛子蛋白含量總平均值為（5.29±0.04）×105mg/kg。群組間統(tǒng)計(jì)量p值分別為0.14 和0.27（p＞0.05），表明在歷經(jīng)模擬運(yùn)輸條件下，標(biāo)準(zhǔn)樣品的特性值沒(méi)有發(fā)生顯著性變化，短期穩(wěn)定性良好。

2.4 定值分析

經(jīng)基因測(cè)序測(cè)定獲得的Oleosin基因序列如表4所示。

表4 基于3 種獨(dú)立程序的脫脂榛子粉標(biāo)準(zhǔn)樣品定值結(jié)果Table 4 Values of reference material of nonfat hazelnut powder based on three independent procedures

由表4 可知，Oleosin基因序列與Genbank 中登錄號(hào)為AY224599.1 的榛子Oleosin基因序列同源性為100%，可鑒定為榛子物種；采用實(shí)時(shí)熒光PCR 法檢測(cè)Oleosin基因的Ct 值為25.80±0.25，判定為榛子源性成分；ELISA 法測(cè)定的蛋白含量為（5.30±0.04）×105mg/kg，判定為含有榛子蛋白。上述2 種方法的測(cè)定值（m=3，n=2），經(jīng)Shapiro-Wilk 檢驗(yàn)符合正態(tài)分布，經(jīng)Grubb's法檢驗(yàn)結(jié)果無(wú)異常值。由于本標(biāo)準(zhǔn)樣品是由精選純榛子仁制備，且制備過(guò)程中已采取措施，為防止特性值成分的變化和其他成分的帶入，結(jié)合3 種方法的定值結(jié)果，可以表明本標(biāo)準(zhǔn)樣品為具有榛子源性成分和榛子蛋白特性的純榛子物質(zhì)。

2.5 qPCR 和ELISA 檢出限的驗(yàn)證

圖8 為基于qPCR 和ELISA 分析的線(xiàn)性標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

圖8 基于qPCR 和ELISA 分析的線(xiàn)性標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig.8 Linear standard curve based on qPCR and ELISA analysis

由圖8A 可知，基于qPCR 法測(cè)定，對(duì)于0.1%含量以上的樣品可以呈現(xiàn)很好的線(xiàn)性標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，線(xiàn)性擬合度R2=0.985 4（R2≥0.98），LOD6為0.1%。由圖8B 可知，基于ELISA 法，對(duì)于0.01%含量以上的樣品可以呈現(xiàn)很好的線(xiàn)性標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，線(xiàn)性擬合度R2=0.994 5（R2≥0.98），LOD6為0.000 1%。

不同榛子質(zhì)量含量的qPCR 和ELISA 方法檢出限結(jié)果見(jiàn)圖9。

圖9 不同榛子質(zhì)量含量的qPCR 和ELISA 分析檢出限Fig.9 Detection limits of hazelnut by qPCR and ELISA analysis

由圖9 可知，ELISA 方法與qPCR 法相比，具有更好的檢測(cè)靈敏度，當(dāng)在食品中含有0.000 1%的少量榛子殘留物時(shí)，采用ELISA 方法可以被靈敏檢出。

3 結(jié)論

本研究制備了用于食品過(guò)敏原檢測(cè)的脫脂榛子粉標(biāo)準(zhǔn)樣品，具有很好的均勻性和穩(wěn)定性。使用該標(biāo)準(zhǔn)樣品用于方法檢出限的驗(yàn)證和比較，發(fā)現(xiàn)ELISA 法的檢測(cè)靈敏度遠(yuǎn)高于qPCR 法，更適合于對(duì)微量榛子殘留物的檢測(cè)。

本研究首次比較了正己烷脫脂處理對(duì)榛子特性值的影響，未經(jīng)脫脂處理的榛子粉樣品Oleosin基因Ct 值為26.22±0.47，脫脂處理后的Ct 值為25.80±0.31，二者無(wú)明顯差異，說(shuō)明正己烷脫脂處理對(duì)榛子源性成分及榛子蛋白沒(méi)有造成破壞，建立了穩(wěn)定的脫脂榛子粉標(biāo)準(zhǔn)樣品制備工藝。脫脂后的榛子粉呈現(xiàn)松散細(xì)粉狀，更易于添加至其他食品基質(zhì)中用作質(zhì)控品。此外，經(jīng)F檢驗(yàn)，在95%置信概率下，2 種方法測(cè)定值計(jì)算得到的F比分別為2.17 和2.10，均小于F臨界值[F0.05(14，15)=2.42]，表現(xiàn)出良好的均勻性；在長(zhǎng)期穩(wěn)定性檢測(cè)中，2種方法測(cè)定值的|b1|分別為0.011 67 和0.000 24，均小于t(0.95，n-2)×s（b1），統(tǒng)計(jì)量p值分別為0.08 和0.054（p＞0.05）；短期穩(wěn)定性檢測(cè)中，群組間統(tǒng)計(jì)量p值分別為0.14 和0.27（p＞0.05），表明在長(zhǎng)期與短期貯存中，樣品具有良好的穩(wěn)定性；基于3種不同原理的方法定值表明本標(biāo)準(zhǔn)樣品為具有榛子源性成分和榛子蛋白特性的純榛子物質(zhì)，達(dá)到國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)樣品的技術(shù)要求，符合測(cè)量過(guò)程的預(yù)期用途，滿(mǎn)足標(biāo)準(zhǔn)樣品的基本屬性，可用于申報(bào)國(guó)家有證標(biāo)準(zhǔn)樣品。經(jīng)對(duì)qPCR 和ELISA 方法檢出限的驗(yàn)證，可進(jìn)一步用于多種方法開(kāi)展對(duì)食品過(guò)敏原檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制技術(shù)活動(dòng)。該標(biāo)準(zhǔn)樣品為其他油脂含量高的食品基體標(biāo)準(zhǔn)樣品的研制提供了極有價(jià)值的參考，對(duì)于進(jìn)一步闡釋榛子過(guò)敏機(jī)理，預(yù)防榛子過(guò)敏及保護(hù)消費(fèi)者安全具有重要意義。