鷹嘴豆芽素A分子印跡聚合物制備及其在降香葉中的應(yīng)用

高良，唐芳瑞，李婷婷，金晨，范勝賢，王櫻宜，邵峰

（江西中醫(yī)藥大學(xué)現(xiàn)代中藥制劑教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330004）

分子印跡技術(shù)是模擬生物界中抗原與抗體之間的相互作用，為獲得在空間和結(jié)合位點(diǎn)與模板分子完全匹配聚合物的一種仿生識別技術(shù)，被人們形象地描述為制造識別“分子鑰匙”的“人工鎖”技術(shù)[1-2]。與天然產(chǎn)物的傳統(tǒng)提取分離方法相比，分子印跡技術(shù)具有對目標(biāo)成分選擇性強(qiáng)、聚合物易于制備、分離試驗(yàn)操作簡單、有機(jī)溶劑用量少及聚合物可回收再利用等優(yōu)勢[3]。目前，該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于黃酮類、生物堿類、萜類及有機(jī)酸類等化學(xué)成分分離，其中，以木犀草素[4]、葛根素[5]、染料木素[6]及蘆丁[7]等為代表的黃酮類成分分子印跡聚合物研究居多[8]。分子印跡聚合物能夠?qū)S酮類成分特異性識別的主要原因在于功能單體中的酰胺基團(tuán)、吡啶環(huán)及咪唑環(huán)等特定結(jié)構(gòu)與黃酮類成分結(jié)構(gòu)中的酚羥基之間形成氫鍵，同時(shí)，功能單體中芳香環(huán)還可與黃酮類成分的π—π 作用力或者范德華力相互作用[9]。

作為一種黃酮類成分，鷹嘴豆芽素A（biochanin A，BCA）富含于鷹嘴豆芽、花生仁、紅花苜蓿葉及降香葉等植物部位之中，具有抗癌、抗炎、抗氧化、神經(jīng)保護(hù)、抗糖尿病及肝臟保護(hù)等多種生物活性[10]。2021年11月，作為海南地方特色食品，降香葉（又稱海南黃花梨葉）被納入《海南省食品地方安全標(biāo)準(zhǔn)》。為此，本文采用沉淀聚合法，以BCA 為模板分子，1-乙烯基咪唑（1-vinylimidazole，1-viny）為功能單體，二甲基丙烯酸乙二醇酯（ethylene glycol dimethacrylate，EDMA）為交聯(lián)劑，乙腈為致孔劑，偶氮二異丁腈（azobisisobutyronitrile，AIBN）為引發(fā)劑，制備鷹嘴豆芽素A分子印跡聚合物（biochanin A-molecularly imprinted polymers，BCAMIPs），并對其進(jìn)行吸附性能研究，進(jìn)而將其作為固相萃?。╯olid-phase extraction，SPE）填料，用于分離降香葉中的BCA，以期為深度開發(fā)降香葉食療產(chǎn)品提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

BCA（98%）：陜西慈緣生物技術(shù)有限公司；染料木素（99.91%）、櫻黃素（99.01%）：成都曼斯特生物科技有限公司；1-viny（99%）、EDMA（98%）、AIBN（98%）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙腈、甲醇、乙酸、溴化鉀（均為分析純）：西隴科學(xué)股份有限公司；乙腈（色譜純）：德國默克公司；雙蒸水為江西中醫(yī)藥大學(xué)現(xiàn)代中藥制劑教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自制。

降香葉于2021年12月購自海南省三亞市尖峰嶺，經(jīng)中國林業(yè)科學(xué)院熱帶植物研究所副研究員洪舟鑒定為豆科（fabaceae）黃檀屬（DalbergiaL.f.）植物降香檀（DalbergiaodoriferaT.Chen）的葉。憑證標(biāo)本（202001230）保存于江西中醫(yī)藥大學(xué)現(xiàn)代中藥制劑教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室標(biāo)本室。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1750 型紫外可見分光光度計(jì)：日本島津公司；Nicolet5700 型傅里葉變換紅外光譜儀：美國熱電尼高力公司；EXSTAR6000 TG/DTA6300 型熱重/差熱綜合熱分析儀：日本精工電子有限公司；Regulur 8100 型冷場發(fā)射掃描電鏡：日本JEOL 公司；Agilent 1260 型高效液相色譜儀：美國安捷倫科技有限公司；HWS24 型恒溫水浴鍋、DZF-6030A 型真空干燥箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；GL-116G-Ⅱ型高速離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 紫外吸收光譜掃描

精密稱取BCA 28.4 mg，加入乙腈，定容于100 mL容量瓶中，振蕩30min 至混合均勻，配制濃度為1 mmol/L BCA 母液。再以BCA 與1-viny 的摩爾比為1∶1、1∶2、1∶3 配制相應(yīng)的BCA 與1-viny 復(fù)合物溶液，超聲后放置4 h，以乙腈為參比溶劑，分別采集BCA、1-viny及復(fù)合物溶液在190～400 nm 波長范圍內(nèi)紫外吸收光譜。計(jì)算復(fù)合物溶液與BCA 吸光度之間的差值（△A），計(jì)算公式如下。

△A=ABCA+A1-viny-ABCA+1-viny

式中：ABCA、A1-viny及ABCA+1-viny分別為BCA、1-viny及兩者形成復(fù)合物樣品的吸光度。

1.3.2 傅里葉紅外光譜掃描

參考文獻(xiàn)[11]的方法，采用KBr 壓片法，將BCA、BCA-MIPs 及非分子印跡聚合物（non-imprinted polymers，NIPs）經(jīng)KBr 壓片制樣后，在中紅外區(qū)4 000～400 cm-1范圍內(nèi)對上述樣品進(jìn)行傅里葉紅外光譜掃描，觀察各樣品在紅外光譜（infrared spectroscopy，IR）圖譜中的最大吸收波長及其強(qiáng)度，確定其吸收峰。比較各樣品間紅外光譜圖變化差異，分析聚合物的結(jié)構(gòu)。

1.3.3 BCA-MIPs 制備條件優(yōu)化

1.3.3.1 高效液相色譜條件

Alltima C18 柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相：乙腈-0.03%磷酸水溶液（40∶60，體積比），檢測波長：260 nm，柱溫：30 ℃，流速：1.0 mL/min，進(jìn)樣量：10 μL。

精密稱取對照品適量，加乙腈定容于100 mL 的容量瓶中，搖勻，配制成濃度為200、300、400、500、600 μg/mL 的對照品母液，經(jīng)0.22 μm 的微孔濾膜過濾，得到對照品溶液。分別精密吸取對照品溶液10 μL，按上述色譜條件測定峰面積。以BCA 質(zhì)量濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)（X），色譜峰面積為縱坐標(biāo)（Y），得到線性回歸方程，即Y=30.079X-20.91（R2=0.999 9），結(jié)果表明：BCA 在200～600 μg/mL 范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。經(jīng)方法學(xué)考察，結(jié)果表明：精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性符合分析要求，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）依次為1.55%、2.65%、0.11%，加樣回收率為101.14%（RSD=1.99%，n=6）。

1.3.3.2 單因素試驗(yàn)

單因素試驗(yàn)水平見表1。

表1 單因素試驗(yàn)水平Table 1 Levels of single factor experiments

按照表1 優(yōu)化BCA-MIPs 制備工藝，即采用沉淀聚合法，將1 mmol BCA 和2 mmol 1-viny 溶解于一定體積的乙腈中，超聲2 h 預(yù)聚合。放入2 ℃冰箱中靜置12 h。加入一定量的EDMA 與AIBN，超聲10 min，通入氮?dú)?0 min 后，密封，放置于60 ℃水浴鍋中聚合24 h，得到聚合物，待反應(yīng)完成后，加入甲醇-乙酸溶液（9∶1，體積比）索氏提取24 h，直至上清液不含模板分子，然后用甲醇洗至中性，得到BCA-MIPs，最后在60 ℃下真空干燥24 h。非分子印跡聚合物（NIPs）除不加入模板分子外，其余步驟同上。

分別精密稱取50 mg BCA-MIPs 和NIPs，加入底物濃度分別為200、300、400、500、600 μg/mL 的BCA 乙腈溶液5 mL，置于10 mL 離心管中，放于恒溫振蕩器中吸附至飽和，12 000 r/min、25 ℃離心10 min，取上清液。工藝評價(jià)指標(biāo)參考文獻(xiàn)[12-14]，采用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC），測定相應(yīng)的峰面積。聚合物對底物的平衡吸附量（Q，mg/g）、印跡量（W，mg/g）以及印跡因子（F）的計(jì)算公式如下。W反映BCA-MIPs 對BCA 的印跡能力，F(xiàn)反映MIPs 相對于NIPs 的吸附能力。

式中：C0為模板分子初始濃度，μg/mL；Cs為吸附平衡時(shí)上清液濃度，μg/mL；V為底物溶液的體積，mL；m為聚合物的質(zhì)量，mg。

式中：QMIP為BCA-MIPs 的吸附量；QNIP為NIPs 的吸附量。

本研究試驗(yàn)結(jié)果由綜合評分法進(jìn)行評判，即指定W（Y1）和F（Y2）的權(quán)重系數(shù)分別為0.5、0.5。規(guī)定W（Y1）最高值得分為50，最低值得分為0；F（Y2）最高值得分為50，最低值得分為0，綜合評分值（Y）的計(jì)算公式如下。

式中：Y1max與Y1min分別為W最大值與最小值；Y2max與Y2min分別為F最大值與最小值。

通過綜合評分，考察不同功能單體與交聯(lián)劑摩爾比、致孔劑體積及引發(fā)劑用量對BCA-MIPs 制備工藝的影響。之后，在優(yōu)化BCA-MIPs 制備工藝的基礎(chǔ)上，根據(jù)Q值與初始濃度C0繪制等溫吸附曲線并進(jìn)行斯卡查德（Scatchard）模型分析。

Scatchard 模型是評價(jià)分子印跡聚合物的結(jié)合特性常用方法。Scatchard 方程如下。

式中：Q為吸附量，mg/g；Kd為結(jié)合位點(diǎn)平衡常數(shù)，μg/mL；Qmax為結(jié)合位點(diǎn)最大表觀結(jié)合量，mg/g；CBCA為底物在上清液中的平衡質(zhì)量濃度，μg/mL。

1.3.4 掃描電鏡（scanning electron microscope，SEM）觀察

參考文獻(xiàn)[15]中的方法，分別將噴金處理后的BCA-MIPs 和NIPs 放入掃描電鏡樣品槽中，調(diào)整觀察樣品的位置和大小，直至出現(xiàn)清晰可見的圖像，拍照采集其表面形態(tài)、顆粒大小及均勻度等特征。

1.3.5 熱重分析

采用熱重/差熱綜合熱分析儀，在測定溫度為30～800 ℃，升溫速率為10 ℃/min 條件下，分析BCA-MIPs熱穩(wěn)定性。

1.3.6 動態(tài)吸附性能評價(jià)

1.3.7 識別性能評價(jià)

選取相同的母核不同取代基團(tuán)的染料木素和相同取代基團(tuán)不同母核的金合歡素，作為BCA 的結(jié)構(gòu)相似物，考察BCA-MIPs 對BCA 的識別能力，結(jié)構(gòu)式見圖1。

圖1 不同底物結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structures of different substrates

精密稱取BCA-MIPs 與NIPs 各50 mg，置于10 mL具塞錐形瓶中，依次加入5 mL 濃度為200 μg/mL 的BCA、染料木素及金合歡素混合底物溶液，于室溫下振蕩12 h。參考文獻(xiàn)[17]中的方法，求得BCA-MIPs 對底物吸附量Q值，計(jì)算聚合物分配系數(shù)（K）、分離因子（α），考察BCA-MIPs 對不同底物的特異性吸附能力。計(jì)算公式如下。

式中：CMIP和CNIP為BCA-MIPs 和NIPs 結(jié)合底物的濃度，μg/mL；CS為吸附平衡時(shí)底物在溶液中的濃度，μg/mL。

式中：Ki為模板分子分配系數(shù)；Kj為底物分子分配系數(shù)。規(guī)定若j＝i，則α=1；若α＜1，表明BCA-MIPs 對其模板分子沒有選擇性；若α＞1，則表明BCA-MIPs 對模板分子具有一定的選擇性。

1.3.8 BCA-MIPs 應(yīng)用

稱取干燥的降香葉適量，粉碎，以甲醇為提取溶劑，按照料液比1∶10（g/mL），熱回流提取2 次，每次2 h，過濾，合并濾液，減壓回收溶劑，真空干燥，得到降香葉提取物。再以乙腈為溶劑，定容于100 mL 容量瓶中，超聲30 min，得到降香葉提取物溶液，備用。

1.3.8.1 洗滌溶劑條件篩選

將按照1.3.3.2 方法制備得到的BCA-MIPs，裝填入SPE 柱中，依次加入10 mL 水和10 mL 甲醇活化，再取上述降香葉提取物溶液，然后分別用1、2、5、10、20 mL的甲醇或乙腈作為洗滌溶劑進(jìn)行淋洗，濃縮后，考察不同洗滌條件對分子印跡SPE 柱保留率的影響。按1.3.3.1的HPLC 測定方法，測定洗滌液中的BCA 含量，計(jì)算分子印跡SPE 柱保留率（A，%）。

式中：P0和P1分別為在樣品溶液中和在洗滌液中的BCA 質(zhì)量，μg。

1.3.8.2 洗脫溶劑條件篩選

考察洗脫體積為5、10、15、20、25、50 mL 的條件下，體積比為9∶1 的甲醇與乙酸對BCA 洗脫率的影響，按照1.3.3.1 的HPLC 測定方法，測定洗滌液中的BCA 含量，計(jì)算分子印跡SPE 柱洗脫率（B，%）。

式中：P、P0、P1分別為在洗脫液、樣品溶液及洗滌液中BCA 的質(zhì)量，μg。

1.3.8.3 重復(fù)利用次數(shù)的測定

對BCA-MIPs SPE 柱進(jìn)行吸附、解吸附及再生，重復(fù)進(jìn)行15 次，考察重復(fù)利用次數(shù)對BCA-MIPs SPE 回收率的影響，回收率（R，%）的計(jì)算公式如下。

式中：Qn為第n次上樣時(shí)BCA-MIPs 對BCA 吸附量，mg；Q0為單次上樣的原提取物中BCA 質(zhì)量，mg。

1.3.8.4 實(shí)際應(yīng)用

稱取干燥的降香葉提取物1.00 g，溶解于10 mL 乙腈中，按1.3.3.1 色譜條件進(jìn)行測定，計(jì)算其中BCA 含量。同時(shí)，將100 mg/mL 提取物溶液進(jìn)行SPE，經(jīng)上樣、洗滌及洗脫，對洗脫液進(jìn)行減壓濃縮、干燥、稱重、乙腈溶解，按1.3.3.2 方法測定其中的BCA 含量。HPLC 色譜圖如圖2所示。

圖2 HPLC 色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用GraphPad Prism 8.0 軟件，利用單因素方差分析法（One-way ANOVA）進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。多組間比較采用Dunnett-t檢驗(yàn)，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫外吸收光譜分析

樣品紫外吸收圖與不同摩爾比條件下，復(fù)合物與BCA、1-viny 吸光度差值結(jié)果見圖3。

圖3 紫外吸收光譜分析結(jié)果Fig.3 Analysis of UV absorption spectrum results

由圖3A 可知，BCA、1-viny 及兩者復(fù)合物對應(yīng)溶液樣品均在196 nm 下出現(xiàn)最大吸收峰。根據(jù)吸光度的加和性原則，即在多組分體系中，在某一波長下，如果各種對光有吸收的物質(zhì)之間沒有相互作用，則體系在該波長處的總吸光度等于各組分吸光度的和[18]。由圖3B 可知，在196 nm 下，不同摩爾比條件下的BCA 與1-viny 復(fù)合物吸光度并不等于BCA 吸光度與1-viny吸光度的加和，且當(dāng)BCA 與1-viny 在摩爾比為1∶2時(shí)，吸光度差值△A最大。結(jié)果表明：BCA 與1-viny 在摩爾比為1∶2 時(shí)，兩者的相互作用最強(qiáng)?；诖耍狙芯吭O(shè)計(jì)BCA-MIPs 制備示意圖見圖4。

圖4 BCA-MIPs 制備示意圖Fig.4 Schematic representation of BCA-MIPs

2.2 傅里葉紅外光譜分析

圖5 為傅里葉紅外光譜結(jié)果。

由圖5 可知，BCA 紅外光譜在1 619.64、1 563.17、1 516.52 cm-1處出現(xiàn)共軛苯環(huán)的多重特征吸收峰，且在3 386.80 cm-1處出現(xiàn)羥基吸收峰。在BCA-MIPs 和NIPs 紅外光譜圖中，均顯示在1 731.36 cm-1處，出現(xiàn)EDMA 飽和酯的C=O 的伸縮振動峰。當(dāng)BCA-MIPs 經(jīng)溶劑洗脫BCA 后，苯環(huán)的多重特征吸收峰、3 386.80 cm-1羥基—OH 伸縮振動及1 500～1 300 cm-1酚羥基—OH彎曲振動消失。與NIPs 紅外光譜相比，BCA-MIPs 從3 601.02 cm-1移動到3 604.09 cm-1，—OH 發(fā)生偏移，峰型強(qiáng)而寬，結(jié)果表明：在BCA-MIPs 中，BCA 與1-viny之間發(fā)生氫鍵相互作用。

2.3 BCA-MIPs 制備條件優(yōu)化結(jié)果

2.3.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

不同制備條件對BCA-MIPs 吸附效果的影響如圖6所示。

圖6 不同制備條件對BCA-MIPs 吸附效果的影響Fig.6 Effects of different preparation conditions on the adsorption performance of BCA-MIPs

由圖6 可知，BCA、1-viny 及EDMA 的摩爾比為1∶2∶10，置于30 mL 乙腈致孔劑中，加入30 mg AIBN，在聚合溫度60 ℃下進(jìn)行聚合反應(yīng)，制備得到的BCAMIPs 綜合評分最高。當(dāng)?shù)孜餄舛葹?00 μg/mL 時(shí)，BCA-MIPs 最大吸附量為6.52 mg/g。此外，當(dāng)致孔劑體積為50 mL 時(shí)，仍有未反應(yīng)的溶劑，此時(shí)聚合反應(yīng)不完全。

2.3.2 吸附等溫曲線與斯卡查德（Scatchard）模型分析

等溫吸附曲線與Scatchard 分析結(jié)果如圖7所示。

由圖7A 可知，隨著BCA 濃度的增加，BCA-MIPs對BCA 的吸附量（Q）逐漸增大，且均大于NIPs 對應(yīng)的Q值。由圖7B 可知，以Q/CBCA對Q作圖，通過曲線擬合，得到回歸方程：Y=-0.006 4X+0.049 4（r=0.996 3），且圖中是一條直線，說明BCA-MIPs 形成了一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，與BCA 之間的相互作用主要依賴于氫鍵[19]。這與本研究紅外光譜分析結(jié)果相一致。同時(shí)，確定聚合物結(jié)合位點(diǎn)的平衡常數(shù)Kd=156.25 μg/mL，最大表觀結(jié)合量Qmax=7.72 mg/g。

2.4 掃描電鏡分析

圖8 為BCA-MIPs 與NIPs 掃描電鏡圖。

圖8 BCA-MIPs 與NIPs 掃描電鏡圖Fig.8 SEM images of BCA-MIPs and NIPs

由圖8 可知，通過比較BCA-MIPs 和NIPs 的SEM形貌，發(fā)現(xiàn)BCA-MIPs 結(jié)構(gòu)中出現(xiàn)多孔穴形態(tài)且粒徑較NIPs 更大。

2.5 熱重分析

BCA-MIPs 熱重分析結(jié)果如圖9所示。

圖9 BCA-MIPs 熱重分析Fig.9 Thermogravimetric analysis of BCA-MIPs

由圖9 可知，當(dāng)溫度在340 ℃以內(nèi)時(shí)，BCA-MIPs質(zhì)量僅損失10%；當(dāng)溫度超過340 ℃，聚合物開始分解；當(dāng)溫度超過646 ℃，質(zhì)量損失達(dá)95%，幾乎完全分解。結(jié)果表明：BCA-MIPs 在340 ℃以內(nèi)具有良好的熱穩(wěn)定性。

2.6 動態(tài)吸附性能評價(jià)

BCA-MIPs 和NIPs 動力吸附曲線如圖10所示。

圖10 BCA-MIPs 和NIPs 動力吸附曲線Fig.10 Dynamic adsorption curves of BCA-MIPs and NIPs

由圖10 可知，隨著振蕩時(shí)間的延長，BCA-MIPs與NIPs 對應(yīng)吸附動力學(xué)曲線均呈先增加后趨于平緩的趨勢，且前者Q值明顯高于在對應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的后者。

運(yùn)用Origin 2018 軟件進(jìn)行曲線擬合，分別得到準(zhǔn)一級動力學(xué)方程與準(zhǔn)二級動力學(xué)方程，動力學(xué)擬合參數(shù)見表2。

表2 動力學(xué)擬合參數(shù)Table 2 Kinetic fitting parameters

由表2 可知，BCA-MIPs 和NIPs 對應(yīng)的準(zhǔn)二級動力學(xué)方程線性相關(guān)系數(shù)不僅均大于準(zhǔn)一級動力學(xué)方程線性相關(guān)系數(shù)，而且其平衡吸附量計(jì)算值更接近真實(shí)值。結(jié)果表明：BCA-MIPs 對BCA 的吸附可能以化學(xué)吸附為主[20]。

2.7 識別性能評價(jià)

BCA-MIPs 和NIPs 對不同底物的識別性能評價(jià)結(jié)果如圖11所示。

圖11 BCA-MIPs 和NIPs 對不同底物的識別性能Fig.11 The recognition performance of BCA-MIPs for each substrate

由圖11 可知，與NIPs 相比，BCA-MIPs 對BCA 的吸附量Q具有顯著差異（P＜0.05），而其對染料木素與金合歡素的吸附量Q則無顯著差異。經(jīng)計(jì)算，BCA 與染料木素、金合歡素的α 值分別為3.66 和108，均大于1，表明BCA-MIPs 對BCA 具有良好的識別能力。

2.8 BCA-MIPs 的實(shí)際應(yīng)用

2.8.1 洗滌溶劑條件篩選結(jié)果

不同洗滌條件對分子印跡SPE 柱保留率的影響如圖12所示。

圖12 不同洗滌條件對分子印跡SPE 柱保留率的影響Fig.12 Retention rates of washing with different solvents

由圖12 可知，隨著甲醇或乙腈洗滌溶劑體積的增加，BCA-MIPs 固相萃取保留率曲線均呈先下降后趨于平緩的趨勢。進(jìn)一步曲線擬合，確定甲醇對應(yīng)線性擬合方程：Y=0.067 2X2-0.563 2X+1.165 5（R2=0.990 9），拐點(diǎn)X=4.19 mL；乙腈對應(yīng)線性擬合方程：Y=0.015 9X2-0.356 0X+1.330 2（R2=0.954 7），拐點(diǎn)X=11.19 mL。在此基礎(chǔ)上，從降低生產(chǎn)成本角度考慮，最終確定以甲醇為BCA-MIPs 固相萃取洗滌劑。

2.8.2 洗脫溶劑條件篩選結(jié)果

不同洗脫體積對分子印跡SPE 柱洗脫率的影響如圖13所示。

由圖13 可知，隨著洗脫溶劑體積的增加，BCA 的洗脫率曲線呈先快速增加后緩慢降低的趨勢。進(jìn)一步對洗脫曲線進(jìn)行擬合，得到線性擬合方程：Y=-0.034 9X2+2.436 2X+55.566（R2=0.959 9），拐點(diǎn)X=34.90 mL，對應(yīng)Y最大值為98.08%。最終確定使用甲醇∶乙酸=9∶1（體積比）的溶液34.90 mL 進(jìn)行洗脫。

2.8.3 重復(fù)利用次數(shù)

重復(fù)利用次數(shù)對BCA-MIPs 分子印跡SPE 回收率的影響如圖14所示。

圖14 重復(fù)利用次數(shù)對BCA-MIPs 分子印跡SPE 回收率的影響Fig.14 Effect of reuse times on the recovery of BCA-MIPs in solid-phase extraction

由圖14 可知，當(dāng)BCA-MIPs 分子印跡SPE 柱進(jìn)行“吸附-解吸附-再生”重復(fù)吸附小于9 次時(shí)，BCAMIPs 分子印跡SPE 回收率大于95%，結(jié)果表明：BCAMIPs 分子印跡SPE 柱可重復(fù)利用9 次，再生能力強(qiáng)。

2.8.4 分子印跡SPE 在降香葉中的實(shí)際應(yīng)用

降香葉中BCA 經(jīng)分子印跡SPE 前后純度比較結(jié)果如圖15所示。

圖15 降香葉中BCA 經(jīng)分子印跡SPE 前后純度比較Fig.15 Purity of BCA in Dalbergia odorifera leaves before and after solid-phase extraction with BCA-MIPs

由圖15 可知，經(jīng)BCA-MIPs 分子印跡SPE 萃取后，洗脫物中BCA 純度較固相萃取前提高了4.4 倍，相當(dāng)于從原提取物中去除掉約77%的雜質(zhì)。結(jié)果表明：BCA-MIPs 用于分離降香葉中的BCA 效果良好。

3 結(jié)論

本文采用沉淀聚合法，確定制備BCA-MIPs 的最佳工藝，即在聚合溫度60 ℃下，按照BCA、1-viny 及EDMA 的摩爾比為1∶2∶10，置于30 mL 乙腈致孔劑中，加入30 mg AIBN，通氮?dú)?0 min，反應(yīng)時(shí)間24 h，BCA-MIPs 最大吸附量為6.52 mg/g。同時(shí)，斯卡查德分析顯示BCA-MIPs 形成了一種結(jié)合位點(diǎn)，其吸附性能符合準(zhǔn)二級動力學(xué)方程。本研究所獲得的BCA-MIPs具有制備工藝簡單、合成成本低廉、對BCA 選擇性好、再生能力強(qiáng)等特點(diǎn)，成功應(yīng)用于分離降香葉中活性成分BCA，從而為海南地方特色食品資源的深度開發(fā)利用提供技術(shù)支撐。