γ-氨基丁酸生物合成研究進(jìn)展

賈世杰，劉江花，李國梁

（陜西科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 西安 710021）

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）是一種四碳非蛋白質(zhì)氨基酸，分子式為C4H9NO2，相對(duì)分子質(zhì)量103.12，呈白色結(jié)晶粉末狀，于19世紀(jì)末首次人工合成[1]。GABA 在醫(yī)藥食品領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，富含GABA的食品有助于提高睡眠質(zhì)量、促進(jìn)新陳代謝、恢復(fù)腦細(xì)胞活力等[2]，臨床上主要用于高血壓、癲癇、心率失常、睡眠障礙、焦慮和抑郁癥等疾病的治療[3]。隨著對(duì)GABA 生理功能研究的不斷深入，其市場(chǎng)需求量也隨之不斷提高。

目前，GABA 的生產(chǎn)方法主要有化學(xué)合成、植物富集及生物合成?；瘜W(xué)合成主要以γ-丁內(nèi)酯、γ-鹵代丁腈、2-溴丙酸和戊二酸酐作為底物合成GABA[4]，其反應(yīng)速度快、產(chǎn)量高，但存在原料毒性大、反應(yīng)環(huán)境嚴(yán)格、設(shè)備成本高、易產(chǎn)生有毒有害副產(chǎn)物、造成環(huán)境污染等問題，一定程度上限制了其在食品醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用。相較于化學(xué)合成，通過低溫或高鹽脅迫處理從植物中富集GABA 操作簡(jiǎn)單、安全、環(huán)境友好，但其存在富集產(chǎn)率低和成本高的局限性，無法滿足市場(chǎng)需求[5]。生物合成是利用微生物將底物轉(zhuǎn)化為GABA，具有環(huán)境友好、反應(yīng)溫和、綠色環(huán)保的優(yōu)點(diǎn)，適用于食品藥品領(lǐng)域，又因微生物具有繁殖周期短、生長(zhǎng)快及適應(yīng)性強(qiáng)等特點(diǎn)受到廣泛關(guān)注。

盡管當(dāng)前生物合成GABA 已經(jīng)取得了一些進(jìn)展，但仍存在一系列瓶頸問題，影響進(jìn)一步提高其產(chǎn)量，其一是缺乏高效安全的底盤菌株，盡管常用的大腸桿菌具有比較完備的酶系統(tǒng)，但其固有的內(nèi)毒素導(dǎo)致的安全性問題在一定程度上限制了它的應(yīng)用[6]；乳酸菌系多為益生菌，其催化合成GABA 效率較高，但也受到調(diào)節(jié)因子和環(huán)境的抑制[7]；霉菌和酵母菌的催化效率相對(duì)較差。此外，還存在因輔酶因子缺乏導(dǎo)致限速酶活性不高、菌株與限速酶最適pH 值和溫度不兼容、從頭合成底物利用率低、代謝負(fù)擔(dān)影響菌株生長(zhǎng)等問題。針對(duì)上述問題，已經(jīng)報(bào)道了相應(yīng)策略如篩選高產(chǎn)益生菌及誘變育種、構(gòu)建輔酶因子回補(bǔ)途徑、限速酶的定向改造、途徑改造、多菌株共培養(yǎng)等，但是目前還缺乏對(duì)GABA 生物合成產(chǎn)量提高策略的系統(tǒng)綜述，因此本文對(duì)當(dāng)前生物合成GABA 及其產(chǎn)量提高策略進(jìn)行了系統(tǒng)總結(jié)（見圖1），并對(duì)未來的發(fā)展方向進(jìn)行了展望。

圖1 生物合成γ-氨基丁酸的產(chǎn)量提高策略Fig.1 Production increase measures for the biosynthesis of gamma-aminobutyric acid（GABA）

1 GABA 的生物合成

1.1 GABA 生物合成途徑

微生物發(fā)酵生產(chǎn)GABA 主要通過支路途徑和腐胺途徑進(jìn)行（見圖2）。支路途徑于1970年首次提出，由磷酸吡哆醛（pyridoxal phosphate，PLP）依賴的谷氨酸脫羧酶（glutamate decarboxylase，GAD）催化L-谷氨酸的α-脫羧形成GABA，是微生物生產(chǎn)GABA 的主要方式[8]。腐胺途徑是由腐胺、多胺或鳥氨酸經(jīng)一系列降解反應(yīng)合成GABA，由于腐胺及其代謝產(chǎn)物對(duì)宿主具有很強(qiáng)的毒性，采用此方法合成GABA 的報(bào)道較少[9]。此外，最新研究證明乳酸菌中存在一種新型的GABA合成路徑，以谷氨酸作為氨基供體，在γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶（γ-aminobutyric acid transaminase，gabT）的作用下將琥珀酸半醛（succinic acid semialdehyde，SSA）轉(zhuǎn)化為GABA[10]。

圖2 GABA 的合成途徑Fig.2 The synthetic pathway of GABA

1.2 底盤菌株的選擇

GABA 可以通過多種底盤菌株合成，主要包括大腸桿菌、乳酸菌、谷氨酸棒狀桿菌、酵母菌屬、枯草芽孢桿菌、少數(shù)霉菌、雙歧桿菌等。

1.2.1 大腸桿菌

大腸桿菌具有培養(yǎng)周期短、繁殖速度快、適應(yīng)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，是天然產(chǎn)物生物合成常用的細(xì)胞工廠。研究表明，大腸桿菌具有較為完備的酶系統(tǒng)，在合成生物學(xué)中應(yīng)用較廣。在大腸桿菌中表達(dá)密碼子優(yōu)化的乳球菌谷氨酸脫羧酶B（glutamate decarboxylase B，gadB），以2 mol/L 葡萄糖作為底物，GABA 的平均產(chǎn)率達(dá)到40.94 g（/L·h），經(jīng)3 次補(bǔ)料培養(yǎng)后獲得614.15 g/L GABA，摩爾轉(zhuǎn)化率接近100%（見表1）[11]，表明大腸桿菌在GABA 生產(chǎn)中具有較大潛力。但是革蘭氏陰性菌固有的內(nèi)毒素存在潛在毒性風(fēng)險(xiǎn)，限制其在食品藥品領(lǐng)域的應(yīng)用，無內(nèi)毒素益生菌EscherichiacoliNissle 1917的發(fā)現(xiàn)為GABA 的合成帶來了新機(jī)遇，利用基因編輯工具CRISPR/Cas 改造Nissle 1917 合成GABA，其產(chǎn)量可達(dá)17.9 g/L[6]。雖然合成產(chǎn)量相較于其它大腸桿菌較低，但是作為益生菌，EscherichiacoliNissle 1917 滿足了安全性要求，在GABA 生物合成中有著更廣闊的應(yīng)用前景。

表1 GABA 生物合成底盤菌株及產(chǎn)量Table 1 The chassis strains of GABA biosynthesis and their production

1.2.2 乳酸菌

乳酸菌是一種食品級(jí)的安全菌株，在自然界分布極為廣泛，具有豐富的物種多樣性，是研究分子生物學(xué)和基因工程的理想材料。利用乳酸菌作為底盤菌株生產(chǎn)GABA 由來已久，乳酸菌谷氨酸脫羧酶具有較好的催化活性，常被用來過表達(dá)生產(chǎn)GABA。利用靜息乳酸菌以谷氨酸鈉作為底物生產(chǎn)GABA，產(chǎn)量最高可達(dá)201.18 g/L，產(chǎn)率為20.118 g（/L·h），轉(zhuǎn)化率可達(dá)99.4%[12]，表明利用乳酸菌生產(chǎn)GABA 具有巨大潛力（表1）。在乳酸菌中，氮調(diào)節(jié)劑（global transcriptional regulatory proteins of nitrogen metabolism，GlnR）可直接調(diào)節(jié)谷氨酸與GABA 轉(zhuǎn)化，能夠抑制谷氨酸脫羧酶基因gadB和GABA 逆轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因（γ-aminobutyrate antiporter，gadC）的轉(zhuǎn)錄，利用GlnR缺失菌株能夠合成284.7 g/L GABA，其產(chǎn)量是野生型菌株的9.8 倍[7]。乳酸菌生產(chǎn)GABA 也受到中堿性環(huán)境的限制，加入過量的谷氨酸，在保障底物充足的情況下，又能維持pH 值穩(wěn)定，利用這種pH 值自動(dòng)維持的體系，L.brevisCD0817 能夠合成（321.9±6.7）g/L GABA，產(chǎn)率為6.71 g/（L·h），這是一種低成本、相對(duì)簡(jiǎn)單的維持環(huán)境穩(wěn)定的方法，但也存在谷氨酸溶解度低、產(chǎn)率不高的問題[13]。

1.2.3 谷氨酸棒狀桿菌

谷氨酸棒狀桿菌一般公認(rèn)為安全菌株，在合成氨基酸方面有著顯著優(yōu)勢(shì)。Wen 等[14]在谷氨酸棒狀桿菌中過表達(dá)來自大腸桿菌的突變谷氨酸脫羧酶（glutamate decarboxylase B mutant，gadBmut）（Glu89Gln/ΔC452-462），并結(jié)合谷氨酸脫羧酶分泌表達(dá)策略，GABA 的產(chǎn)量可達(dá)77.6 g/L GABA，產(chǎn)率為1.21 g/（L·h），每克葡萄糖可轉(zhuǎn)化為0.44 g GABA，這是首次報(bào)道利用谷氨酸棒狀桿菌胞外催化合成GABA。另外，為了緩解菌株生長(zhǎng)與高附加值產(chǎn)品合成之間對(duì)底物競(jìng)爭(zhēng)的矛盾，Wei等[15]創(chuàng)建了一個(gè)可調(diào)控的生長(zhǎng)階段依賴性自主雙功能遺傳開關(guān)（growth phase-dependent autonomous bifunctional genetic switch，GABS），能夠?qū)崿F(xiàn)谷氨酸棒狀桿菌從生長(zhǎng)模式到生產(chǎn)模式的狀態(tài)轉(zhuǎn)換，利用甘油作為底物發(fā)酵生產(chǎn)GABA，其產(chǎn)量可達(dá)45.6 g/L，每克甘油可轉(zhuǎn)化為0.4 g 的GABA。谷氨酸棒狀桿菌在合成GABA過程中具有良好的底物（谷氨酸）生產(chǎn)能力，但其基因組中不含谷氨酸脫羧酶基因，需要通過引入異源谷氨酸脫羧酶基因進(jìn)行表達(dá)。

1.2.4 酵母菌

酵母菌被廣泛用于釀造業(yè)，其基因組中含有谷氨酸脫羧酶基因，因此具有發(fā)酵生產(chǎn)GABA 的潛力。Han 等[16]利用分離篩選出來的酵母菌PichiasilvicolaUL6-1 和Sporobolomycescarnicolor402-JB-1 在酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖培養(yǎng)基中于30 ℃培養(yǎng)30 h，分別能夠合成136.5 μg/mL 和200.8 μg/mL GABA，由此可見，天然酵母菌的谷氨酸脫羧酶活性不佳。為解決野生型酵母產(chǎn)能弱的劣勢(shì)，Yuan 等[17]在釀酒酵母菌中異源表達(dá)來自鏈霉菌屬的谷氨酸脫羧酶，經(jīng)十批補(bǔ)料發(fā)酵后，GABA 產(chǎn)量達(dá)到62.6 g/L，總摩爾轉(zhuǎn)化率為60.8%，極大地提高了GABA 的產(chǎn)量。此外，Zhang 等[18]利用克魯維酵母以豆渣作為原料生產(chǎn)GABA，在初始pH4.0、培養(yǎng)溫度35 ℃下發(fā)酵60 h，最高可獲得4.31 g/L GABA（表1）。但是目前基于酵母生產(chǎn)GABA 的產(chǎn)率相比于其它底盤菌株仍然較低。

2 GABA 產(chǎn)量的提高

2.1 篩選野生型高產(chǎn)菌株及誘變育種

篩選天然高產(chǎn)菌株是提高GABA 產(chǎn)量的基本策略。Wang 等[28]從我國泡菜中分離的短乳酸桿菌NCL912，發(fā)酵48 h，GABA 的產(chǎn)量可達(dá)（205.8±8.0）g/L，此外，酵母菌、霉菌等也被篩選出來用于GABA 生產(chǎn)，但產(chǎn)率均不高，需做進(jìn)一步改造。

微生物誘變育種是以人工手段誘發(fā)微生物基因突變，改變其遺傳信息和功能，通過誘變育種能夠篩選性能優(yōu)越的突變菌株。Wu 等[30]通過大氣與室溫等離子體誘變過的紅曲霉具有固態(tài)發(fā)酵GABA 的能力，優(yōu)化底物配比后，GABA 的產(chǎn)量可達(dá)15.93 mg/g，但是誘變育種的不定向性與低頻性導(dǎo)致菌種選育工作量大，采用此方法生產(chǎn)GABA 的報(bào)道較少。

2.2 限速酶優(yōu)化

2.2.1 不同菌株來源的限速酶活性

自然界中谷氨酸脫羧酶廣泛分布于各種微生物中，其來源不同，活性也存在差異，目前報(bào)道的少數(shù)乳酸菌屬、芽孢桿菌屬谷氨酸脫羧酶活性較高。GAD 限速酶活性比較見表2。

表2 GAD 限速酶活性比較Table 2 Comparison of the activity of rate-limiting enzyme（glutamic acid decarboxylase）among different strains

2.2.2 兩階段pH 值調(diào)控策略合成GABA

在支路途徑生產(chǎn)GABA 中，谷氨酸脫羧酶（GAD）扮演了重要角色，以磷酸吡哆醛為輔酶、不可逆地將谷氨酸（L-glutamate,L-Glu）轉(zhuǎn)化為GABA，反應(yīng)過程中消耗H+并釋放CO2，使培養(yǎng)基中pH 值上升[38]。不同菌株來源的GAD 在低pH 值下發(fā)揮作用，即使是來自GAD 活性普遍較高的大腸桿菌和乳酸桿菌，在中性條件下也會(huì)急劇失活，而大多數(shù)微生物的最適生長(zhǎng)條件偏向于中性（見表3），因此導(dǎo)致了菌株與限速酶pH 值不兼容。采用兩階段pH 值發(fā)酵策略能在一定程度解決該問題，首先調(diào)節(jié)pH 值使得菌株快速生長(zhǎng)，待菌株達(dá)到穩(wěn)定期后，調(diào)節(jié)到限速酶的最適pH 值，用于生產(chǎn)GABA。應(yīng)用此思路，利用來自L.brevisTCCC13007 建立了一個(gè)用于生產(chǎn)GABA 的兩步細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化過程。首先，在7%的含味精培養(yǎng)基中，初始pH 值為6.0，隨后控制pH 值為4.6，發(fā)酵66 h 可獲得約38 g/L 的GABA，轉(zhuǎn)化率為98.6%[39]。在谷氨酸棒狀桿菌中引入來自乳酸菌谷氨酸脫羧酶和磷酸激酶，采用兩階段pH 值調(diào)控策略，最終產(chǎn)量達(dá)到70.6 g/L[40]，兩階段pH 值調(diào)控策略對(duì)于GABA 的合成有效，但步驟較為繁瑣。

表3 菌株與限速酶最適pH 值和溫度Table 3 Optimum pH values and temperatures for strains and the rate-limiting enzyme

2.2.3 限速酶定向改造

近年來，隨著結(jié)構(gòu)信息學(xué)的不斷進(jìn)步，GAD 的晶體結(jié)構(gòu)已被獲悉，通過在不同條件下對(duì)GAD 晶體結(jié)構(gòu)的分析發(fā)現(xiàn)，GAD 的羧基端在酸性pH 值下大多是沒有結(jié)構(gòu)的，但接近中性條件時(shí)，會(huì)形成類似于“塞”的結(jié)構(gòu)，阻止了底物谷氨酸在中性pH 值下與活性位點(diǎn)的結(jié)合[41，45]。另外，研究發(fā)現(xiàn)幾個(gè)關(guān)鍵的氨基酸殘基與酶活性位點(diǎn)有關(guān)，不同來源的GAD 關(guān)鍵位點(diǎn)不同，大腸桿菌的谷氨酸脫羧酶中Glu89 與pH 值協(xié)同活性相關(guān)，雙重突變體Glu89Gln/ΔC452-466 不僅破壞了協(xié)同性，而且產(chǎn)生了在接近中性pH 值下仍保持活性的突變GAD[46]。而在乳酸菌谷氨酸脫羧酶中，則與17、294、312、346 號(hào)位氨基酸有關(guān)，多重突變體K17T/D294G/E312S/Q346/ΔC11 表現(xiàn)出中性pH 值下的活性，酶的催化活性kcat/Km 達(dá)到3.91 m·mol/（L·S），與野生型相比提高了5 倍多[45]。而在巨大芽孢桿菌中酶的pH 值協(xié)同活性則與294 和467 號(hào)氨基酸有關(guān)，突變體E294R/H467A 提高了pH 值的活性范圍[43]。在恥垢分枝桿菌中C 端缺失突變體GADMSMΔC 的Vmax 和Km 值在pH5.5 下分別為14.69 和5.70，在pH7.0 下分別為9.87和6.17。與野生型GAD 相比，GADMSMΔC 保持了更高的底物親和力和酶活性，即使在pH7.0 時(shí)也保持了78.5%的酶活性[47]。

除了pH 值協(xié)同活性，酶對(duì)溫度的耐受性也是工業(yè)化要求之一，因此可以定向改造GAD 的熱穩(wěn)定性。乳酸菌谷氨酸脫羧酶突變體S325A 不僅提高了半熱致死溫度，且酶活性相較于野生型也有明顯增強(qiáng)[35]。大腸桿菌谷氨酸脫羧酶三重突變體Gln5Ile/Val6Asp/Thr7Gln 相較于野生型顯示出更高的熱穩(wěn)定性[48]。

近期報(bào)道了一種基于序列的蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)新策略，基于全一致序列設(shè)計(jì)的人工谷氨酸脫羧酶（Full consensus GAD，F(xiàn)cGAD）在耐熱性、耐酸性及催化活性較野生型有著明顯優(yōu)勢(shì)，利用表達(dá)FcGAD 的大腸桿菌作為生物催化劑，實(shí)現(xiàn)了克級(jí)GABA 的合成[36]。隨著生物信息學(xué)的發(fā)展，基于共識(shí)序列設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)為提高GABA產(chǎn)量提供了新思路。

2.2.4 構(gòu)建輔酶因子回補(bǔ)途徑提高酶活性

PLP 是谷氨酸脫羧酶重要的輔酶因子，機(jī)體缺乏PLP 會(huì)導(dǎo)致GAD 活性下降，因此可以通過構(gòu)建輔酶因子回補(bǔ)途徑來解決活性不足的問題。在大腸桿菌中共表達(dá)來自乳酸菌的GAD 與來自大腸桿菌磷酸吡哆醛激酶（pyridoxal kinase gene，pdxY），優(yōu)化培養(yǎng)和反應(yīng)條件，0.6 mol/L 谷氨酸鈉實(shí)現(xiàn)了100%轉(zhuǎn)化率[49]。同樣在大腸桿菌中表達(dá)來自釀酒酵母的pdx1 和pdx2 兩種磷酸激酶，以25 g/L 谷氨酸鈉為底物合成了13.2 g/L 的GABA，其合成產(chǎn)量相較于原始菌株有著明顯提高[50]。

2.3 支路途徑改造

2.3.1 一步法途徑改造

一步法合成GABA 是指在培養(yǎng)基中直接補(bǔ)充底物谷氨酸（或谷氨酸鈉），在谷氨酸脫羧酶的作用下生成GABA，其受到幾個(gè)關(guān)鍵基因調(diào)控：gadB編碼谷氨酸脫羧酶，能夠?qū)⒐劝彼徂D(zhuǎn)化為GABA；gadC編碼轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，負(fù)責(zé)將胞外的谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)到胞內(nèi)，將合成GABA 轉(zhuǎn)運(yùn)到胞外，其轉(zhuǎn)運(yùn)效率受到pH 值的影響，當(dāng)pH 值高于6.5 時(shí)，其羧基末端塞子狀結(jié)構(gòu)域閉合，阻斷向內(nèi)開放[51]；gabT編碼GABA 轉(zhuǎn)氨酶，能夠?qū)ABA轉(zhuǎn)化為琥珀酸半醛；gabP編碼逆轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，負(fù)責(zé)將胞外的GABA 轉(zhuǎn)運(yùn)至胞內(nèi)。在重塑代謝網(wǎng)絡(luò)提高產(chǎn)量的策略中，需要上調(diào)谷氨酸流向GABA 的通量，即上調(diào)gadB和gadC的轉(zhuǎn)錄與翻譯水平，下調(diào)降解途徑及逆轉(zhuǎn)運(yùn)途徑，即敲除gabT與gabP途徑。應(yīng)用此策略，過表達(dá)與GABA 生物合成和轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的基因gadA、gadB和gadC，同時(shí)敲除降解相關(guān)基因gabT，以及逆轉(zhuǎn)運(yùn)通道gabP，構(gòu)建的菌株獲得了19.79 g/L 的GABA，轉(zhuǎn)化率達(dá)到93.8%[20]。在敲除gabT的大腸桿菌突變體中，聯(lián)合表達(dá)gadB和gadC，10 g/L 的谷氨酸鈉中可產(chǎn)生5.46 g/L 的GABA，摩爾轉(zhuǎn)化率高達(dá)89.5%[52]。應(yīng)用支架在大腸桿菌中共表達(dá)gadB和gadC，10 g/L 的谷氨酸鈉中可產(chǎn)生5.65 g/L 的GABA，摩爾轉(zhuǎn)化率高達(dá)93%[19]。在大腸桿菌中共表達(dá)gadBM4-2和gadCΔC，最終產(chǎn)量達(dá)到（307.50±5.94）g/L[53]。

2.3.2 從頭設(shè)計(jì)合成途徑

在GABA 的合成中，除了利用谷氨酸（或谷氨酸鈉）作為底物，還可以利用其它碳源如纖維素、葡萄糖、木糖、甘油和甲醇等原料，既能節(jié)約資源，又能生產(chǎn)高附加值產(chǎn)品。但由于這些底物利用率低，直接以其作為底物合成GABA 效率不高，因此需要根據(jù)碳源種類開發(fā)高利用菌株，并進(jìn)行途徑改造提高GABA 的產(chǎn)量。例如，Wei 等[15]為了構(gòu)建高甘油利用率的谷氨酸棒狀桿菌，首先，過表達(dá)甘油跨膜通道（aquaglyceroporin，GlpF）、甘油脫氫酶（glycerol dehydrogenase，DhaD）、ATP 依賴的二羥基丙酮激酶（ATP-dependent dihy droxyacetone kinase，DhaK）、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（phosphoenolpyruvate carboxylase，PPC）、丙酮酸羧化酶（pyruvate carboxylase，PC）、檸檬酸合酶（citrate synthase，GltA）等，提高甘油利用率；然后，調(diào)控α-酮戊二酸碳流偏向谷氨酸合成途徑，過表達(dá)gad、gadC，獲得高產(chǎn)GABA 的菌株。在構(gòu)建高利用甘油的大腸桿菌生產(chǎn)GABA 的菌株中，首先采用進(jìn)化和代謝工程篩選出甘油適應(yīng)性高的菌株，然后失活一些非必要的代謝基因，使得更多碳通量流向GABA，提高了GABA 的產(chǎn)量[54]。

途徑改造雖然能夠?qū)⑻纪扛咝?dǎo)向目標(biāo)產(chǎn)物，但改造過程繁瑣，一些關(guān)鍵基因的缺失可能導(dǎo)致無法滿足菌株正常的生長(zhǎng)發(fā)育需求，造成菌株濃度低下，產(chǎn)量沒有大幅提高甚至下降的情況。因此，平衡生長(zhǎng)與代謝壓力之間的矛盾是關(guān)鍵。已有研究報(bào)道了一些敏感性元件，可以克服微生物生長(zhǎng)繁殖與代謝壓力之間的矛盾，使碳源優(yōu)先滿足菌株生長(zhǎng)發(fā)育，待菌群達(dá)到穩(wěn)定后，再用于產(chǎn)物代謝。如利用對(duì)生長(zhǎng)期敏感的GPP啟動(dòng)子調(diào)控生長(zhǎng)模式到生產(chǎn)模式的轉(zhuǎn)換[15]。利用對(duì)溫度敏感的啟動(dòng)子，如冷休克基因CSPA 啟動(dòng)子，通過對(duì)溫度的改變實(shí)現(xiàn)從生長(zhǎng)模式到生產(chǎn)模式的轉(zhuǎn)變[55]。利用對(duì)底物專一的啟動(dòng)子，如木糖啟動(dòng)子，在利用玉米芯水解物發(fā)酵生產(chǎn)附加值產(chǎn)品時(shí)，葡萄糖優(yōu)先用來滿足生長(zhǎng)后，在木糖啟動(dòng)子的作用下進(jìn)入生產(chǎn)模式[56]。

2.4 共培養(yǎng)策略

單菌株細(xì)胞工廠改造增加了宿主生長(zhǎng)發(fā)育的代謝負(fù)擔(dān)，容易導(dǎo)致目標(biāo)化合物產(chǎn)量不高，多菌株共培養(yǎng)減小單個(gè)菌株代謝的負(fù)擔(dān)，且減少了生物合成途徑設(shè)計(jì)，是提高目標(biāo)化合物合成產(chǎn)量的有效策略[57]。利用嗜熱鏈球菌與乳酸菌共培養(yǎng)發(fā)酵生產(chǎn)高含量GABA牛奶，嗜熱鏈球菌水解特定肽滿足了乳酸菌的生長(zhǎng)，同時(shí)，嗜熱鏈球菌分解代謝產(chǎn)生的乳酸所產(chǎn)生的酸性環(huán)境維持了乳酸菌中的GAD 活性，提高了GABA 含量[58]。糞腸球菌與融合魏斯氏菌共培養(yǎng)合成的GABA 產(chǎn)量更高，發(fā)酵時(shí)間更短[59]。釀酒酵母菌與植物乳桿菌共培養(yǎng)發(fā)酵桑椹飲料，合成了更高產(chǎn)量的GABA[60]?；卺劸平湍概c大腸桿菌共培養(yǎng)生產(chǎn)羥基酪醇的思路[61]，利用谷氨酸棒狀桿菌與大腸桿菌共培養(yǎng)，前者為后者提供底物谷氨酸，后者催化谷氨酸合成GABA 或許會(huì)成為可能。目前，共培養(yǎng)策略生產(chǎn)GABA 還僅僅應(yīng)用在一些功能性飲品中，直接用于GABA 高產(chǎn)量合成的尚未報(bào)道。

3 總結(jié)與展望

GABA 作為一種具有多種生理活性的物質(zhì)，被廣泛用于開發(fā)以健康為導(dǎo)向的產(chǎn)品，而化學(xué)合成易產(chǎn)生有毒副產(chǎn)物，植物富集效率低，難以滿足日漸增長(zhǎng)的市場(chǎng)需求，生物合成因綠色環(huán)保且具有較高的生物轉(zhuǎn)化率而備受關(guān)注，但目前生物合成GABA 仍然存在一系列瓶頸問題，很大程度上制約了GABA 產(chǎn)量的進(jìn)一步提高。本文系統(tǒng)總結(jié)了目前報(bào)道的提高GABA 生物合成產(chǎn)量的策略，主要包括：通過酶的定向改造解決限速酶與菌株最適生長(zhǎng)環(huán)境（溫度或pH 值）不兼容的問題，利用生物信息學(xué)進(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)功能化設(shè)計(jì)；通過構(gòu)建回補(bǔ)途徑以廉價(jià)的磷酸吡哆醇替代磷酸吡哆醛作為底物生成輔酶因子，利用代謝途徑改造能夠有效提高底物利用率和目標(biāo)物產(chǎn)量，多菌株共培養(yǎng)分擔(dān)代謝壓力等。另外，選用安全高效底盤菌株如乳酸菌、谷氨酸棒狀桿菌能夠提高合成GABA 的安全性，使其直接應(yīng)用于食品醫(yī)藥領(lǐng)域。在提高底物利用率的基礎(chǔ)上，擴(kuò)大底物選擇范圍，選擇便宜易得的底物，如大豆水解液、玉米芯水解液等也是合成GABA 且降低生產(chǎn)成本的有效策略。