桑黃裂蹄針層孔菌提取物生物活性成分及功能特性分析

閆帥帥，郭辛茹，徐建國(guó)，晉程妮

（山西師范大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，山西 太原 030000）

隨著我國(guó)人口老齡化的加劇以及人民生活水平的日益提高，慢性疾病已成為影響國(guó)民經(jīng)濟(jì)和社會(huì)發(fā)展的重大公共衛(wèi)生問題之一。研究表明，藥食用真菌富含維生素、微量元素、三萜、酚類和多糖等營(yíng)養(yǎng)或功能成分[1]，對(duì)常見的慢性疾病（糖尿病、炎癥、消化系統(tǒng)疾病、惡性腫瘤和心血管等疾病）具有積極的治療作用[2]。因此，在慢性疾病高發(fā)和飲食營(yíng)養(yǎng)攝取不均衡的環(huán)境下，藥食用菌化學(xué)和生理功能研究受到產(chǎn)學(xué)界的廣泛關(guān)注。

桑黃裂蹄針層孔菌（Phellinuslinteus）隸屬多孔菌目銹革孔菌科針層孔菌屬的一種藥用真菌。主要生長(zhǎng)于闊葉樹的樹干及枯立木上，其子實(shí)體多年生，呈扁半球形至馬蹄形或不規(guī)則形，黑色至深黑色，有明顯龜裂，菌肉硬木質(zhì)。桑黃裂蹄針層孔菌作為一種常用的木層孔菌，其多糖、蛋白聚糖、吡喃酮、多酚、甾醇等生物活性化合物在體內(nèi)外具有潛在的藥理學(xué)活性[3-4]，具有抗氧化、調(diào)節(jié)免疫、改善腸道、抗癌、抑制血糖等作用[5-6]。張嬙[7]研究發(fā)現(xiàn)木蹄層孔菌胞外多糖可以增加缺氧小鼠體內(nèi)血細(xì)胞數(shù)量、顯著降低高脂小鼠肝組織過氧化、減少傷口感染；其分子修飾后衍生物可以抑制人食管癌細(xì)胞的增殖、延長(zhǎng)相關(guān)癌變細(xì)胞的生長(zhǎng)周期。Liu 等[8]研究表明桑黃裂蹄針層孔菌提取物可以在糖尿病大鼠模型中降低血糖水平、增強(qiáng)胰島素抵抗和糖原儲(chǔ)存，促進(jìn)肝臟中關(guān)鍵酶β-氧化酶的表達(dá)，減少糖尿病相關(guān)的肝和腎損傷。但絕大多數(shù)已發(fā)表的關(guān)于桑黃裂蹄針層孔菌的研究，多集中在多糖的提取、分離和純化技術(shù)、結(jié)構(gòu)特征、藥理活性和潛在的機(jī)制探索等方面，對(duì)于其他活性成分的功效研究較少。因此，本研究測(cè)定桑黃裂蹄針層孔菌不同極性溶劑提取物的總酚、麥角甾醇含量，分析具有抗氧化作用的潛在多酚物質(zhì)，比較抗氧化和α-葡萄糖苷酶抑制活性，并對(duì)其可能的機(jī)制進(jìn)行討論，以期為該菌資源開發(fā)及綜合利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桑黃裂蹄針層孔菌，采自吉林敦化市，經(jīng)60 ℃干燥至恒重，將樣品粉碎過篩（40 目），置于室溫，密封保存，備用。

福林酚試劑、沒食子酸、抗壞血酸、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿、石油醚：山西博匯垣科貿(mào)有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2，2'-聯(lián)氨-雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺鹽[2，2'-azinobis-（3-ethylbenzothiazoline）-6-sulfonic acid，ABTS]、2，4，6-三吡啶基三嗪（2，4，6-three pyridyl three triazine，TPTZ）、麥角甾醇、原兒茶酸、表兒茶素、咖啡酸、槲皮素、肉桂酸、山奈酚、水楊酸：上海源葉生物科技有限公司；4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷（p-nitrophenyl-alpha-d-glucoside，pNPG）、α-葡萄糖苷酶（20 U/mg）、阿卡波糖、甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）：美國(guó)Sigma 公司；除特殊標(biāo)記外，其他均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀（UltiMateTM3000）、酶標(biāo)儀（Thermo Multiskan FC）：美國(guó)Thermo Fisher 公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（Model R-3）：瑞士BUCHI Labortechnik 公司；低速臺(tái)式離心機(jī)（TDL-60C 型）：上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 桑黃裂蹄針層孔菌提取物制備

準(zhǔn)確稱取10 g 桑黃裂蹄針層孔菌粉末6 份，分別置于6 個(gè)錐形瓶中，按1∶10（g/mL）料液比分別加入蒸餾水、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿、石油醚提取溶劑，于30 ℃、100 W 超聲功率下提取2 h，5 000 r/min 離心10 min 后，收集上清液；殘?jiān)捎猛瑯拥姆椒ㄔ僦貜?fù)提取、離心2 次，合并3 次上清液，將獲得的不同溶劑提取物進(jìn)行濃縮定容至25 mL，得到的不同溶劑提取物樣液放于4 ℃冰箱儲(chǔ)存。

1.3.2 總酚含量的測(cè)定

根據(jù)Aboagye 等[9]的方法并稍作修改。取0.1 mL不同溶劑提取的樣品溶液，加入0.1 mL 福林酚試劑和2.8 mL 蒸餾水，搖勻，室溫避光靜置8 min，再加入2 mL 7.5%的Na2CO3溶液，搖勻，室溫避光靜置1 h，于765 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。用沒食子酸測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程：y=0.001 6x-0.144 1（R2=0.994）?？偡雍勘硎緸槊靠松｜S裂蹄針層孔菌干樣中沒食子酸當(dāng)量的毫克數(shù)（mg GAE/g DW）。

1.3.3 多酚成分高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）分析

通過高效液相色譜儀對(duì)桑黃裂蹄針層孔菌不同溶劑提取物中多酚成分進(jìn)行分析，檢測(cè)條件如表1所示。

表1 HPLC 分析多酚成分檢測(cè)條件Table 1 Determination conditions of polyphenol components by HPLC

1.3.4 HPLC 法測(cè)定麥角甾醇的含量

根據(jù)杜嬌[10]的方法并稍作修改。色譜柱：島津Inertsil C18 柱（250 mm×4.6 mm×5 μm）。用0.22 μm 濾膜過濾不同溶劑提取物溶液。0.1%甲酸水溶液（A）和甲醇（B）為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫：0～10 min，30%～80%B；10～30 min，80%～100%B。流速為1.0 mL/min，柱溫30 ℃，波長(zhǎng)為283 nm，進(jìn)樣量20 μL，麥角甾醇保留時(shí)間約為17.1 min。

1.3.5 抗氧化活性測(cè)定

1.3.5.1 DPPH 自由基清除能力

根據(jù)Yu 等[11]的方法并稍作修改。將不同溶劑提取物稀釋成不同的濃度梯度，各取0.5 mL 加入到2 mL的DPPH 溶液中，搖勻，室溫下避光反應(yīng)30 min，于517 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度，每組重復(fù)3 次。DPPH 自由基清除率（Y1，%）計(jì)算公式如下。

式中：A0為對(duì)照組吸光度；A1為樣品吸光度；A2為樣品顏色空白吸光度。

1.3.5.2 ABTS+自由基清除能力

參照Yan 等[12]的方法并稍作修改。將不同溶劑提取物稀釋成不同濃度梯度的溶液，各取0.1 mL 加入到3.8 mL 的ABTS 溶液中，搖勻，室溫下避光6 min，于734 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。ABTS+自由基清除率（Y2，%）計(jì)算公式如下。

式中：A0為對(duì)照組吸光度；A1為樣品吸光度；A2為樣品顏色空白吸光度。

1.3.5.3 鐵還原能力（ferric reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP）的測(cè)定

參照Alkan 等[13]方法并稍作修改。不同溶劑提取物各取0.1 mL，加入3.1 mL 蒸餾水和1.8 mL 的TPTZ 工作液，37 ℃反應(yīng)30 min，于593 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定混合樣品溶液吸光度。使用10～100 μmol/L 濃度的FeSO4·7H2O測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程：y=2.317x+0.142（R2=0.999 4）。

1.3.6 α-葡萄糖苷酶活性抑制的測(cè)定

參照Yan 等[14]的方法并稍作修改。在96 孔板中加入80 μL 不同濃度的提取物樣品溶液和20 μL 0.2 U/mL α-葡萄糖苷酶溶液，并在37 ℃溫育5 min。隨后，加入100 μL 的4 mmol/L pNPG 溶液，37 ℃下反應(yīng)30 min，最后加入100 μL 的4 mmol/L Na2CO3終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀檢測(cè)在405 nm 處釋放出的對(duì)硝基苯酚量。α-葡萄糖苷酶活性的抑制率（Y3，%）計(jì)算公式如下。

式中：A0為對(duì)照組吸光度；A1為對(duì)照組空白吸光度；A2為樣品吸光度；A3為樣品顏色空白吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有試驗(yàn)結(jié)果重復(fù)3 次，用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示；使用SPSS 20 進(jìn)行顯著性分析（p＜0.05）；使用Origin 8.6進(jìn)行數(shù)據(jù)處理、作圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 多酚含量

采用福林酚法對(duì)桑黃裂蹄針層孔菌子實(shí)體不同溶劑提取物的多酚含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見圖1。

圖1 桑黃裂蹄針層孔菌不同溶劑提取物多酚含量的測(cè)定Fig.1 Polyphenol content of different solvent extracts of Phellinus linteus

由圖1 可知，乙醇提取物的多酚含量（3.03±0.27）mg GAE/g DW 顯著高于其他提取溶劑（p＜0.05）；不同溶劑提取物多酚含量由高到低的順序?yàn)橐掖迹颈舅疽宜嵋阴ィ韭确拢臼兔选Ｍ瑫r(shí)，桑黃裂蹄針層孔菌多酚含量隨有機(jī)提取溶劑極性增大而提高，有機(jī)提取溶劑極性越大，多酚含量越高，與徐蔓[15]的研究結(jié)果相一致，這可能與植物大多數(shù)功能成分為復(fù)雜的有機(jī)物以及相似相溶原理相關(guān)。

2.2 多酚成分分析

7 種多酚標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖見圖2。

圖2 7 種多酚標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖Fig.2 Chromatograms of seven standard substances

由圖2 可知，通過HPLC 分析，掌握7 種多酚類物質(zhì)（原兒茶酸、表兒茶素、咖啡酸、槲皮素、肉桂酸、山奈酚、水楊酸）對(duì)應(yīng)的保留時(shí)間、響應(yīng)值以及峰面積，以便于進(jìn)一步對(duì)桑黃裂蹄針層孔菌多酚成分進(jìn)行分析。

6 種不同溶劑桑黃裂蹄針層孔菌提取物多酚成分定量分析見表2。

表2 桑黃裂蹄針層孔菌不同溶劑提取物多酚成分分析Table 2 Analysis of polyphenol components in different solvent extracts of Phellinus linteus

由表2 可知，6 種提取溶劑均有較高的表兒茶素、槲皮素和山奈酚含量，肉桂酸含量最少。原兒茶酸、表兒茶素、槲皮素和肉桂酸在水提取物中含量最高，分別為（29.02±0.11）、（202.34±1.08）、（143.99±0.31）、（0.77±0.01）μg/g；咖啡酸和山奈酚在乙醇提取物中含量最高，分別為（5.06±0.02）μg/g 和（111.68±0.65）μg/g。相較于鄭娜[16]的研究結(jié)果，本研究不僅高于5 種桑黃子實(shí)體的60%乙醇提取物中咖啡酸的含量，也高于低共熔溶劑對(duì)裂蹄針層孔菌菌絲體和子實(shí)體提取物中咖啡酸的含量；但肉桂酸的含量相對(duì)較低，這可能與裂蹄針層孔菌子實(shí)體的年份、儲(chǔ)藏環(huán)境等相關(guān)。

2.3 麥角甾醇含量

麥角甾醇作為藥食用真菌中最具代表性的甾醇類小分子物質(zhì)，具有顯著的生理活性功能，采用HPLC對(duì)桑黃裂蹄針層孔菌子實(shí)體不同溶劑提取物的麥角甾醇含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見圖3。

圖3 桑黃裂蹄針層孔菌不同溶劑提取物麥角甾醇含量的測(cè)定Fig.3 Ergosterol content of different solvent extracts of Phellinus linteus

由圖3 可知，不同溶劑提取物的麥角甾醇含量由高到低的順序?yàn)橐掖迹颈疽宜嵋阴ィ韭确拢舅臼兔?。其中乙醇提取物中麥角甾醇含量最高，且丙酮、乙酸乙酯提取物中麥角甾醇含量與乙醇提取物中麥角甾醇含量差異不顯著（p＞0.05），與李潔莉等[17]研究結(jié)果相近，醇提取物麥角甾醇含量顯著高于水提取物。王曉琴等[18]對(duì)12 種真菌及其產(chǎn)品的麥角甾醇含量進(jìn)行了分析，其中紫芝子實(shí)體、樺褐、茯苓麥角甾醇的含量在0.17～0.46 mg/g；段雨晴等[19]對(duì)23 批樺褐孔菌中麥角甾醇進(jìn)行定量分析，平均含量為0.31 mg/g，均低于裂蹄針層孔菌乙醇、丙酮和乙酸乙酯提取物的麥角甾醇含量。

2.4 抗氧化活性、α-葡萄糖苷酶抑制活性

桑黃裂蹄針層孔菌子實(shí)體不同溶劑提取物對(duì)DPPH 自由基、ABTS+自由基清除能力和鐵還原能力、α-葡萄糖苷酶抑制活性的測(cè)定結(jié)果見表3。

表3 桑黃裂蹄針層孔菌提取物的抗氧化活性及α-葡萄糖苷酶抑制活性Table 3 Antioxidant activity and α-glucosidase inhibitory activity from different extracts of Phellinus linteus

由表3 可知，水具有最強(qiáng)的DPPH 自由基清除能力，乙醇、丙酮的DPPH 自由基清除能力與水的DPPH自由基清除能力相當(dāng)，且顯著高于其他溶劑提取物及抗壞血酸，其IC50值分別為（20.92±0.79）、（23.37±0.83）、（21.87±0.55）μg/mL；不同溶劑提取物對(duì)DPPH 自由基清除能力由高到低的順序?yàn)樗颈疽掖迹疽宜嵋阴ィ韭确?，石油醚沒有DPPH 自由基清除能力。乙醇提取物有最強(qiáng)的ABTS+自由基清除能力，IC50為（78.42±1.28）μg/mL，且強(qiáng)于抗壞血酸；不同溶劑提取物對(duì)ABTS+自由基清除能力由高到低的順序?yàn)橐掖迹颈舅疽宜嵋阴ィ韭确?，石油醚沒有ABTS+自由基清除能力，且桑黃裂蹄針層孔菌不同溶劑提取物對(duì)ABTS+自由基清除能力均弱于DPPH 自由基清除能力。乙醇提取物有最高的鐵還原能力，F(xiàn)RAP 值為（50.05±1.90）mmol/g，除氯仿和石油醚提取物外，均顯著高于抗壞血酸；不同溶劑提取物鐵還原能力由高到低的順序?yàn)橐掖迹颈舅疽宜嵋阴ィ韭确拢臼兔选２⑶褼PPH 自由基、ABTS+自由基清除能力和鐵還原能力與有機(jī)提取溶劑的極性呈正相關(guān)。

已有較多關(guān)于層孔屬真菌的提取物的抗氧化能力研究。曹春蕾等[20]研究發(fā)現(xiàn)3 種木層孔菌子實(shí)體乙酸乙酯提取物對(duì)DPPH 自由基清除能力均大于氯仿提取物。楊建等[21]研究發(fā)現(xiàn)5 種野生多孔菌的乙醇提取物均比乙酸乙酯提取物有更強(qiáng)的DPPH 和ABTS+自由基清除能力，且ABTS+自由基清除能力均弱于DPPH，這與本文結(jié)果一致；同時(shí)本文桑黃裂蹄針層孔菌乙醇提取物在DPPH 和ABTS+自由基清除方面，有更小的IC50值，因此有更強(qiáng)的抗氧化能力。紅緣擬層孔菌不同濃度乙醇溶液提取物[22]、桑黃低共熔溶劑提取物[23]、火木層孔菌和裂蹄針層孔菌的水提物及醇提物[24]的DPPH 和ABTS+自由基清除能力，均弱于本研究不同溶劑桑黃裂蹄針層孔菌提取物的抗氧化能力。

由表3 可知，不同溶劑提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶活性抑制能力由高到低依次為丙酮＞乙醇＞乙酸乙酯＞水＞氯仿，石油醚沒有α-葡萄糖苷酶活性抑制能力，可以看出，α-葡萄糖苷酶活性抑制能力與有機(jī)提取溶劑的極性呈正相關(guān)，且均強(qiáng)于阿卡波糖。本研究乙醇和丙酮的桑黃裂蹄針層孔菌提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶活性抑制的IC50分別為（13.95±0.79）μg/mL 和（9.87±0.33）μg/mL，高于前人研究中桑黃子實(shí)體的氯仿、乙酸乙酯、水提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶活性抑制能力（IC50分別為0.12、0.07、0.07 mg/mL）[25]。與本文結(jié)果相似的是，F(xiàn)eng 等[26]研究表明裂蹄針層孔菌提取物通過改變肝臟磷脂代謝和調(diào)控胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)改善胰島素抵抗，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)高脂飲食小鼠的血糖控制；Oh 等[27]揭示裂蹄針層孔菌提取物是通過潛在的40 個(gè)化合物和48 個(gè)基因?qū)崿F(xiàn)對(duì)2 型糖尿病的改善。因此，裂蹄針層孔菌不僅能夠抑制α-葡萄糖苷酶活性，還能實(shí)現(xiàn)對(duì)胰島素的有效調(diào)控，對(duì)改善血糖具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

2.5 相關(guān)性分析

通過熱圖對(duì)不同溶劑提取物多酚、麥角甾醇含量與抗氧化、α-葡萄糖苷酶抑制活性進(jìn)行相關(guān)性分析。熱圖見圖4。

圖4 不同溶劑提取物多酚和麥角甾醇含量與抗氧化和α-葡萄糖苷酶抑制活性的相關(guān)性分析Fig.4 Correlation between polyphenol and ergosterol contents in different solvent extracts and antioxidant and α-glucosidase inhibitory activity

由圖4 可知，桑黃裂蹄針層孔菌不同溶劑提取物的多酚含量與ABTS+自由基清除能力、FRAP 和α-葡萄糖苷酶抑制活性間呈顯著相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為-0.822、0.995 和-0.920；DPPH 自由基清除能力與ABTS+自由基清除能力呈極顯著相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.951，因此桑黃裂蹄針層孔菌具有顯著的抗氧化活性可能與其多酚類物質(zhì)有關(guān)。此外，酚酸作為酚類物質(zhì)最豐富的活性成分之一，可能具有潛在的抗氧化活性，在6 種提取溶劑中表兒茶素含量較為豐富，與DPPH 自由基清除能力、ABTS+自由基清除能力之間的相關(guān)系數(shù)分別為-0.740 和-0.715，且與咖啡酸具有極顯著相關(guān)性，而咖啡酸與原兒茶酸具有極顯著相關(guān)性，原兒茶酸與槲皮素、肉桂酸之間呈顯著相關(guān)性，可能是這些酚酸類物質(zhì)協(xié)同作用[28]，使得不同溶劑桑黃裂蹄針層孔菌中多酚與抗氧化和α-葡萄糖苷酶抑制活性有關(guān)。

3 結(jié)論

以桑黃裂蹄針層孔菌為研究對(duì)象，采用6 種不同溶劑對(duì)其有效成分進(jìn)行提取，結(jié)果表明乙醇提取物有最高的多酚和麥角甾醇含量，這可能與萃取體系的極性相關(guān)。植物多酚作為天然的抗氧化劑，通過清除機(jī)體內(nèi)部有害自由基從而達(dá)到預(yù)防疾病的效果。具有最高多酚含量的乙醇提取物表現(xiàn)出顯著的抗氧化活性和α-葡萄糖苷酶抑制活性作用；相關(guān)性結(jié)果表明，不同溶劑桑黃裂蹄針層孔菌提取物多酚含量與Fe3+還原能力有極顯著相關(guān)性、與ABTS+自由基清除率和α-葡萄糖苷酶抑制活性有顯著相關(guān)性；綜上，桑黃裂蹄針層孔菌多酚類物質(zhì)具有潛在的生物活性功能。

相關(guān)性分析進(jìn)一步表明，表兒茶素與咖啡酸具有極顯著相關(guān)性，原兒茶酸與咖啡酸、槲皮素具有極顯著相關(guān)性，而多酚顯示出抗氧化活性和α-葡萄糖苷酶抑制活性，因此不同溶劑提取物的功能活性可能與多種活性成分協(xié)同作用相關(guān)。本研究為全面了解桑黃裂蹄針層孔菌的活性成分和功效提供了有力的依據(jù)，對(duì)豐富和開發(fā)其藥用產(chǎn)品具有重要意義。然而，對(duì)抗氧化和α-葡萄糖苷酶活性抑制起作用的具體物質(zhì)，還需進(jìn)一步研究。