超聲波對鱘魚皮酸溶性膠原蛋白提取及理化特性的影響

竇容容，趙春青，顏?zhàn)雍?，桑亞新，孫紀(jì)錄，亢春雨*

（1 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院 河北保定071001 2 保定開放大學(xué) 河北保定 071001）

膠原蛋白是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，約占總蛋白的30%[1]。目前，已從不同的動物組織中發(fā)現(xiàn)29 種類型的膠原蛋白，且每種膠原蛋白都有其獨(dú)特的氨基酸序列、結(jié)構(gòu)和功能[2]。其中，I 型膠原蛋白具有穩(wěn)定的三螺旋結(jié)構(gòu)，高度的生物相容性和良好的生物降解性，在制藥、組織工程、保健品、化妝品等行業(yè)具有廣泛的應(yīng)用潛力[3]。大部分膠原蛋白主要來自牛、豬等陸生動物的皮膚和骨骼。然而，隨著牛海綿狀腦病、傳染性海綿狀腦病和口蹄疫等烈性傳染病在世界各地的相繼爆發(fā)，來源于陸生動物的膠原蛋白因可能引發(fā)人畜交叉感染這一涉及人類自身安全的敏感問題而引起科學(xué)界的普遍關(guān)注。來源于陸生動物組織的膠原蛋白的應(yīng)用受到很大限制。尋找更安全、經(jīng)濟(jì)的膠原蛋白來源成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)，科學(xué)界逐漸將研究目標(biāo)聚焦于水生生物。許多學(xué)者研究了魚類中提取的膠原蛋白，與陸生動物膠原蛋白相比，魚類膠原蛋白更安全、更容易被接受，因此人們研究魚類膠原蛋白的興趣日益增加[4-5]。

鱘魚隸屬于硬骨魚綱、輻鰭亞綱、軟骨硬鱗總目、鱘形目，是現(xiàn)存起源最早的脊椎動物之一。我國是世界上鱘魚產(chǎn)量最大的國家，2020 年我國鱘魚養(yǎng)殖產(chǎn)量達(dá)到10.4 萬t，其中主要集中于西南及華東地區(qū)[6]。鱘魚皮質(zhì)量占鱘魚總質(zhì)量的5%～7%，鱘魚屬于硬鱗魚類，魚皮無法直接食用，據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國每年有700 t 以上的鱘魚皮因加工不當(dāng)而被丟棄，造成資源浪費(fèi)[7]。鱘魚皮中含有豐富的膠原蛋白，可以將其作為天然優(yōu)質(zhì)膠原蛋白的原料[8]，對其精深加工可提高鱘魚加工的綜合利用率和產(chǎn)品附加值。

酸提取法是常用的膠原蛋白提取方法之一，是利用低濃度的酸溶液來破壞膠原蛋白分子間的Schiff 鍵和離子鍵，從而使沒有交聯(lián)的膠原蛋白和含有醛胺類交聯(lián)鍵的膠原蛋白溶出，酸法提取對膠原蛋白的交聯(lián)鍵破壞程度小，不會破壞膠原蛋白的三螺旋結(jié)構(gòu)[9]。近年來，超聲波因具有高效、節(jié)能、環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于各種蛋白質(zhì)的制備，以提高蛋白質(zhì)的可得性、功能特性和理化特性[10]，Ali 等[11]研究了超聲波輔助酸法和酶法提取鯽魚魚皮中的膠原蛋白并探究其理化特性；Zou等[5]研究了超聲波輔助提取對甲魚裙邊膠原蛋白理化特性和功能特性的影響。

本研究以鱘魚皮為原料，采用兩種方法提取鱘魚皮膠原蛋白，對酸提法制備的膠原蛋白（Acid-soluble collagen，ASC）和超聲波輔助酸法制備的膠原蛋白（Ultrasonic-assisted acid-soluble collagen，UASC）的蛋白結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)進(jìn)行比較，探討超聲波輔助提取法對鱘魚皮膠原蛋白提取率及理化特性的影響，以期獲得安全、穩(wěn)定的鱘魚皮膠原蛋白。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮鱘魚，河北省保定市河北農(nóng)大科技市場；L-羥脯氨酸、乙酸、氯化鈉、無水乙酸鈉、氫氧化鈉、檸檬酸、正丙醇、異丙醇、硝酸銀、高氯酸（均為分析純級）、溴化鉀（色譜純級），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；SDS-PAGE 凝膠制備試劑盒，康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

超濾管，美國Millipore 公司；JY92-IIDN 超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；TGL-16MC 高速臺式冷凍離心機(jī)，長沙湘銳離心機(jī)有限公司；LGJ-12A 真空冷凍干燥機(jī)，北京四環(huán)起航科技有限公司；Scimitar2000 傅里葉變換紅外光譜儀，美國Agilent 公司；烏氏粘度計(jì)，上?；茖?shí)驗(yàn)器材有限公司；TESCAN MIRA4 掃描電子顯微鏡，泰思肯（中國）有限公司；日本理學(xué)X 射線衍射儀Ultima IV 系列，日本理學(xué)公司。

1.3 鱘魚皮預(yù)處理

將鱘魚皮切碎，5 mm×5 mm 左右，用0.1 mol/L氯化鈉溶液在4 ℃下浸泡除去魚皮的雜蛋白、脫色，用10%異丙醇溶液于4 ℃下浸泡過夜除去魚皮上的脂肪，浸泡結(jié)束后用蒸餾水充分洗滌，瀝干，置于-20 ℃冰柜里儲存?zhèn)溆肹12]。

1.4 鱘魚皮膠原蛋白的提取

1.4.1 乙酸提取鱘魚皮膠原蛋白 稱取2 g 預(yù)處理的鱘魚皮，用乙酸溶液浸泡，固液比為1 ∶10（g/mL），在20 ℃條件下攪拌提取24 h，4 ℃下離心20 min，轉(zhuǎn)速為10 000 r/min，取上清，將沉淀的魚皮繼續(xù)用相同濃度和體積的乙酸復(fù)提1 次，混合2次上清液，得到鱘魚皮ASC 粗提液。

1.4.2 超聲波輔助乙酸提取鱘魚皮膠原蛋白 稱取2 g 預(yù)處理好的鱘魚皮，用乙酸溶液浸泡，固液比為1∶10（g/mL），經(jīng)過之前探究超聲提取工藝的響應(yīng)面試驗(yàn)，得到最優(yōu)條件為超聲波功率491 W，處理11 min，探頭頻率20 kHz[12]，利用此條件對鱘魚皮和乙酸的混合物進(jìn)行超聲處理，控制超聲溫度在20 ℃以下，超聲處理結(jié)束后將樣品轉(zhuǎn)移到20℃條件下繼續(xù)進(jìn)行攪拌提取24 h，在4 ℃下離心20 min，轉(zhuǎn)速為10 000 r/min，取上清，將沉淀的魚皮用相同濃度和體積的乙酸復(fù)提1 次，混合2 次上清液，得到鱘魚皮UASC 粗提液。

1.5 鱘魚皮膠原蛋白的純化

分別向ASC 和UASC 粗提液中緩慢加入NaCl 至鹽濃度為2.5 mol/L，攪拌均勻，在4 ℃條件下靜止鹽析24 h，然后在溫度為4 ℃，轉(zhuǎn)速為10 000 r/min 條件下離心20 min，棄上清液，沉淀用0.5 mol/L 乙酸充分溶解，將不溶物繼續(xù)離心除去。將得到的溶液在透析袋中透析以除去Cl-，分別用0.1 mol/L 乙酸和去離子水進(jìn)行透析，透析過程每4 h 換1 次透析液，用硝酸銀檢驗(yàn)透析液中是否含有Cl-，無白色沉淀透析結(jié)束。將透析得到的溶液在室溫條件下用截留分子質(zhì)量為100 ku的超濾管超濾45 min，超濾過程中離心機(jī)轉(zhuǎn)速為6 000 r/min，超濾結(jié)束后收集超濾管中被截留的膠原蛋白溶液進(jìn)行真空冷凍干燥。

1.6 羥脯氨酸含量的測定

參考《肉與肉制品 羥脯氨酸含量測定》（GB/T 9696.23-2008）[13]中的方法，對ASC 和UASC 樣品中羥脯氨酸的含量進(jìn)行測定。

1.7 膠原蛋白提取率的測定

膠原蛋白的提取率按照式（1）計(jì)算：

式中，X——膠原蛋白提取率（%）；W——羥脯氨酸含量（g）；11.1——羥脯氨酸換算系數(shù)[14]；M——鱘魚皮中蛋白質(zhì)含量（g）。

1.8 SDS-PAGE

參照溫慧芳等[15]的方法，取2 mg 的凍干膠原蛋白用1 mL 蒸餾水充分溶解得到2 mg/mL 的膠原蛋白溶液，與上樣緩沖液以4∶1 的體積比混合均勻，在沸水浴中煮沸5 min 后，用冷凍離心機(jī)在轉(zhuǎn)速為10 000 r/min 下離心2 min 除去不溶物。樣品上樣量為10 μL，Maker 上樣量4 μL。采用5%的濃縮膠和8%的分離膠對膠原蛋白進(jìn)行電泳分離。采用直壓恒流電源，濃縮膠為80 V，分離膠為120 V。電泳結(jié)束后在恒溫水浴搖床上用染色液染色30 min，然后用脫色液脫色2 h，直至背景色透明為止，膠片在凝膠成像儀中成像。

1.9 紫外可見光譜

參考Huang 等[16]的方法，將凍干膠原蛋白用0.5 mol/L 的乙酸充分溶解，溶解后膠原蛋白溶液質(zhì)量濃度為1 mg/mL。以0.5 mol/L 乙酸為基線，在室溫下采用掃描儀進(jìn)行掃描，掃描波長為200～400 nm。

1.10 傅里葉變換紅外光譜

參考Noorzai 等[17]的方法，先將溴化鉀在110℃烘箱中烘24 h，將凍干的膠原蛋白與溴化鉀混合均勻研磨成粉末進(jìn)行壓片，然后放入樣品室掃描，以溴化鉀作為基線，掃描波數(shù)范圍為4 000～500 cm-1。

1.11 光譜曲線擬合

參考王立宇等[18]的方法，使用PeakFit v4.12軟件分別對ASC 和UASC 的酰胺I 帶進(jìn)行二階導(dǎo)數(shù)高斯曲線擬合分析，通過多次擬合來區(qū)分具有重疊最小殘差的不同波段。當(dāng)擬合的標(biāo)準(zhǔn)誤差最小時(shí)，確定各個(gè)峰與各個(gè)二級結(jié)構(gòu)之間的對應(yīng)關(guān)系，然后根據(jù)其積分面積最后得出膠原蛋白不同二級結(jié)構(gòu)的相對含量百分比。

1.12 黏度

參考Zhang 等[19]的方法根據(jù)黏度變化測量，并稍作修改。用0.5 mol/L 乙酸來溶解凍干的膠原蛋白，溶解后溶液中膠原蛋白的質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL。使用烏式粘度計(jì)測量不同溫度下的膠原蛋白溶液的分?jǐn)?shù)黏度，測量的溫度范圍為15～45℃，測量過程中每個(gè)溫度下保持10 min，每點(diǎn)測量3 次，取平均值。利用方程確定各溫度下的分?jǐn)?shù)黏度：

式中，t——膠原蛋白溶液的流出時(shí)間（s）；t0——乙酸溶液的流出時(shí)間（s）。

膠原蛋白的熱變性溫度（Td）取分?jǐn)?shù)黏度為0.5 時(shí)所對應(yīng)的溫度。

1.13 差示掃描量熱

將凍干的膠原蛋白放入坩堝中密封，以空坩堝為對照，升溫進(jìn)行測試。測試溫度范圍為20～250 ℃，升溫速度為5 ℃/min，得到鱘魚皮膠原蛋白的差示掃描量熱圖。

1.14 X 射線衍射

參考張建旭等[20]的方法，將凍干的膠原蛋白樣品黏附在樣品臺上，在電壓40 kV，電流40 mA的條件下，在Cu-Ku 靶（λ=0.154 nm）輻照下，在5°～50°（2θ）角范圍內(nèi)，掃描速度為5°/min 下進(jìn)行試驗(yàn)，得到鱘魚皮膠原蛋白的X 射線衍射圖。

1.15 掃描電子顯微鏡

參考張強(qiáng)等[21]的方法，將凍干的膠原蛋白樣品固定在載物臺上，鉑金靶材噴金處理，用掃描電子顯微鏡在加速電壓為10 keV 下，放大不同的倍數(shù)觀察ASC 和UASC 的微觀結(jié)構(gòu)。

1.16 數(shù)據(jù)處理與分析

所有試驗(yàn)重復(fù)3 次進(jìn)行，結(jié)果表示為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”，使用Microsoft Office Excel 2019進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，應(yīng)用Origin 2018 軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 鱘魚皮ASC 和UASC 的提取率比較

以鱘魚皮為原料，常規(guī)酸提法和超聲波輔助酸提法得到鱘魚皮中膠原蛋白的提取率分別為（7.330±0.42）%和（27.527±0.65）%（干重），相比于常規(guī)酸提取法，超聲波輔助提取膠原蛋白的提取率提高了20.197%，這是由于超聲波的空化作用產(chǎn)生了巨大的壓力，使細(xì)胞組織破壁，分離未交聯(lián)的膠原分子，強(qiáng)化了膠原蛋白的提取過程，從而提高了膠原蛋白提取率[22]。Ong 等[23]研究了超聲輔助下刺鰩皮中的膠原蛋白提取率，表明UASC（48.37%）和UPSC（56.65%）的膠原提取率均高于相應(yīng)未超聲輔助下ASC（20.48%）和PSC（34.84%）的提取率。李根等[24]研究了經(jīng)過超聲處理的鯢皮膠原蛋白的提取率（37.36%）明顯高于未經(jīng)超聲處理的鯢皮膠原蛋白的提取率（17.56%）。這些研究與本研究結(jié)果類似，均表明超聲波能有效提高水生生物膠原蛋白提取率。

2.2 鱘魚皮ASC 和UASC 的SDS-PAGE 結(jié)果分析

SDS-PAGE 圖譜能夠直觀地判斷出膠原蛋白的亞基組成和類型。圖1 為鱘魚皮膠原蛋白的SDS-PAGE 圖譜，從圖1 可以看出ASC 和UASC均由3 條鏈構(gòu)成，分別是2 條不同的α肽鏈（α1和α2）和1 條β 肽鏈（α 肽鏈的二聚體）。在α 肽鏈中顏色較深的是α1條帶，分子質(zhì)量約為125 ku，顏色較淺的為α2條帶，分子質(zhì)量在100～125 ku 范圍內(nèi)。典型的I 型膠原蛋白由2 條α1鏈和1 條α2鏈組成的三聚體結(jié)構(gòu)，而圖1 中的電泳圖基本符合I型膠原蛋白的肽鏈特征，表明鱘魚皮中提取的ASC 和UASC 為I 型膠原蛋白，這一結(jié)果與楊玲等[25]的研究一致。由圖1 可以看出，ASC 和UASC凝膠電泳圖譜沒有明顯差別，表明超聲波對膠原蛋白的三螺旋結(jié)構(gòu)沒有造成破壞和損傷。

圖1 鱘魚皮膠原蛋白SDS-PAGE 圖譜Fig.1 SDS-PAGE patterns of sturgeon skin collagen

2.3 鱘魚皮ASC 和UASC 的紫外可見光譜分析

膠原蛋白的多肽鏈存在C=O、-COOH 和-CO-NH-官能團(tuán)，使其在約230 nm 波長處有1個(gè)顯著的吸收峰[26]。根據(jù)膠原蛋白的紫外吸收光譜圖，不僅可以判斷出膠原蛋白中是否有酪氨酸和色氨酸等帶有共軛π 鍵生色團(tuán)的氨基酸的存在，還可以判斷多肽鏈中非螺旋端肽的完整性[27]。圖2 為鱘魚皮膠原蛋白的紫外可見光譜圖，由圖可知ASC 和UASC 均在235 nm 波長處有較為明顯的吸收峰，與Li[28]研究的海參（236.5 nm）、羅非魚皮（235.5 nm）、豬皮（235 nm）中提取的膠原蛋白的最大吸收峰相近，與程波等[29]研究的鱘魚皮膠原蛋白的吸收峰波長一致，符合I 型膠原蛋白的紫外吸收特征。本研究中的ASC 和UASC 樣品在280 nm 波長附近沒有明顯的吸收峰，表明提取的產(chǎn)物中具有共軛π 鍵生色團(tuán)的芳香族氨基酸的含量極低，這一結(jié)果符合I 型膠原蛋白氨基酸組成特征。以上結(jié)果再次證明了鱘魚皮中提取的ASC和UASC 均屬于I 型膠原蛋白。

圖2 鱘魚皮膠原蛋白的紫外吸收光譜圖Fig.2 Ultraviolet absorption spectra of collagen from sturgeon skin

2.4 鱘魚皮ASC 和UASC 的傅里葉變換紅外光譜分析

傅里葉變換紅外光譜廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的分析，可以根據(jù)樣品的紅外吸收峰的位置推斷出樣品中存在的特征基團(tuán)，從而確定其化學(xué)結(jié)構(gòu)[30]。圖3 為鱘魚皮ASC 和UASC 的紅外吸收光譜圖，鱘魚皮膠原蛋白因其具有獨(dú)特的三螺旋結(jié)構(gòu)和膠原蛋白分子上的氨基和亞氨基結(jié)構(gòu)，使其傅里葉變換紅外光譜圖主要表現(xiàn)為5 個(gè)特征吸收峰。酰胺A 帶屬于N-H 伸縮振動，波數(shù)在3 400～3 440 cm-1范圍內(nèi)，由圖3 可知，ASC 和UASC 的酰胺A 帶的吸收峰分別為3 306 cm-1和3 308 cm-1，低于波數(shù)范圍，這是由于膠原蛋白的N-H 基團(tuán)與C=O 形成了氫鍵，導(dǎo)致酰胺A 帶向低頻移動[31]。酰胺B 帶代表CH2的不對稱伸縮振動[32]，它的吸收峰波數(shù)在2 877～3 084 cm-1范圍內(nèi)，圖3 中ASC和UASC 酰胺B 帶的吸收峰分別為2 938 cm-1和2 936 cm-1。酰胺Ⅰ帶代表C=O 伸縮振動，其波數(shù)范圍為1 600～1 700 cm-1，ASC 和UASC 的酰胺I帶吸收峰均為1 653 cm-1。酰胺Ⅱ帶歸屬于C-N伸縮振動和N-H 彎曲振動，波數(shù)在1550～1 600 cm-1范圍內(nèi)，當(dāng)膠原蛋白肽鏈中含有氫鍵時(shí)，酰胺II 帶波數(shù)會向低頻移動[33]，ASC 和UASC 的酰胺II帶的波數(shù)均為1 541 cm-1，低于波數(shù)范圍，再次證明了肽鏈中含有氫鍵。酰胺Ⅲ帶歸屬為N-H 彎曲振動，波數(shù)范圍為1200～1300cm-1[34]，ASC 和UASC的酰胺III 帶吸收峰分別為1 242 cm-1和1 240 cm-1，當(dāng)酰胺III 帶的吸收強(qiáng)度和1 450 cm-1的吸收強(qiáng)度的比值接近1 時(shí)，證明膠原蛋白三螺旋結(jié)構(gòu)保存完整[35]。本研究得到鱘魚皮ASC 和UASC 的酰胺Ⅲ帶和1450 cm-1的吸收強(qiáng)度比分別約為1.06 和1.10。以上特征吸收峰的分析結(jié)果表明，ASC 和UASC 的二級結(jié)構(gòu)相似，ASC 和UASC 都較好的保留了膠原蛋白的三螺旋結(jié)構(gòu)。

2.5 鱘魚皮ASC 和UASC 的光譜曲線擬合分析

在紅外光譜中，二階導(dǎo)數(shù)紅外光譜不僅可以提高表觀分辨率，還可以分離重疊峰和肩峰。蛋白質(zhì)紅外光譜的酰胺I 帶具有豐富的二級結(jié)構(gòu)信息[36]，因此本研究對鱘魚皮膠原蛋白的酰胺I 帶采用二階導(dǎo)數(shù)和高斯擬合分析。圖4 為ASC 和UASC 根據(jù)導(dǎo)數(shù)光譜得到酰胺I 區(qū)的6 個(gè)主要波段，并計(jì)算了二級結(jié)構(gòu)成分的百分比，包括α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲[37]。α-螺旋具有更緊密的結(jié)構(gòu)和更大的穩(wěn)定性，波數(shù)在1 650～1 660 cm-1范圍內(nèi)[38]。β-折疊波數(shù)范圍為1 600～1 640 cm-1，β-折疊具有較少的分子間氫鍵，因此導(dǎo)致二級結(jié)構(gòu)不如α-螺旋穩(wěn)定。β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲波數(shù)分別在1 660～1 700 cm-1和1 640～1 650 cm-1范圍內(nèi)。計(jì)算ASC 和UASC 中二級結(jié)構(gòu)組成所占的含量結(jié)果如圖5 所示，由圖5 可知UASC的α-螺旋含量略高于ASC，UASC 中β-折疊含量略低于ASC，兩者的β-轉(zhuǎn)角含量相近，說明超聲波輔助提取使鱘魚皮膠原蛋白二級結(jié)構(gòu)中的β-折疊轉(zhuǎn)換成了α-螺旋，證明UASC 的二級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性高于ASC。二級結(jié)構(gòu)成分占比的結(jié)果表明超聲波輔助提取的膠原蛋白使膠原蛋白二級結(jié)構(gòu)連接更為穩(wěn)定。

圖4 鱘魚皮ASC（a）和UASC（b）酰胺I 帶擬合光譜分析Fig.4 Fitting spectral analysis of collagen amide I bands in sturgeon skin

圖5 鱘魚皮膠原蛋白的二級結(jié)構(gòu)組成Fig.5 Secondary structural composition of sturgeon skin collagen

2.6 鱘魚皮ASC 和UASC 的黏度分析

在不同條件下膠原蛋白的溶解度、黏度等物理特性會發(fā)生變化，常以膠原蛋白的黏度來確定其變性溫度（Td）[39]。在黏度曲線中，黏度值下降到最大值一半的溫度稱為熱變性溫度。圖6 為兩種提取方法得到的膠原蛋白在不同溫度處理下的黏度曲線，隨著溫度升高，兩種方法得到的膠原蛋白的黏度曲線均呈急劇下降的趨勢，黏度的降低可能與膠原蛋白的變性和三螺旋結(jié)構(gòu)的改變有關(guān)[40]。由圖6 可知，乙酸提取的膠原蛋白的熱變性溫度為29.57 ℃，超聲波輔助乙酸提取的膠原蛋白的熱變形溫度為30.21 ℃。不同的物種中提取的膠原蛋白的熱變性溫度不同，從淡水魚魚皮中提取的膠原蛋白的熱穩(wěn)定性通常會比從海洋魚類魚皮中提取的膠原蛋白的熱穩(wěn)定性要高，例如Sun 等[3]研究的從大西洋鱈魚皮中提取的膠原蛋白的熱變性溫度為14.5 ℃，低于鱘魚皮膠原蛋白的熱變性溫度。由圖6 可知，UASC 的熱變性溫度稍高于ASC 的熱變性溫度，說明超聲波輔助酸提取鱘魚皮膠原蛋白增加了膠原蛋白的熱穩(wěn)定性。該結(jié)果與鄒燁等[41]的研究結(jié)果一致，證明了經(jīng)過超聲波輔助酸法提取的鱘魚皮膠原蛋白的結(jié)構(gòu)更為穩(wěn)定。

圖6 鱘魚皮膠原蛋白的黏度變化曲線Fig.6 Viscosity variation curve of sturgeon skin collagen

2.7 鱘魚皮ASC 和UASC 的差示掃描量熱分析

圖7 為兩種提取方法得到的膠原蛋白的差示掃描量熱圖，圖中顯示出在兩個(gè)溫度下的吸熱峰。乙酸提取的膠原蛋白的第1 個(gè)吸熱峰溫度為62.19 ℃，超聲波輔助乙酸提取的膠原蛋白的第1個(gè)吸熱峰的溫度為64.90 ℃，該峰所對應(yīng)的溫度為膠原蛋白的熱收縮溫度（Ts）。熱收縮溫度（Ts）是指膠原蛋白纖維因膠原蛋白失水而收縮，使其長度減少到原來長度的三分之一的溫度，熱收縮溫度表示膠原蛋白的三螺旋結(jié)構(gòu)和生物活性的保留情況[42]。膠原蛋白Ts值的大小與其三螺旋結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性成正相關(guān)。ASC 和UASC 的熱收縮溫度均高于Cui 等[43]研究的牛皮中的膠原蛋白（62 ℃）。圖7 中另一個(gè)吸熱峰分別在211.90 ℃和212.47 ℃，此峰與交聯(lián)膠原蛋白的結(jié)構(gòu)變化有關(guān)，該峰所對應(yīng)的溫度為膠原蛋白熔化溫度（Tm），是膠原蛋白變性速度最大時(shí)的溫度[37]。由圖7 可知，超聲波輔助提取使膠原蛋白的Ts和Tm升高，這是由于超聲空化作用打破了顆粒物質(zhì)的胞膜，與Shaik 等[44]研究結(jié)果一致，該結(jié)果進(jìn)一步證明了經(jīng)過超聲波輔助酸提取的膠原蛋白的結(jié)構(gòu)更加趨于穩(wěn)定。

圖7 鱘魚皮膠原蛋白的差示掃描量熱圖Fig.7 DSC of sturgeon skin collagen

2.8 鱘魚皮ASC 和UASC 的X 射線衍射結(jié)果分析

X 射線衍射可以對膠原蛋白的結(jié)構(gòu)變化的各個(gè)定量參數(shù)進(jìn)行測定，根據(jù)ASC 和UASC 的X 射線衍射圖來判斷的超聲波輔助提取對膠原蛋白結(jié)構(gòu)的影響。圖8 是兩種方法提取膠原蛋白的X 射線衍射圖，兩種樣品的X 射線衍射圖均含有2 個(gè)膠原蛋白的特征峰。圖8 中第1 個(gè)峰（用C 來表示）代表的是膠原蛋白分子鏈之間的距離，峰C 的衍射角（2θ）一般在5°～10°范圍內(nèi)，與膠原蛋白的三螺旋結(jié)構(gòu)有關(guān)；第2 個(gè)峰（用A 表示）代表的是膠原蛋白內(nèi)部非結(jié)晶部分含量所占整體的比例，峰A的衍射角（2θ）一般在20°附近[45]。根據(jù)布拉格方程2dsinθ=λ，計(jì)算出各個(gè)峰所對應(yīng)距離“d”值，在布拉格方程中λ，d 和θ 分別對應(yīng)的是X 射線波長（0.154 nm），原子晶格平面間距（nm）和布拉格衍射角（°）[46]。根據(jù)Scherrer 公式D=Kλ/βcosθ，可以得到膠原蛋白的晶粒度大小D 值，在Scherrer 公式中K 為常數(shù)（K=0.89）；λ 為X 射線波長（0.154 nm）；β 為衍射峰半高寬（需轉(zhuǎn)化為弧度）（rad）；θ 為X 射線衍射角（°）；D 為晶粒度大?。╪m）。D 值的大小與膠原蛋白的有序程度有一定的關(guān)系，D 值越大則膠原蛋白有序程度越高[47]。根據(jù)圖8 峰C 和峰A 所對應(yīng)的衍射角來計(jì)算各個(gè)峰所對應(yīng)的距離d 值和晶粒度大小D 值。計(jì)算得到ASC 和UASC 膠原蛋白鏈之間的距離均約為1.10 nm，與Chen 等[31]研究結(jié)果相似。計(jì)算得到UASC 在峰C 和峰A 的D 值均略高于ASC，說明UASC 的有序程度高于ASC，證明超聲波輔助酸提取膠原蛋白會增加膠原蛋白結(jié)構(gòu)的有序程度，提高膠原蛋白的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。

圖8 鱘魚皮膠原蛋白的X 射線衍射分析圖Fig.8 X-ray diffraction analysis of sturgeon skin collagen

2.9 鱘魚皮ASC 和UASC 的微觀結(jié)構(gòu)比較

膠原蛋白的微觀結(jié)構(gòu)，如孔隙度、纖維形狀和相互連接是生物材料評估的關(guān)鍵參數(shù)。圖9a1 和圖9b1 分別為肉眼觀察凍干后的鱘魚皮ASC 和UASC，兩者相似，均呈現(xiàn)白色的海綿狀。圖9a2 和圖9b2 分別是ASC 和UASC 放大200 倍得到的圖像，圖9a3 和圖9b3 分別是放大1 000 倍得到的圖像?？梢杂^察到ASC 和UASC 的微觀結(jié)構(gòu)呈規(guī)則的、多孔的纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，根據(jù)放大1 000 倍的圖像可以看出ASC 和UASC 表面結(jié)構(gòu)光滑。本研究與馬帥[48]研究的鰈魚魚皮膠原蛋白掃描電鏡圖大致相似，都呈多孔的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。根據(jù)以上分析表明，兩種方法提取的膠原蛋白微觀結(jié)構(gòu)無明顯差別，這表明超聲波輔助提取鱘魚皮膠原蛋白對膠原蛋白的微觀結(jié)構(gòu)沒有明顯影響，這種膠原蛋白均具有復(fù)雜多孔和纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，可以用作水合劑、傷口敷料、細(xì)胞增殖基質(zhì)或其它基本生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用[49]。

圖9 鱘魚皮膠原蛋白肉眼觀察圖（a1、b1）和掃描電鏡圖（a2、a3、b2、b3）Fig.9 Sturgeon skin collagen as viewed in naked eye（a1，b1）and SEM micrograph（a2，a3，b2，b3）

3 結(jié)論

超聲波輔助可以促進(jìn)乙酸對膠原蛋白的提取，常規(guī)酸提法和超聲波輔助酸提法得到的膠原蛋白的提取率分別為7.330%和27.527%。UASC和ASC 均屬于I 型膠原蛋白，同時(shí)兩者均保持完整的三螺旋結(jié)構(gòu)。與常規(guī)酸提法相比，超聲波輔助使膠原蛋白的結(jié)構(gòu)有序程度、二級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性以及熱穩(wěn)定性得到改善。兩種提取方法得到的鱘魚皮膠原蛋白的微觀結(jié)構(gòu)無明顯差別。本研究結(jié)果表明，超聲輔助可有效提高鱘魚皮膠原蛋白的提取率，對鱘魚膠原蛋白結(jié)構(gòu)無明顯破壞作用且能增強(qiáng)膠原蛋白的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，本研究結(jié)果為超聲輔助酸法應(yīng)用于鱘魚皮膠原蛋白提取提供了理論依據(jù)和實(shí)踐指導(dǎo)。