不同保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球菌S10 復(fù)配對發(fā)酵乳特性的影響

孫悅欣，史嘉琦，李 璟，劉俊霞，楊志輝，楊淑娟，白 梅，王記成，張和平

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 乳品生物技術(shù)與工程教育部重點實驗室 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部奶制品加工重點實驗室 呼和浩特 010018）

自然發(fā)酵乳可以作為保加利亞乳桿菌特定的載體[1]。在發(fā)酵乳制品生產(chǎn)中，保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）產(chǎn)生協(xié)同作用，是人體腸道內(nèi)重要的微生物，因其較高的經(jīng)濟價值而受到廣泛關(guān)注[2]。

大量研究探討了保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌在發(fā)酵乳中的應(yīng)用，二者協(xié)同共生的關(guān)系可賦予發(fā)酵乳高黏度、快速產(chǎn)酸、豐富的活性物質(zhì)等[3]。然而，有研究表明，只有一部分保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌菌株間存在共生關(guān)系，除此之外兩者間還可能具有拮抗作用[4]。由于保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌的生長特性和代謝特性存在差異，不同菌株的組合對發(fā)酵乳的影響很大，甚至影響貨架期穩(wěn)定性。此外，乳酸菌之間也存在個體差異，如何篩選、搭配出相互促進的優(yōu)良菌株組合仍有一定的難度。

保加利乳桿菌具有發(fā)酵時間短、后酸化弱、高產(chǎn)乙醛、雙乙酰和生產(chǎn)應(yīng)用穩(wěn)定等特性，可增加發(fā)酵乳生產(chǎn)過程中的黏度。本研究團隊從全基因組水平對保加利亞乳桿菌的遺傳多樣性和種群結(jié)構(gòu)進行深入的群體遺傳學(xué)研究，系統(tǒng)發(fā)育分析后將保加利亞乳桿菌劃分為4 個分支譜系[5]。基于其高度的遺傳多樣性和分離源差異，推測菌株的多樣性差異決定菌株具有不同的發(fā)酵表型。本研究采用的不同譜系的保加利亞乳桿菌IMAU20450 分離自蒙古國傳統(tǒng)發(fā)酵酸牦牛乳，IMAU6209 和IMAU62161 分離自中國西藏地區(qū)酸馬奶中，IMAU95110 分離自俄羅斯傳統(tǒng)發(fā)酵酸牛乳。嗜熱鏈球菌S10 分離自青海自然發(fā)酵酸牛乳中，具有產(chǎn)黏、產(chǎn)酸等優(yōu)良發(fā)酵特性[6]。研究發(fā)現(xiàn)，與牛乳相比，在嗜熱鏈球菌S10 發(fā)酵乳中鑒定出包括肽、氨基酸、脂肪酸及其相關(guān)代謝物和維生素等39 種重要的差異代謝物，其中發(fā)酵乳中月桂酸和維生素B2含量顯著高于牛奶[7]。此外，嗜熱鏈球菌S10 還可用作發(fā)酵豆乳的基礎(chǔ)發(fā)酵劑，不僅具有較好的感官、發(fā)酵特性、貯藏特性，還具有較高的活性大豆異黃酮轉(zhuǎn)化量，對調(diào)節(jié)女性體內(nèi)雌激素水平具有很好的效果[8]。

擴散波譜技術(shù)（Diffusing-wave spectroscopy，DWS）是一種基于傳統(tǒng)光散射的光學(xué)測量技術(shù)。其原理是樣品內(nèi)的隨機運動的粒子對入射光子的多重散射，先得到被散射光子的自相關(guān)函數(shù)（即擴散波光譜），后通過計算機模擬，得到粒子的均方位移（MSD）、顆粒平均粒徑及體系的流變參數(shù)[9]。在靜止?fàn)顟B(tài)下與傳統(tǒng)流變學(xué)相比，微流變學(xué)分析軟物質(zhì)的微觀結(jié)構(gòu)并不會破壞樣品的凝膠結(jié)構(gòu)，更不會對樣品的狀態(tài)產(chǎn)生影響[10]。對應(yīng)用于發(fā)酵乳發(fā)酵過程中形成乳凝膠的特性分析具有獨特優(yōu)勢。

本研究將4 株不同譜系的保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球菌S10 進行復(fù)配，以商業(yè)發(fā)酵劑為對照，分析發(fā)酵過程中微流變學(xué)特性，測定彈性因子（Elastic index，EI）、黏度因子（Viscosity index，VI）、固液平衡值（Solid liquid balance，SLB）及流動因子（Fluidity index，F(xiàn)I）隨發(fā)酵時間的變化情況，對鑒別、控制發(fā)酵食品的質(zhì)量具有重要的意義[11]。在貯藏期，通過稠度、硬度、內(nèi)聚性和黏度指數(shù)評價發(fā)酵乳的質(zhì)構(gòu)特性，并對各組發(fā)酵乳的發(fā)酵和貯藏特性進行綜合性評價。將具有優(yōu)良發(fā)酵特性的不同保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌菌株進行組合，可提升發(fā)酵劑的整體性能[12]。篩選具有優(yōu)良發(fā)酵性能的發(fā)酵劑組合，為生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)發(fā)酵乳提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

純牛乳（蛋白質(zhì)3.0 g/100 g，脂肪3.0 g/100 g），蒙牛乳業(yè)；蔗糖，廣西鳳糖生化股份有限公司；菌株：保加利亞乳桿菌IMAU20450、IMAU95110、IMAU62091、IMAU62161 和嗜熱鏈球菌S10 均來自內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點實驗室；商業(yè)發(fā)酵劑YF-L904（500U），科漢森公司。MRS 固體培養(yǎng)基、M17 固體培養(yǎng)基等試劑，青島海博生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

試驗所用儀器和設(shè)備信息見表1。

表1 主要儀器和設(shè)備信息Table 1 Information of the main instruments and equipment

1.3 試驗方法

1.3.1 發(fā)酵乳的制備 發(fā)酵乳各組接種量如表2所示。發(fā)酵乳制作流程：牛乳中加入6.5%的蔗糖，預(yù)熱至62 ℃，化料15 min，均質(zhì)（20 MPa），95 ℃，5 min 殺菌，水浴冷卻到42 ℃，接種發(fā)酵，pH 4.5 為發(fā)酵終點，水浴冷卻到20 ℃以下，無菌分裝。分裝前進行破乳處理，于4 ℃儲存21 d，25 ℃儲存14 d，分別于1，3，7，10，14，21 d 進行相關(guān)參數(shù)的測定，每組3 個平行樣。

表2 試驗各組發(fā)酵乳接種量信息（CFU/mL）Table 2 Inoculation volume of each experimental fermented milk（CFU/mL）

1.3.2 發(fā)酵乳的感官評價 根據(jù)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)發(fā)酵乳》（GB 19302-2010）[13]，選擇6 位品評員對5 組發(fā)酵乳進行感官評價。取適量樣品置于品嘗杯中，在室溫自然光下觀察發(fā)酵乳的色澤、組織狀態(tài)，聞其氣味，品嘗滋味。以酸奶的喜好程度進行排序。注意每次品嘗完用溫開水漱口，防止味道混淆。

1.3.3 發(fā)酵過程中微流變學(xué)特性分析 將接種后的20 mL 發(fā)酵乳轉(zhuǎn)移至滅菌的微流變儀器配套樣品瓶中，放入測定槽，提前將微流變儀溫度調(diào)節(jié)至42 ℃，檢測發(fā)酵過程中的MVI、EI、SLB 及FI 隨時間的變化情況。發(fā)酵過程中每5 min 進行1 次數(shù)據(jù)采集，此過程一直持續(xù)到發(fā)酵終點[14]。

1.3.4 pH 值的測定 采用雷磁pH SJ-3F 型pH計測定，每個樣品平行測3 次。

1.3.5 滴定酸度（TA）的測定[15]用電子天平準(zhǔn)確稱取10.0 g 發(fā)酵乳樣品放入錐形瓶中，加入20 mL 去CO2的蒸餾水，搖勻，加入1 mL 酚酞指示劑，再次搖勻，用0.1 mol/L NaOH 滴定標(biāo)準(zhǔn)溶液至微粉色且5 s 內(nèi)不消失即可。記錄消耗的標(biāo)準(zhǔn)NaOH 溶液的體積（mL），每個樣品平行測定3 次。

1.3.6 黏度的測定 將發(fā)酵乳樣品置于100 mL燒杯中，室溫下采用Brookfield DV-1 VISCOMETER 型黏度儀進行3 次平行樣測定，發(fā)酵乳選取4#轉(zhuǎn)子，轉(zhuǎn)速100 r/min，扭矩10%～100%，測定時間30 s。

1.3.7 持水性的測定 取20 g 酸奶置于配有濾膜漏斗的250 mL 錐形瓶中，2 h 后將析出液倒出，再次稱量樣品和容器的質(zhì)量，計算持水性。計算公式如下：

式中，m1——濾液質(zhì)量（g）；m2——樣品質(zhì)量（g）。

1.3.8 質(zhì)構(gòu)特性的分析 A.XT plus 質(zhì)構(gòu)儀選用A/BE 探頭。A/BE 探頭是一種反向擠壓裝置。在進行下壓試驗時，樣品從活塞的外緣被反向擠出，適用于本試驗軟凝膠類的黏性物質(zhì)測定[16]。試驗速度均固定到1 mm/s，穿透深度為30 mm?？蓹z測發(fā)酵乳在1，7，14，21 d 的硬度、稠度、內(nèi)聚性和黏度指數(shù)的變化情況。使用5 kg 的稱重傳感器進行單次壓縮循環(huán)試驗測量酸奶樣品[17]。需注意的是樣品在4 ℃取出后置室溫，然后檢測。

1.3.9 統(tǒng)計分析 微流變數(shù)據(jù)采用Rheolaser Master 型光學(xué)法微流變分析儀自帶的Smart 軟件進行數(shù)據(jù)分析。所有圖表均采用Orgin 9.1 繪制。試驗數(shù)據(jù)使用SPSS 25.0 軟件進行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 感官特性

評分細(xì)則見表3。將每組發(fā)酵乳樣品按隨機順序給6 位品評員品嘗，按照對5 組發(fā)酵乳的喜好程度進行排序，感官評價結(jié)果見表4。結(jié)果表明：對A、C 組的喜好程度明顯大于其它發(fā)酵組。品評員普遍認(rèn)為A、C 組發(fā)酵乳酸甜比恰當(dāng)，組織均勻，質(zhì)地細(xì)膩絲滑，品嘗時無顆粒感，具有發(fā)酵乳特有的風(fēng)味。

表3 感官評分表Table 3 Sensory score sheet

表4 感官評價結(jié)果Table 4 Sensory evaluation sheet

2.2 微流變學(xué)特性

在發(fā)酵過程中，各組發(fā)酵乳的凝膠化過程中微流變特性參數(shù)隨發(fā)酵時間的變化情況如圖1 所示。FI 值反映發(fā)酵乳中微觀粒子的運動速度。FI值越高，運動速度越快，顆粒越多，流動性越大[18]。EI 直接反映彈性模量，EI 值越大，樣品的凝膠結(jié)構(gòu)越強，樣品性質(zhì)越穩(wěn)定[19]。MVI 表示黏性模量，顯示發(fā)酵乳黏度的變化[20]，MVI 與黏性模量成正比。SLB 直接反映產(chǎn)品偏固態(tài)或液態(tài)時與時間對應(yīng)的函數(shù)關(guān)系，與黏彈性性能成正比，當(dāng)0.5〈SLB〈1 時，表現(xiàn)出黏性模量，樣品質(zhì)地偏向于液態(tài)[19]。研究表明，酪蛋白膠束是凝膠形成的主要驅(qū)動力[21]。

圖1 發(fā)酵乳在發(fā)酵過程中的彈性因子（a）、固液平衡值（b）、黏性因子（c）及流動因子（d）的變化Fig.1 The elastic index（a），solid liquid balance（b），macroscopic viscosity index（c），and fluidity index（d）of yogurt during the fermentation

發(fā)酵開始至3.8 h，發(fā)酵乳樣品的SLB 處于波動狀態(tài)，酪蛋白膠束的pH 值降低，凈負(fù)電荷逐漸減少，膠束之間的靜電斥力逐漸減小，從而對膠束的穩(wěn)定性產(chǎn)生影響[22]。3.8 h 后SLB 值在拐點后開始緩慢上升，使原有的酪蛋白聚發(fā)生解離，樣品逐漸達到微黏性狀態(tài)。當(dāng)SLB 為0.5 時為凝膠點，E組最先到達凝乳點，其它各組到達時間比較接近，A 組較快到達凝乳點。發(fā)酵終點時，SLB 值在0.7左右，樣品具有更多的黏性液體特征，其中E 組發(fā)酵乳的SLB 最高，而D 組最低。

除E 組發(fā)酵乳外，其余發(fā)酵乳樣品的EI 在3.8 h 內(nèi)保持穩(wěn)定，在此期間MVI、SLB 和FI 值處于較大的波動狀態(tài)，原因是酪蛋白未形成凝膠的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[22]。4 h 開始，A、B、C、D 組發(fā)酵乳EI 出現(xiàn)拐點且迅速呈垂直上升，到達凝膠點。隨發(fā)酵時間的增加，發(fā)酵乳中的酪蛋白發(fā)生完全解離并快速聚集形成凝膠結(jié)構(gòu)，EI 值達到最大[23]。到發(fā)酵終點時，A組與對照組E 組的EI 值接近，略大于其它各組，表示形成的凝膠結(jié)構(gòu)更為緊密。

試驗各組發(fā)酵乳在發(fā)酵前3.8 h，MVI 值在同一時期保持在一定水平范圍內(nèi)波動，這是處于低黏度的初始停滯階段，原因是未形成凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[24]。3.8 h 后，A、B、C、D 組發(fā)酵乳樣MVI 迅速上升，可能由于酪蛋白膠粒發(fā)生解離后開始形成凝膠，之后各發(fā)酵乳樣品進入高黏度階段使MVI 迅速增至最大值[25]。5.3 h 左右出現(xiàn)同樣的趨勢。發(fā)酵終點時形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，各組發(fā)酵乳最終形成穩(wěn)定的凝膠結(jié)構(gòu)。

發(fā)酵3.8 h，除發(fā)酵乳E 組外，其它各組FI 值均處于波動狀態(tài)，表現(xiàn)為液態(tài)性質(zhì)。4.5 h 后出現(xiàn)拐點，F(xiàn)I 值從直線下降到平緩下降，達到10-2Hz后基本保持不變，說明樣品具有較高的黏性液體性質(zhì)。到發(fā)酵終點，E 組發(fā)酵乳的FI 最低。

2.3 質(zhì)構(gòu)特性

貯藏過程過程中，5 組發(fā)酵乳的質(zhì)構(gòu)特性見表5。由于后酸和酪蛋白水合作用等因素會影響發(fā)酵乳的硬度、脫水收縮等質(zhì)構(gòu)特性，因此本試驗中所有質(zhì)構(gòu)參數(shù)均在貯藏期測定。5 組發(fā)酵乳的硬度、內(nèi)聚性、稠度、黏度指標(biāo)均存在顯著差異（P〈0.05）。其中硬度和黏度指數(shù)在貯藏1，7，21 d 有差異（P〈0.05），貯藏14 d 時無差異（P〉0.05）。稠度和內(nèi)聚性在貯藏1，7，14，21 d 均有差異（P〈0.05）。有研究表明硬度直接影響酸奶質(zhì)量[26]。本研究中，E 組具有最大硬度，其次是A 組，再次是C 組，說明A、C 組酸奶質(zhì)量較好。從稠度、內(nèi)聚性、黏度指數(shù)角度分析，A、C 組發(fā)酵乳的相關(guān)參數(shù)比其它發(fā)酵組高。從總體分析，A、C 組發(fā)酵乳與商業(yè)發(fā)酵劑組相似，表現(xiàn)出優(yōu)良的性能。吳淼等[27]研究表明：發(fā)酵乳的蛋白水解活性、酸化能力、硬度和黏稠性均隨貯藏時間的延長而增加（P〈0.05），而內(nèi)聚性、持水力和感官評分顯著下降（P〈0.05）。而在本研究中，與嗜熱鏈球菌S10 復(fù)配的IMAU20450、IMAU62091 持水性并未下降，可能是由于嗜熱鏈球菌S10 與保加利亞乳桿菌復(fù)配發(fā)酵可增加發(fā)酵乳的特性。

表5 發(fā)酵乳貯藏期間質(zhì)構(gòu)參數(shù)分析Table 5 Analysis of texture index of fermented milk

2.4 貯藏穩(wěn)定性

本研究對各組發(fā)酵乳樣品在貯藏期間的滴定酸度、持水性和黏度變化情況進行測定，綜合評價在不同時間保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌復(fù)配發(fā)酵乳后酸及穩(wěn)定性情況，結(jié)果如圖2、表6 所示。

圖2 發(fā)酵乳在25 ℃貯藏14 d 期間pH 值和滴定酸度（TA）變化Fig.2 Changes in pH and titratable acidity of fermented milk during storage at 25 ℃for 14 days

表6 發(fā)酵乳4 ℃貯藏21 d 的pH 值、酸度、持水性和黏度變化Table 6 Changes of titratable acidity，water holding capacity and viscosity of yogurt samples during storage

2.4.1 后酸化評價結(jié)果 后酸化指發(fā)酵乳在運輸、銷售過程中，乳酸菌仍生長繁殖，持續(xù)產(chǎn)酸使酸度繼續(xù)升高的現(xiàn)象。后酸化不僅使產(chǎn)品品質(zhì)下降，還會影響酸奶的貨架期。采用25 ℃貯藏14 d的pH 值和TA 變化來評估各組發(fā)酵乳后酸化情況，結(jié)果如圖2 所示。在發(fā)酵乳貯藏期間生長產(chǎn)酸的保加利亞乳桿菌是造成產(chǎn)品后酸化現(xiàn)象的主要原因[28]。本研究中，不同株保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球菌S10 復(fù)配時表現(xiàn)出的后酸化情況不同。第3 天時，各組發(fā)酵乳pH 值和TA 值變化雖較大，但無顯著差異（P〉0.05）。第7 天時，發(fā)酵乳A、C 組的TA 值顯著低于其它各組（P〈0.05），且差異持續(xù)至14 d 貯藏結(jié)束。說明菌株保加利亞乳桿菌IMAU20450、IMAU62091 與嗜熱鏈球 菌S10 復(fù) 配時具有較好的弱后酸化能力。

2.4.2 酸度 酸度是衡量酸奶風(fēng)味的一個重要的指標(biāo)。貯藏1 d 至7 d 時，E 組的TA 值最大，從14 d 至21 d 時增加趨勢變得緩慢，甚至出現(xiàn)下降的趨勢。從貯藏期間滴定酸度看，貯藏1 d 時A、C、D組發(fā)酵乳無明顯差別，7 d 時A、B、C 組發(fā)酵乳無明顯差別，14 d 時A、B、C、D、E 組發(fā)酵乳無明顯差別，21 d 時A、E 組發(fā)酵乳無明顯差別。在4 ℃貯藏時1，7，21 d 酸度均有明顯差異（P〈0.05），而14 d時酸度無差異（P〉0.05），這與持水性表現(xiàn)出一致性。

2.4.3 持水性 持水性用來衡量發(fā)酵乳的乳清存在于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的穩(wěn)定性。發(fā)酵乳貯藏1，7，21 d 時A、B、C、D、E 組發(fā)酵乳的持水性無差異（P〉0.05），14 d 時的持水性有明顯差別。這與發(fā)酵過程中表現(xiàn)出的內(nèi)聚性一致。5 組發(fā)酵乳的持水性都較好，在60%～80%范圍。李慧等[29]對攪拌型酸奶的持水性及黏度的測定表明，黏度總體上與持水性呈較高的正相關(guān)，隨黏度發(fā)生改變，與本研究相符。此外，4 株保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌S10 復(fù)配發(fā)酵后發(fā)酵乳的持水性均良好。

2.4.4 黏度 貯藏期間，各試驗組發(fā)酵乳的黏度與對照組無顯著差異（P〉0.05），說明4 株保加利亞乳桿菌和嗜熱S10 復(fù)配后可以提高發(fā)酵乳的黏度，達到商業(yè)發(fā)酵劑的標(biāo)準(zhǔn)。石月鋒等[30]在研究凝固型酸奶貯存過程中的特性時發(fā)現(xiàn)酸奶的黏度和酸度存在一定的相關(guān)性，隨著黏度增加，酸度反而減小。在本研究中沒有明顯的差別，可能由于復(fù)配的發(fā)酵乳可以達到商業(yè)發(fā)酵劑黏度的水平。Xu等[31]研究了嗜熱鏈球菌S-3 與德氏乳桿菌復(fù)配發(fā)酵在酸奶中的應(yīng)用，并對其胞外多糖（EPS-S3）結(jié)構(gòu)進行表征。通過流變學(xué)研究結(jié)果顯示EPS 具有增加發(fā)酵乳表觀黏度的作用，而蔡淼等[32]研究顯示，EPS 雖可以增加發(fā)酸乳的表觀黏度，但其添加量與酸乳質(zhì)構(gòu)沒有明確的關(guān)系。

3 結(jié)論

將保加利亞乳桿菌IMAU20450、IMAU95110、IMAU62091、IMAU62161 與嗜熱鏈球菌S10 進行復(fù)配，以商業(yè)發(fā)酵劑為對照，分析各組發(fā)酵乳發(fā)酵過程中凝膠特性和貯藏穩(wěn)定性，并評價后酸化特性。結(jié)果表明，各株保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球菌S10 復(fù)配的發(fā)酵過程中形成凝膠的微流變特性類似，其中保加利亞乳桿菌IMAU20450 復(fù)配時形成的凝膠較為緊密。保加利亞乳桿菌IMAU20450、IMAU62091 與嗜熱鏈球菌S10 復(fù)配發(fā)酵乳表現(xiàn)出弱后酸化特征，具有較好的貯藏穩(wěn)定性，感官評分較高，說明這幾株菌有深入研究的價值及較好的應(yīng)用前景。本研究是基于我國自主知識產(chǎn)權(quán)乳酸菌菌株開發(fā)乳酸菌發(fā)酵劑，可為進一步研究提供物質(zhì)基礎(chǔ)和數(shù)據(jù)參考。