基于RPA/CRISPR-Cas12a技術(shù)的單核細(xì)胞增生李斯特菌快速檢測方法建立

陳大偉　李兵兵　魏明月　李雙姝　楊鵬飛　劉靚

摘 要：建立基于RPA/CRISPR-Cas12a技術(shù)單核細(xì)胞增生李斯特菌的快速檢測方法。選取單增李斯特菌溶菌素毒力基因hly（GeneID：987033），設(shè)計(jì)重組酶聚合酶擴(kuò)增（recombinase polymerase amplification，RPA）引物結(jié)合CRISPR-Cas12a蛋白研制兩步法單增李斯特菌快速檢測試劑盒，并對(duì)其靈敏度、特異性以及反應(yīng)速率進(jìn)行分析。結(jié)果表明：該法檢測速率快，30 min內(nèi)可檢出單核細(xì)胞增生李斯特菌，同時(shí)具有較高的靈敏度，20 μL體系可檢測到最低0.0015 ng靶標(biāo)核酸。將該試劑盒進(jìn)一步用于檢測人工模擬污染食品三文魚肉片，檢測限可達(dá)10 CFU/mL。本方法檢測30 份實(shí)際樣本，結(jié)果均與熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法陽性檢出率一致。RPA/CRISPR-Cas12a技術(shù)是快速檢測食源性單增李斯特菌的可行方法。

關(guān)鍵詞：單核細(xì)胞增生李斯特菌；重組酶聚合酶擴(kuò)增；CRISPR-Cas12a；快速檢測

Development of a Rapid Detection Method for Listeria monocytogenes Based on Recombinase Polymerase Amplification Combined with CRISPR-Cas12a Technology

CHEN Dawei， LI Bingbing， WEI Mingyue， LI Shuangshu， YANG Pengfei， LIU Liang*

（Huai’an Center for Disease Control and Prevention， Jiangsu Provincial Key Laboratory for Food Safety Risk Monitoring

（Pathogenic Bacteria）， Huai’an 223003， China）

Abstract： Objective： To develop a rapid detection method for Listeria monocytogenes based on clustered regularly interspaced short palindromic repeats （CRISPR）/CRISPR associated protein 12a （Cas12a） combined with recombinase polymerase amplification （RPA）. Methods： The virulence gene hly （GeneID： 987033） of L. monocytogenes was selected to design RPA primers， and a two-step rapid detection kit for L. monocytogenes was developed using RPA combined with CRISPR-Cas12a. The sensitivity， specificity， and reaction rate of the kit were analyzed. Results： This method was rapid and sensitive; it could detect L. monocytogenes within 30 minutes， and the minimum level of the target nucleic acid of 0.0015 ng

was detected using 20 μL of the system. Furthermore， when this kit was applied to detect artificially contaminated salmon fillets， the limit of detection was 10 CFU/mL， and the results for 30 actual samples were consistent with the positive detection rate obtained by fluorescence quantitative PCR. Conclusion： RPA combined with CRISPR-Cas12a is a feasible method for rapid detection of foodborne L. monocytogenes.

Keywords： L. monocytogenes; recombinase polymerase amplification; clustered regularly interspaced short palindromic repeats （CRISPR）-CRISPR associated protein 12a; fast detection

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20230710-066

中圖分類號(hào)：Q783.1? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-8123（2023）09-0046-06

引文格式：

陳大偉， 李兵兵， 魏明月， 等. 基于RPA/CRISPR-Cas12a技術(shù)的單核細(xì)胞增生李斯特菌快速檢測方法建立[J]. 肉類研究，

2023， 37（9）： 46-51. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20230710-066.? ? http：//www.rlyj.net.cn

CHEN Dawei， LI Bingbing， WEI Mingyue， et al. Development of a rapid detection method for Listeria monocytogenes based on recombinase polymerase amplification combined with CRISPR-Cas12a technology[J]. Meat Research， 2023， 37（9）： 46-51. （in Chinese with English abstract） DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20230710-066.? ? http：//www.rlyj.net.cn

李斯特菌屬是一種廣泛分布于食品和自然環(huán)境中的革蘭陽性菌。李斯特菌屬包含單核細(xì)胞增生李斯特菌（以下簡稱單增李斯特菌）、英諾克李斯特菌、伊氏李斯特菌、斯氏李斯特菌、威爾士李斯特菌、格氏李斯特菌等[1]，其中單增李斯特菌和伊氏李斯特菌對(duì)人和動(dòng)物具有致病性[2-3]。這類致病菌對(duì)易感人群可引起自然流產(chǎn)、新生兒敗血癥、腦膜腦炎等疾病[4]。李斯特菌分布廣泛，同時(shí)對(duì)極端環(huán)境的耐受性較強(qiáng)，因此在食品生產(chǎn)以及運(yùn)輸?shù)亩鄠€(gè)環(huán)節(jié)均可引起食品污染[5-6]。近年，國內(nèi)外關(guān)于李斯特菌引起的食品污染事件也時(shí)有發(fā)生，因此，對(duì)李斯特菌進(jìn)行有效監(jiān)測對(duì)于保障人類健康、減少經(jīng)濟(jì)損失、提高經(jīng)濟(jì)效益具有重要的意義。

目前，用于李斯特菌的檢測方法主要有：1）培養(yǎng)法[7]；2）免疫分析法，如酶聯(lián)免疫吸附和膠體金免疫層析法[8-9]；3）基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)的方法，如熒光定量PCR[10-11]；

4）等溫?cái)U(kuò)增法，如環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法[10]。培養(yǎng)法是“金標(biāo)準(zhǔn)”，準(zhǔn)確度高但耗時(shí)費(fèi)力，適用于對(duì)檢出速率要求低的場景。免疫法檢測速率相對(duì)較快，但是靈敏度相對(duì)較低，單克隆抗體的制備成本也較高，適用于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的快速篩查。PCR法以及等溫?cái)U(kuò)增法屬于核酸檢測方法，靈敏度高，但是PCR法需要特定的PCR儀器，等溫?cái)U(kuò)增法速率快不需要專門的PCR儀，但是等溫?cái)U(kuò)增由于擴(kuò)增溫度相對(duì)較低，易產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增。規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)（clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats，CRISPR）檢測是一種速率快、靈敏度高、不易產(chǎn)生非特異性，且不依賴于昂貴儀器的方法，更適用于現(xiàn)場的及時(shí)檢測。

CRISPR/CRISPR-associated protein（Cas）檢測技術(shù)是近年來發(fā)展迅速的核酸檢測技術(shù)，因其檢測速率快、特異性強(qiáng)、便捷性高，受到極大關(guān)注[12-14]。近年來，將CRISPR-Cas檢測技術(shù)與等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)相結(jié)合用于各類細(xì)菌和病毒的檢測已有大量報(bào)道[15-16]，兩種技術(shù)的結(jié)合既利用CRISPR-Cas檢測的高特異性和高靈敏度，又利用了等溫?cái)U(kuò)增的便捷性，非常適用于現(xiàn)場及時(shí)檢測。目前，將CRISPR-Cas檢測技術(shù)應(yīng)用于單增李斯特菌的研究相對(duì)較少。李焓笑[17]以iap基因轉(zhuǎn)錄的RNA為靶標(biāo)利用Cas13蛋白檢測單增李斯特菌；李凡[18]以LMOSLCC2755_0090基因?yàn)榘袠?biāo)進(jìn)行重組酶聚合酶擴(kuò)增（recombinase polymerase amplification，RPA）和CRISPR-Cas12a結(jié)合，利用電化學(xué)以及芯片等方法于一管內(nèi)檢測單增李斯特菌。以RNA為靶標(biāo)在實(shí)際應(yīng)用中可能存在易降解的問題，且RNA的檢測環(huán)境要求較DNA高很多，不利于開展現(xiàn)場及時(shí)檢測。電化學(xué)以及芯片等方法是較前沿檢測方法，但也存在成本高、操作要求高等問題，用于現(xiàn)場及時(shí)檢測存在一定困難。

本研究基于CRISPR-Cas12a蛋白和RPA技術(shù)以單增李斯特菌特異性溶血酶毒素基因hly為靶標(biāo)，建立二步法快速檢測單核細(xì)胞增生李斯特菌的檢測體系，將RPA和CRISPR檢測分開，結(jié)合可視化熒光報(bào)告探針，旨在提高檢測的靈敏度和節(jié)約成本，更合適于現(xiàn)場的快速檢測。

1 材料與方法

1.1 菌株與試劑

單增李斯特菌ATCC 19115、英諾克李斯特菌ATCC 33090、伊氏李斯特菌ATCC 19119、格氏李斯特菌ATCC 25401、威爾斯李斯特菌ATCC 35897、斯氏李斯特菌ATCC 35967、腸炎沙門氏菌ATCC 14028、金黃色葡萄球菌ATCC 29213、大腸桿菌MG1655均為本實(shí)驗(yàn)室保存。

單增李斯特菌熒光定量檢測試劑盒（50 rxn）?上海伯杰醫(yī)療科技有限公司；TwistAmp Liquid Basic Kit（100 rxn） 英國TwistDx公司；轉(zhuǎn)錄試劑盒T7 High Yield RNA Transcription Kit（50 rxn） 南京諾唯贊生物科技股份有限公司；CRISPR-Cas12a蛋白（5 pmol/μL）? ?上海惠誠生物科技有限公司；NEB Buffer 3.1、NEB Buffer 4、NEB CutSmart Buffer、Buffer（均為10×）? ?New England Biolabs（北京）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

3K15離心機(jī) 德國默克公司；ABIQ5實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀、Qubit2.0熒光定量PCR儀 美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；DH209L電熱恒溫培養(yǎng)箱 天津泰斯特儀器有限公司；GelDoc XR Biorad凝膠成像系統(tǒng) 伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司；DK-320S三用恒溫水槽 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株活化和菌液制備

將凍存的單增李斯特菌菌種在常溫下解凍，并通過平板劃線法，在胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基上對(duì)其進(jìn)行活化（37 ℃下恒溫培養(yǎng)18 h）。然后，選取單個(gè)典型菌落接種于胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基中，在37 ℃下180 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)24 h。吸取1 mL培養(yǎng)后的菌液于1.5 mL無菌離心管中，10 000 r/min離心3 min，除去上清液，用0.9%生理鹽水洗滌2 次并重懸，通過平板計(jì)數(shù)法確定菌落數(shù)。

1.3.2 引物合成

RPA引物用于擴(kuò)增單增李斯特菌特異性毒力基因hly[19]，轉(zhuǎn)錄引物用于將DNA轉(zhuǎn)錄成靶標(biāo)crRNA，熒光探針ssDNA用于指示反應(yīng)，引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。RPA引物和crRNA設(shè)計(jì)在https：//ezassay.com/primer完成。轉(zhuǎn)錄引物合成后參照轉(zhuǎn)錄試劑盒T7 High Yield RNA Transcription Kit方法將DNA轉(zhuǎn)錄成crRNA備用。所用引物序列如表1所示。

1.3.3 RPA/CRISPR-Cas12a檢測體系的構(gòu)建

利用水煮法提取單增李斯特菌的DNA，根據(jù)TwistAmp Liquid Basic Kit說明方法擴(kuò)增單增李斯特菌DNA；擴(kuò)增體系：5 μL 5×反應(yīng)緩沖液、1.25 μL醋酸鎂溶液（280 mmol/L）、引物各1 μL、模板5 μL、11.75 μL RNase-free ddH2O2，于37 ℃恒溫?cái)U(kuò)增15 min，擴(kuò)增產(chǎn)物備用。20 μL檢測體系[21]：1 μL CRISPR-Cas12蛋白溶液（5 pmol/μL）、2 μL crRNA （2 pmol/μL）、5 μL RPA擴(kuò)增產(chǎn)物、2 μL NEB Buffer 4、2 μL ssDNA（10 pmol/μL）、8 μL RNase-free ddH2O2。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求在此檢測體系基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化。

1.3.4 人工污染樣品檢測

取10 g三文魚肉樣品切碎后與90 mL無菌生理鹽水（0.9 g/100 mL NaCl）混合，然后以中速均質(zhì)15 min。在900 μL勻漿中加入不同濃度的單增李斯特菌，振蕩混勻，使其終濃度分別達(dá)到101、102、103、104 、105 CFU/mL。配制的加標(biāo)樣品以500 r/min低速離心30 s，以去除大顆粒食品顆粒，上清液通過煮沸法提取核酸，用RPA/CRISPR-Cas12a檢測體系進(jìn)行檢測，每個(gè)樣品設(shè)置3 個(gè)平行。

1.3.5 市售樣品的檢測

考慮到市售樣品檢出單增李斯特菌的可能性較小，設(shè)置加標(biāo)樣。市售30 份三文魚樣品隨機(jī)抽取3 份分別接種一定量的單增李斯特菌、大腸桿菌和腸炎沙門氏菌。參照GB 4789.30—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗(yàn)》[22]的方法進(jìn)行增菌處理，然后按照1.3.3的方法提取核酸用于檢測，一組檢測的控溫過程在三控恒溫水浴鍋中完成進(jìn)行PA/CRISPR-Cas12a檢測，另一組在熒光定量PCR儀內(nèi)完成。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用Origin 8.0軟件作圖，使用SPSS 24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。涉及熒光檢測實(shí)驗(yàn)部分均重復(fù)3 次，使用配對(duì)χ2檢驗(yàn)（McNemar檢驗(yàn)），當(dāng)雙尾P＜0.05判定差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 RPA引物特異性驗(yàn)證

鑒于李斯特菌屬包含多種李斯特菌，而引起人類致病的只有單增李斯特菌，因此根據(jù)單增李斯特菌已報(bào)道的毒力基因hly序列和LMOSLCC2755_0090基因設(shè)計(jì)單增李斯特菌特異性擴(kuò)增引物RPA-F1、RPA-R1和RPA-F2、RPA-R2。常見的食源性致病菌除單增李斯特菌，還有大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球等，所以選取單增李斯特菌ATCC 19115、英諾克李斯特菌ATCC 33090、伊氏李斯特菌ATCC 19119、格氏李斯特菌ATCC 25401、威爾斯李斯特菌ATCC 35897、斯氏李斯特菌ATCC 35967、腸炎沙門氏菌ATCC 14028、金黃色葡萄球菌ATCC 29213、大腸桿菌MG1655標(biāo)準(zhǔn)菌株作為檢測對(duì)象。由圖1A、B可知，當(dāng)DNA模板為單增李斯特菌時(shí)，RPA-F1/R1引物對(duì)和RPA-F2/R2引物對(duì)才顯示出111 bp和247 bp DNA擴(kuò)增條帶，同時(shí)其他李斯特菌以及大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌無擴(kuò)增條帶，說明hly基因和LMOSLCC2755_0090基因是單增李斯特菌所特有，且引物特異性良好，可以用于富集單增李斯特菌特有DNA片段。鑒于hly基因擴(kuò)增片段相對(duì)較短，等溫?cái)U(kuò)增時(shí)間較短，所以選用RPA-F1/R1引物用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

A. RPA-F1/R1引物特異性驗(yàn)證；B. RPA-F2/R2引物特異性驗(yàn)證。泳道1～10.分別為單核細(xì)胞增生李斯特菌ATCC 19115、英諾克李斯特菌ATCC 33090、伊氏李斯特菌ATCC 19119、格氏李斯特菌ATCC 25401、威爾斯李斯特菌ATCC 35897、斯氏李斯特菌ATCC 35967、100 bp DNA Ladder、腸炎沙門氏菌ATCC 14028、金黃色葡萄球菌ATCC 29213、大腸桿菌MG1655。

2.2 RPA/CRISPR-Cas12a檢測體系的優(yōu)化

轉(zhuǎn)錄出crRNA對(duì)整個(gè)檢測體系的可行性進(jìn)行驗(yàn)證，取5 μL RPA擴(kuò)增產(chǎn)物加入CRISPR-Cas12a檢測體系，通過預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該方法可以檢測單核細(xì)胞增生李斯特菌。在此基礎(chǔ)上對(duì)檢測體系的反應(yīng)緩沖液、crRNA濃度、蛋白濃度作適當(dāng)優(yōu)化。由圖2可知，在NEB Buffer 3.1、NEB Buffer 4、NEB CutSmart Buffer、Cas12a酶自帶的反應(yīng)緩沖液10×Buffer中，在NEB Buffer 4中反應(yīng)速率較快，同時(shí)熒光信號(hào)強(qiáng)度也較高。由圖3可知，20 μL檢測體系中加入2、4、8、12 pmol的crRNA，觀察反應(yīng)速率和信號(hào)強(qiáng)度，當(dāng)Cas12a蛋白與crRNA的濃度比約為1∶1時(shí)，體系中加入4 pmol crRNA時(shí)反應(yīng)速率和信號(hào)強(qiáng)度較好。由圖4可知，Cas12a蛋白濃度對(duì)檢測體系影響較小，選擇與crRNA濃度接近1∶1的添加量，即5 pmol/μL。由于體系在藍(lán)光下有肉眼可見的熒光，因此未對(duì)熒光探針量進(jìn)行優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)確定最佳的檢測體系為5 μL RPA產(chǎn)物、2 μL 10×NEB Buffer 4、4 pmol crRNA、5 pmol Cas12a蛋白、20 pmol熒光探針。

2.3 RPA/CRISPR-Cas12a檢測特異性和靈敏度驗(yàn)證

進(jìn)一步測試該檢測體系的特異性和靈敏度。由圖5可知，只有當(dāng)靶標(biāo)DNA和crRNA同時(shí)存在時(shí)體系才能產(chǎn)生熒光，說明檢測體系特異性高；由圖6可知，在體系中加入不同濃度的干擾核酸不影響檢測體系識(shí)別靶標(biāo)DNA，說明檢測體系抗干擾能力強(qiáng)。由圖7可知，向體系內(nèi)加入最低0.0015 ng DNA時(shí)仍能檢測出熒光值的變化，說明該體系具有很高的靈敏度。

A.熒光強(qiáng)度；B.實(shí)際熒光圖；圖6、7同。＋crRNA＋DNA. 體系中同時(shí)加入crRNA和DNA；＋crRNA－DNA. 體系中加入crRNA不加DNA；－crRNA＋DNA. 體系中不加crRNA加入DNA；－crRNA－DNA. 體系中不加crRNA不加DNA；反應(yīng)15 min觀察熒光。**.差異極顯著（P＜0.01），圖7A同。

2.4 實(shí)際樣品的檢測

單增李斯特菌不耐高溫，生肉及肉制品較易污染。用已建立的單增李斯特菌RPA/CRISPR-Cas12a檢測體系檢測了人工模擬污染李斯特菌的生三文魚肉片，由圖8可知，污染105、104、103、102、10 CFU/mL單增李斯特菌的三文魚肉片在檢測體系中反應(yīng)15 min時(shí)均顯示出肉眼可見的強(qiáng)熒光。說明該檢測體系可檢測低至10 CFU/ml單增李斯特菌污染的三文魚肉片。以熒光定量PCR為對(duì)照檢測30 份盲樣，結(jié)果如表2所示。RPA/CRISPR-Cas12a法檢出其中1 份陽性樣本，與熒光定量PCR方法檢出結(jié)果一致，添加了大腸桿菌和腸炎沙門菌的樣本兩種方法均沒有熒光信號(hào)，表明方法的檢測特異性很強(qiáng)。結(jié)果表明建立的單增李斯特菌檢測體系可以用于檢測實(shí)際污染單增李斯特菌樣本。

3 結(jié) 論

本研究建立一種基于RPA和CRISPR-Cas12a蛋白的單增李斯特菌檢測體系，只需在水浴鍋中RPA反應(yīng)

15 min，然后取5 μL產(chǎn)物加入CRISPR-Cas12a檢測體系中反應(yīng)15 min，富集擴(kuò)增和檢測共需要30 min，非常適用于現(xiàn)場的快速檢測。人工污染樣本中，本研究建立的方法可檢測低至10 CFU/mL的樣本，能夠保證在污染初期即可檢出。在30 份盲樣檢測中，熒光定量法出現(xiàn)1 份較弱的非特異性擴(kuò)增，而本研究方法沒有，可能是RPA擴(kuò)增特異性和CRISPR-Cas12a檢測的特異性疊加更不易產(chǎn)生假陽性。添加大腸桿菌和沙門氏菌的盲樣兩種方法均未檢出，說明實(shí)際樣本檢測中兩種方法均不會(huì)受到其他食源性致病菌的影響。

RPA與CRISPR技術(shù)相結(jié)合的檢測方法由于其不需要昂貴的儀器、速率快、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)近年來被廣泛研究[23-25]。RPA富集擴(kuò)增靶標(biāo)利用了其擴(kuò)增的便捷性，CRISPR檢測技術(shù)特異性強(qiáng)，將兩種方法結(jié)合實(shí)現(xiàn)了檢測的便捷性和特異性。該方法雖具有很多優(yōu)點(diǎn)，但仍存在需要改進(jìn)的地方，如本研究中仍需借助擴(kuò)增的方法富集核酸，核酸濃度過低時(shí)體系信號(hào)無法被足夠的放大，以及不能在一個(gè)體系中實(shí)現(xiàn)多重靶標(biāo)的檢測等。目前關(guān)于該方法的一些問題，一些學(xué)者已嘗試改進(jìn)，如不用核酸擴(kuò)增富集，而是利用電化學(xué)方法[26-28]、數(shù)字PCR方法[29]、檢測信號(hào)放大等進(jìn)行原位檢測[30-31]。這些方法在一定程度解決了上述問題，但在實(shí)際應(yīng)用中還存在處理步驟繁瑣、成本過高等問題，還需進(jìn)一步優(yōu)化和研究。

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收稿日期：2023-07-10

基金項(xiàng)目：淮安市衛(wèi)生健康科研項(xiàng)目（HAWJ202122）；江蘇省預(yù)防醫(yī)學(xué)科研課題（Y2018047）

第一作者簡介：陳大偉（1991—）（ORCID： 0009-0008-2869-3511），男，助理研究員，碩士，研究方向?yàn)槲⑸餀z驗(yàn)。

E-mail： 1832324965@qq.com

*通信作者簡介：劉靚（1982—）（ORCID： 0009-0004-5929-9040），女，副主任技師，碩士，研究方向?yàn)槲⑸餀z驗(yàn)。

E-mail： 410043363@qq.com