多光子成像用上轉(zhuǎn)換納米粒子的單顆粒研究與應(yīng)用進(jìn)展

李雅珍，王喜龍，田 躍，吳建紅，田彥婷，田碧凝*

（1.太原理工大學(xué) 物理學(xué)院，山西 太原 030024；2.太原理工大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院 新型碳材料研究所,山西 太原 030024）

1 引言

光學(xué)成像是生物活體研究中無可替代的關(guān)鍵技術(shù)，旨在實(shí)現(xiàn)并提高從分子水平到宏觀生物體的生命過程時空可視化[1-3]。1990 年，Denk 等首次報(bào)道了雙光子激光掃描顯微鏡及其在活細(xì)胞成像中的應(yīng)用[4]，這一工作標(biāo)志著多光子成像技術(shù)的問世。多光子成像基于探針吸收多個光子后可發(fā)射出一個具有更高能量光子的特點(diǎn)，能夠有效避免傳統(tǒng)生物成像中自發(fā)熒光引起的信噪比較差的問題，同時由于激發(fā)波長能量較低、波長較長，表現(xiàn)出更加優(yōu)異的深層組織成像能力[5]。問世三十年來，多光子成像技術(shù)得到迅速發(fā)展并在生物醫(yī)學(xué)研究中嶄露頭角，但受多光子過程物理機(jī)制的限制，其發(fā)光效率低并且激發(fā)域值高，不僅增加了成像難度和生物安全性隱患，還對成像激發(fā)源提出了苛刻的要求[6-7]。

稀土摻雜的上轉(zhuǎn)換納米粒子（Upconversion nanoparticles，UCNPs）作為一類新興的多光子探針，近年來吸引了大量研究人員的關(guān)注[8-10]。由于稀土離子具有亞穩(wěn)態(tài)中間能級，相較于傳統(tǒng)有機(jī)多光子熒光團(tuán)，上轉(zhuǎn)換納米粒子可以在激發(fā)光功率密度更為溫和的連續(xù)激光泵浦下實(shí)現(xiàn)多光子成像[11-12]。并且由于無機(jī)納米粒子理化性質(zhì)更加穩(wěn)定，上轉(zhuǎn)換納米粒子在多光子成像過程中表現(xiàn)出無光閃爍、光漂白的優(yōu)異特性[13-14]。隨著制備工藝的發(fā)展，具有良好均一性的小尺寸UCNPs 可被批量制備；通過殼層包覆、摻雜調(diào)控、表面修飾等方法，UCNPs 的上轉(zhuǎn)換效率近年來得到了大幅提升，同時生物特異性識別與標(biāo)記等功能也取得了重要進(jìn)展[15-16]。

傳統(tǒng)成像技術(shù)以大量熒光探針標(biāo)記為基礎(chǔ)，收集的是發(fā)光信號的集合信息，很難實(shí)現(xiàn)如藥物分子遞送、神經(jīng)遞質(zhì)傳遞等細(xì)胞、亞細(xì)胞甚至分子水平的精細(xì)生命過程探測，因此單分子標(biāo)記與示蹤技術(shù)亟待發(fā)展。標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展離不開成像探針的不斷優(yōu)化，然而新型探針的設(shè)計(jì)受技術(shù)局限最終落腳在聚集體性能的表征層面。2009 年，Wu 等首次實(shí)現(xiàn)了對單個上轉(zhuǎn)換納米粒子的多光子成像，揭開了在單顆粒水平下研究與優(yōu)化UCNPs 成像性能的序幕[13]。2017 年，Liu 等通過受激發(fā)射損耗實(shí)現(xiàn)了單個UCNP 的超分辨成像，具有劃時代意義[17]。先進(jìn)成像技術(shù)與探針的發(fā)展相輔相成，正在朝著更高分辨率與靈敏度的方向發(fā)展。

基于目前UCNPs 在設(shè)計(jì)與成像應(yīng)用方面的研究進(jìn)展，本文將從多光子發(fā)光機(jī)制、多光子探針、UCNPs 的優(yōu)勢與問題出發(fā)，著重對近年來UCNPs 在單顆粒水平下的研究與應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行綜述，最后對單顆粒UCNPs 未來發(fā)展前景提出展望。

2 多光子發(fā)光機(jī)制

多光子發(fā)光又稱反斯托克斯發(fā)光，指長波長泵浦光子在光學(xué)材料中轉(zhuǎn)換為短波長發(fā)射光子的非線性過程[18]。按照光子能量轉(zhuǎn)換物理機(jī)制，多光子發(fā)光可以分為雙光子吸收（Two-photon absorption,TPA）、二次諧波（Second-harmonic generation,SHG）和上轉(zhuǎn)換（Upconversion,UC）[19]，如圖1。TPA 不依賴真實(shí)的中間能級，借助壽命在飛秒量級的虛能級連續(xù)吸收兩個光子產(chǎn)生反斯托克斯發(fā)射。SHG 又稱倍頻，基于超活性瑞利散射而非光子躍遷，通過二階非線性光學(xué)材料將具有兩個相同頻率的光子合并成一個頻率為其二倍的光子[20]。TPA 和SHG 存在固有的局限性，即依賴能夠產(chǎn)生高激發(fā)光功率密度（106～109W·cm-2）的昂貴脈沖激光器作泵浦源[15]，在應(yīng)用中存在生物組織光損傷隱患。

圖1 多光子發(fā)光機(jī)制Fig.1 Multi-photon luminescence mechanism

上轉(zhuǎn)換過程借助稀土離子的亞穩(wěn)態(tài)中間能級連續(xù)吸收兩個或多個較低能量的泵浦光子實(shí)現(xiàn)高能級布居，繼而發(fā)射出一個具有較高能量的光子[21]。相對TPA 和SHG，稀土上轉(zhuǎn)換對激發(fā)光功率密度的要求較低，可在低能量密度的連續(xù)激光器上實(shí)現(xiàn)多光子過程[12]。常見的稀土上轉(zhuǎn)換過程包括激發(fā)態(tài)吸收（Excited state absorption，ESA）、合作敏化上轉(zhuǎn)換（Cooperative sensitization upconversion,CSU）、能量傳遞上轉(zhuǎn)換（Energy transfer upconversion,ETU）和光子雪崩（Photo avalanche，PA）等。以雙光子過程為例，ESA 過程中位于基態(tài)的稀土離子4f 電子首先吸收一個光子躍遷至亞穩(wěn)態(tài)中間能級，吸收第二個光子后該電子繼續(xù)向更高能級躍遷，實(shí)現(xiàn)上轉(zhuǎn)換。CSU 過程中兩個處于激發(fā)態(tài)能級的離子將能量傳遞給另一個4f電子處于基態(tài)的稀土離子，使之直接躍遷至高能量發(fā)生能級。ETU 過程一般依靠敏化劑離子吸收低能量光子，再通過能量傳遞依次使激活劑離子的基態(tài)電子躍遷至中間態(tài)和高激發(fā)態(tài)能級，從而釋放高能量光子[22]。PA 過程首先基于ESA 使高能級被布居，由于交叉弛豫的作用，激發(fā)態(tài)和基態(tài)能級上的兩個電子同時落在中間能級，再吸收兩個光子后，高能級上得到兩個電子的布居，繼而通過交叉弛豫形成四個電子布居的中間能級……這種類似“雪崩”的過程即為光子雪崩上轉(zhuǎn)換。

3 多光子探針

3.1 有機(jī)熒光團(tuán)

氧雜蒽、苯并吡喃、氟硼二吡咯等具有大π 共軛結(jié)構(gòu)的熒光染料是常見的有機(jī)多光子熒光團(tuán)[23-24]，其光致多光子發(fā)光機(jī)制以雙光子吸收為主，即位于基態(tài)的電子借助虛能級連續(xù)吸收兩個光子躍遷至最低未占據(jù)分子軌道（Lowest unoccupied molecular orbital,LUMO），繼而輻射躍遷至最高占據(jù)分子軌道（Highest occupied molecular orbital,HOMO）[25]?；谟袡C(jī)熒光團(tuán)的多光子過程主要受其吸收截面δ決定，而δ主要取決于有機(jī)分子結(jié)構(gòu)。在給定的光學(xué)頻率ω下，δ與材料在受激感應(yīng)電場中的電極化強(qiáng)度三階極化率的虛部Im[γ（ω）]成正比[26]：

目前報(bào)道的有機(jī)多光子熒光團(tuán)包括電子供體-受體（D-A）、供體-π 橋-受體（D-π-A）和供體-π 橋-受體-π 橋-供體（D-π-A-π-D）型偶極、四極、八極分子等[27-28]。δ的大小主要受D、A 基團(tuán)推、拉電子誘發(fā)的分子極性決定，因此通過調(diào)控骨架共軛性、側(cè)鏈取代等增強(qiáng)分子內(nèi)偶極矩的方式可以在一定范圍內(nèi)增大其吸收截面，進(jìn)而提高光子轉(zhuǎn)換效率。此外，通過引入剛性共軛環(huán)可提高有機(jī)熒光團(tuán)的光穩(wěn)定性。

有機(jī)熒光團(tuán)尺寸小，通過引入水溶性基團(tuán)可獲得良好的水溶性，是一類重要的生物多光子探針。然而，受能隙定律決定，在能夠提高分子吸收截面的復(fù)雜大π 共軛結(jié)構(gòu)中，內(nèi)轉(zhuǎn)換和隙間竄越速率常數(shù)隨著能隙的減小而增加，因此高亮度和高信噪比的有機(jī)熒光團(tuán)的開發(fā)依然面臨很大的挑戰(zhàn)。

3.2 半導(dǎo)體量子點(diǎn)

量子點(diǎn)是指三維空間尺度小于激子二倍波爾半徑的類原子小點(diǎn)?？蓪?shí)現(xiàn)多光子發(fā)光的無機(jī)半導(dǎo)體量子點(diǎn)有CdSe[29]、CdZnSe[30]、MoS2[31]、PbS[32]和Ag2S[33]等，有機(jī)半導(dǎo)體量子點(diǎn)即有機(jī)半導(dǎo)體大分子或聚合物折疊而成的尺寸達(dá)納米以上的小點(diǎn)，如Qtracker、Beida、Texas Red、SR101 以及石墨烯量子點(diǎn)等[34-35]。無論無機(jī)還是有機(jī)量子點(diǎn)，其多光子吸收截面普遍高于有機(jī)熒光團(tuán)2～3 個數(shù)量級，并且發(fā)光效率及穩(wěn)定性均優(yōu)于有機(jī)熒光團(tuán)，因此獲得了非線性光學(xué)領(lǐng)域的廣泛關(guān)注[30-31,36]。

在量子點(diǎn)中，由于量子限域效應(yīng)，電子能量直接依賴于電子波函數(shù)的空間限制程度。隨著量子點(diǎn)尺寸減小，電子波函數(shù)態(tài)密度降低以產(chǎn)生離散能級，其能隙隨著晶體尺寸的減小而增加[37-38]，因此利用這一特點(diǎn)可以對量子點(diǎn)的能隙進(jìn)行連續(xù)調(diào)制，從而有效控制其吸收與發(fā)射等光學(xué)特性。量子限域效應(yīng)的一個重要結(jié)果是載流子間庫侖相互作用的增強(qiáng)，繼而導(dǎo)致激子通過俄歇復(fù)合快速衰變，因此雙激子和高階激子的量子產(chǎn)率通常很低[39]。

3.3 稀土上轉(zhuǎn)換納米粒子

作為一類特殊的稀土發(fā)光材料，上轉(zhuǎn)換納米粒子的研究在近十年得到了快速發(fā)展。相較于傳統(tǒng)有機(jī)熒光團(tuán)和半導(dǎo)體量子點(diǎn)，上轉(zhuǎn)換納米粒子作為生物多光子探針具有兩大優(yōu)勢：一是上轉(zhuǎn)換納米粒子的理化性質(zhì)尤其是發(fā)光性質(zhì)穩(wěn)定，無光閃爍、光漂白；二是稀土上轉(zhuǎn)換過程得益于亞穩(wěn)態(tài)中間能級的輔助，其多光子激發(fā)域較有機(jī)熒光團(tuán)和半導(dǎo)體量子點(diǎn)可降低三個數(shù)量級，不僅成像效率高，同時生物光損傷風(fēng)險能夠被有效降低。因此，稀土摻雜的上轉(zhuǎn)換納米粒子在多光子成像及相關(guān)生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域顯現(xiàn)出較大優(yōu)越性[40-41]。

3.3.1 稀土離子的電子躍遷

稀土元素種類豐富，包含鈧、釔及15 個鑭系元素，在化合物中常見價態(tài)為+3。稀土離子具有5d 外層全充滿、4f 內(nèi)層半充滿的特殊電子結(jié)構(gòu)。處于4f 基態(tài)的電子在光激勵下可躍遷至4f 激發(fā)態(tài)或4fN-15d 組態(tài)。4f→5d 躍遷是電偶極允許躍遷，其振子強(qiáng)度較大。而f→f 電偶極躍遷宇稱相同導(dǎo)致矩陣元為零，為禁戒躍遷；當(dāng)晶體結(jié)構(gòu)中存在反宇稱成分時，在一定程度上能夠使4f 躍遷被允許，但總體來講f→f 躍遷效率較低[42-44]。對于5d外殼層，由于易受晶體場環(huán)境影響，其位置與材料導(dǎo)帶底近似，因此d→f 輻射躍遷一般為寬帶發(fā)射。而f→f 輻射躍遷由于4f 能級是分離的，因而表現(xiàn)出銳線發(fā)射特征。4f 殼層軌道量子數(shù)（l）為3，對應(yīng)-3，-2，-1，0，1，2，3 這7 個磁量子數(shù)（me），最大可容納電子數(shù)為14，根據(jù)排布規(guī)則，4f 電子層具有非常豐富的能級結(jié)構(gòu)。受晶體場等作用，這些能級在實(shí)際中還會發(fā)生劈裂。由此，稀土離子f→f 躍遷通道數(shù)量非常可觀[44]。

3.3.2 上轉(zhuǎn)換發(fā)光中心、敏化劑與基質(zhì)

雖然稀土離子種類豐富、f→f 躍遷通道眾多，但能級結(jié)構(gòu)能夠滿足光子上轉(zhuǎn)換需求的并不多：在具有能級差近似梯子狀能級結(jié)構(gòu)的同時能級差需要足夠大以減小無輻射弛豫的發(fā)生。常見的上轉(zhuǎn)換發(fā)光中心有鉺（Er3+）、鈥（Ho3+）、銩（Tm3+）離子；同時鐿（Yb3+）、釹（Nd3+）等稀土離子因在與發(fā)光中心相應(yīng)吸收位置具有更大的吸收截面，常用作上轉(zhuǎn)換過程的敏化劑[45]，其電子結(jié)構(gòu)如圖2。

圖2 三價釹、鈥、鉺、銩、鐿離子能級圖。Fig.2 Energy level diagram of Nd3+，Ho3+，Er3+，Tm3+ and Yb3+ ions.

稀土發(fā)光材料的基質(zhì)眾多，如無機(jī)鹽、氧化物、氟化物等，其中氟化物由于具有較低的聲子能量而被認(rèn)為是更加合適的上轉(zhuǎn)換基質(zhì)[46-47]。用于上轉(zhuǎn)換的氟化物基質(zhì)包括NaYF4、NaGdF4、LiYF4、LaF3、KLu2F7等[12-14,48-53]。稀土離子非輻射弛豫躍遷速率與基質(zhì)材料聲子能量的關(guān)系如公式（2）[42]所示：

β為基質(zhì)相關(guān)常數(shù)，ΔE為發(fā)光中心的能級差，?max為基質(zhì)的聲子能量?？梢娀|(zhì)的聲子能量越小，非輻射弛豫速率越低。自NaYF4∶Yb3+,Er3+被報(bào)道以來，NaYF4因其聲子能量相對較低（約400 cm-1）的特性被認(rèn)為是最優(yōu)的上轉(zhuǎn)換基質(zhì)[47,54]。其中以六方相（β 相）NaYF4為基質(zhì)的UCNPs，由于稀土占據(jù)晶格格位的對稱度較低，其上轉(zhuǎn)換發(fā)光效率比立方相（α 相）高約一個數(shù)量級[54-55]。

3.3.3 UCNPs 優(yōu)化設(shè)計(jì)

在生物光學(xué)成像中，探針密度、激發(fā)光能量密度與組織代謝、損傷之間存在著平衡關(guān)系。提高探針發(fā)光的量子效率是實(shí)現(xiàn)探針密度、激發(fā)光能量密度降低的根本。以UCNPs 聚集體為研究對象的前期工作總結(jié)出大量通過材料優(yōu)化設(shè)計(jì)實(shí)現(xiàn)上轉(zhuǎn)換增強(qiáng)的寶貴經(jīng)驗(yàn)，如晶體場調(diào)控、殼層包覆、摻雜濃度優(yōu)化、局域等離子體場增強(qiáng)等均可有效提高UCNPs 的上轉(zhuǎn)換效率[56]。

4 UCNPs 的單顆粒研究

4.1 單顆粒光學(xué)性質(zhì)測量的優(yōu)勢與基本操作

絕大多數(shù)對UCNPs 的研究是在粒子的聚集體上展開的，通常以粉末、納米粒子的懸浮液或旋涂的薄膜等為研究對象，利用熒光光譜儀對其測試。在光學(xué)性質(zhì)的測量過程中，聚集體的表征存在一定程度的誤差[57]。如量子效率的表征中，粉末壓片或膜表面粗糙程度的差異、懸浮液中粒子絕對濃度的差異等都是造成測量誤差的因素。同時，聚集體中粒子之間存在著可能的能量傳遞，尤其是在薄膜和壓片中，粒子之間間距落在Dexter或F?rster 能量傳遞發(fā)生的范圍內(nèi)，這些能量傳遞進(jìn)一步為光學(xué)性質(zhì)的測量增加了不確定性[58]。與納米粒子聚集體光學(xué)性質(zhì)的表征不同，單顆粒表征是以高度分散的單個納米粒子為測量對象，不存在納米粒子之間的相互作用。到目前為止，單顆粒水平下對UCNPs 的研究揭示出許多不同于聚集體納米粒子的特殊光物理特性，詳見4.2 節(jié)。

單顆粒光學(xué)表征通常以搭載有納米步進(jìn)壓電位移臺的激光掃描共聚焦顯微系統(tǒng)為平臺，激發(fā)源為與UCNPs 吸收相對應(yīng)的激光器，探測器為單光子計(jì)數(shù)器。如圖3 所示[59]。

圖3 單顆粒上轉(zhuǎn)換成像與測試平臺示意圖［59］Fig.3 Single UCNPs imaging and characterization platform［59］

測量時，首先以薄涂的UCNPs 聚集體樣本對焦，再以單顆粒標(biāo)準(zhǔn)卡片校準(zhǔn)光路，最后對測試樣品進(jìn)行微區(qū)掃描得到單顆粒分散樣圖。定位單顆粒后即可利用單光子計(jì)數(shù)器、光譜儀、時間相關(guān)單光子計(jì)數(shù)器等對上轉(zhuǎn)換穩(wěn)定性、激發(fā)光功率密度依賴特性曲線、光譜線型以及特定能級的熒光壽命等進(jìn)行測量[60]。以氮化硅支持膜為襯底的單顆粒樣品，通過分散圖樣定位可實(shí)現(xiàn)與透射電子顯微鏡的結(jié)合。電子顯微技術(shù)的單顆粒表征可以提供粒子尺寸、核殼結(jié)構(gòu)、晶體結(jié)構(gòu)、元素分布等信息。通過光學(xué)與電鏡相結(jié)合的方式，既能夠研究單個粒子結(jié)構(gòu)與發(fā)光特性的內(nèi)在關(guān)系，也能夠?qū)Σ煌Ｗ又g的特異性進(jìn)行全面分析。需要指出的是，由于聚集體測試是以大量的納米粒子為對象，因此在較低的激發(fā)光功率密度下（0.1～100 W/cm2）即可捕獲上轉(zhuǎn)換發(fā)射信號；而對于單個納米粒子，在目前探測器光子捕獲靈敏度的條件下，一般需要＞100 W/cm2的激發(fā)光功率密度。當(dāng)然，單顆粒UCNPs 成像的激發(fā)閾直接取決于粒子的尺寸，這是因?yàn)樵趽诫s濃度不變時，稀土離子的數(shù)量與粒徑的立方成正比，而成像的激發(fā)閾會隨著稀土離子數(shù)量的減少而升高。在生物應(yīng)用中，尺寸過大的納米粒子應(yīng)用范圍受限，因此開發(fā)蛋白質(zhì)尺寸（4～35 nm）[61-62]的UCNPs 成像探針是未來研究的重點(diǎn)。

4.2 單顆粒水平下UCNPs 的光學(xué)性質(zhì)

單顆粒表征技術(shù)作為一種重要的納米材料光學(xué)性質(zhì)表征方法，由于測試平臺較為復(fù)雜、操作難度較大，其研究進(jìn)展遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于聚集體表征，遺留下諸多研究盲區(qū)。2013 年，Zhao 等報(bào)道了激發(fā)光功率密度在＞106W/cm2范圍內(nèi)，Tm3+摻雜濃度8%的粒子發(fā)射強(qiáng)度超過摻雜濃度0.2%～4% 的樣品[63]；2014 年，Gargas 等展示了以3×105W/cm2激發(fā)光功率密度為分界點(diǎn)，單個Er3+摻雜濃度20%的UCNPs 的發(fā)射強(qiáng)度反超2% 的UCNPs 的現(xiàn)象[64]。這些研究成果向傳統(tǒng)激發(fā)光功率密度＜100 W/cm2范圍內(nèi)聚集體研究形成的濃度猝滅、激發(fā)光功率密度飽和等結(jié)論發(fā)起了挑戰(zhàn)。近年來單顆粒水平下研究UCNPs 的工作日益增多，總結(jié)如表1。

表1 單顆粒研究的UCNPs 匯總Tab.1 UCNPs studied as singles

4.2.1 單顆粒上轉(zhuǎn)換的穩(wěn)定性

2009 年，Wu 等首次對單個UCNPs 分別進(jìn)行了4 000 s 和1 s 內(nèi)的光子監(jiān)測，首次報(bào)道了UCNPs 無光漂白、無光閃爍的穩(wěn)定多光子發(fā)光特點(diǎn)（圖4（a）[13]。隨后，Park 等充分證明了UCNPs（Na-GaF4∶Yb3+,Er3+）充當(dāng)單分子探針的穩(wěn)定性[14]：41 nm 的單個立方NaGdF4∶Yb3+,Er3+納米顆粒在激光泵浦長達(dá)4 h 后，上轉(zhuǎn)換發(fā)射強(qiáng)度依然沒有降低，如圖4（b）。并且，上轉(zhuǎn)換發(fā)射的出色光穩(wěn)定性與鑭系元素離子的類型和納米粒子尺寸無關(guān)，圖4（c）直徑＜10 nm 的Er3+摻雜的UCNPs[69]和圖4（d）直徑40 nm 的Tm3+摻雜的UCNPs[82]上轉(zhuǎn)換發(fā)射的穩(wěn)定性同樣優(yōu)越。這種優(yōu)越的光穩(wěn)定性使得UCNPs 成為一種理想的多光子示蹤探針。

圖4 （a）單個Yb3+、Er3+共摻的UCNPs 在980 nm 連續(xù)激光激發(fā)1 h 以上的發(fā)射強(qiáng)度時間軌跡（上圖）及其1 s 內(nèi)放大的時間軌跡和發(fā)射強(qiáng)度直方圖（下圖）［13］ ；（b）單個NaGdF4∶Yb3+，Er3+納米粒子在連續(xù)激光激發(fā)4 h 的上轉(zhuǎn)換時間軌跡及像［14］；（c）9 nm 核殼UCNPs 在連續(xù)激光激發(fā)下的上轉(zhuǎn)換發(fā)射時間軌跡［69］；（d）40 nm Yb3+、Tm3+共摻的UCNPs 在連續(xù)激光激發(fā)4 h 的像［82］。Fig.4 （a）Top：temporal trajectory of single Yb3+，Er3+ codoped UCNPs emission under continuous 980 nm irradiation for more than 1 h.Bottom：an amplified time trajectory within 1 s and the corresponding emission intensity histogram［13］.（b）Temporal trajectory and images of single NaGdF4∶Yb3+，Er3+ UCNPs upconversion emission under continuous excitation for 4 h［14］.（c）Upconversion emission temporal trajectory of 9 nm core-shell UCNPs irradiated by continuous laser［69］.（d）Upconversion images of 40 nm Yb3+，Tm3+ codoped UCNPs irradiated by continuous laser for 4 h［82］.

4.2.2 單顆粒上轉(zhuǎn)換的依賴性

Schietinger 等在關(guān)于UCNPs 單顆粒發(fā)光的尺寸依賴性的研究中表明，單個UCNPs 的發(fā)光強(qiáng)度和其尺寸明顯相關(guān)，且納米粒子的大小對綠色和紅色發(fā)射分支比（GRR）影響顯著[65]，如圖5（a）所示。

圖5 單顆粒上轉(zhuǎn)換依賴特性：（a）尺寸依賴特性[65]；（b）激活劑摻雜濃度依賴特性[63];（c）上轉(zhuǎn)換壽命尺寸依賴特性及各向異性[64] ；（d）核殼結(jié)構(gòu)對增強(qiáng)上轉(zhuǎn)換的功率依賴特性[67]；（e）Er3+最優(yōu)摻雜濃度對激發(fā)密度依賴的物理機(jī)制[12]。Fig.5 Dependency features of single UCNPs.（a）Size dependent feature[65].（b）Activator doping concentration dependent feature[63].（c）Upconverting luminescence lifetime dependent feature and heterogeneity[64].（d）Power dependent feature of core/shell structure for enhanced upconversion intensity[67].（e）Physical mechanism for power dependent Er3+ optimal doping concentration[12].

Zhao 等首次報(bào)道了高激發(fā)光功率密度下高激活劑摻雜濃度能夠?qū)崿F(xiàn)上轉(zhuǎn)換增強(qiáng)，見圖5（b）[63]。Gargas 等在單個UCNPs 的研究中首先揭示了粒子之間的各向異性，即對于一組尺寸相同的納米粒子，其綠光上轉(zhuǎn)換精細(xì)光譜表現(xiàn)出不同的躍遷強(qiáng)度分支比，這可能是稀土離子摻雜、表面缺陷等原因?qū)е碌?，如圖5（c）。此外，隨著粒子尺寸的減小，UCNPs 發(fā)射能級（如4S3/2）的壽命也相應(yīng)變短；有趣的是，激發(fā)光密度對發(fā)射壽命的影響也隨著粒子尺寸的減小而減小。這是因?yàn)樵谏限D(zhuǎn)換過程中，被激發(fā)到激發(fā)態(tài)上的電子在不同尺寸的粒子中，由于激活劑離子的絕對數(shù)量不同而導(dǎo)致的能量傳遞、再吸收和無輻射弛豫等過程的相對速率不同[64]。Liu 等通過單顆粒實(shí)驗(yàn)揭示了高激發(fā)光功率密度與低激發(fā)光功率密度下核殼結(jié)構(gòu)UCNPs 單顆粒上轉(zhuǎn)換發(fā)光的差異（見圖5（d）），提出上轉(zhuǎn)換發(fā)射強(qiáng)度受摻雜與激發(fā)光功率密度共同決定[67]。Tian 等在單顆粒研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)激發(fā)光功率密度大于400 W/cm2時，Er3+摻雜濃度提高能夠?qū)︼柡偷拿艋瘎┘ぐl(fā)態(tài)能級產(chǎn)生去飽和作用，見圖5（e），從而發(fā)光強(qiáng)度更高[12]。Gao 等通過對比不同尺寸、長徑比的單個NaYF4∶Yb3+,Ho3+（Er3+，Tm3+）微米棒，揭示了激發(fā)光入射角、激光功率密度對上轉(zhuǎn)換發(fā)光強(qiáng)度與光譜特征的影響[79,91]。Frenzel 等在單顆粒上轉(zhuǎn)換研究中發(fā)現(xiàn)，高激發(fā)光功率密度會使Er3+高能級的布居增加，導(dǎo)致出現(xiàn)400～500 nm 之間的發(fā)射[68]。此外，Kim 等研究表明，單個UCNPs 的發(fā)射強(qiáng)度對粒子中激活劑濃度的依賴性大于對敏化劑濃度的依賴性[83]。綜上，單顆粒上轉(zhuǎn)換輻射能級的布居與去布居速率對粒子尺寸、激活劑與敏化劑濃度、激發(fā)功率等存在著關(guān)鍵的依賴特性。在不同應(yīng)用領(lǐng)域，設(shè)計(jì)上轉(zhuǎn)換探針時需考慮這些內(nèi)在依賴特性。

4.2.3 單顆粒下核殼結(jié)構(gòu)對上轉(zhuǎn)換的影響

惰性殼層的引入和多層活性殼的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)可以有效增強(qiáng)單顆粒UCNPs 的發(fā)光強(qiáng)度和穩(wěn)定性，但是基于聚集體測量的結(jié)果不能直接應(yīng)用到單顆粒的增強(qiáng)方案中[64]。

Park 等對比了立方相和六方相NaYF4∶Er3+,Yb3+殼層包覆前后的單顆粒發(fā)光特性，證明了相同尺寸的納米粒子在包覆惰性殼后發(fā)光強(qiáng)度顯著提高[70]。激活劑與敏化劑離子的分布會對核殼結(jié)構(gòu)中的能量傳遞和發(fā)光強(qiáng)度產(chǎn)生重要影響，如圖6（a），Siefe等在NaYbF4@NaY0.8-xErxGd0.2F4@NaY0.8-Gd0.2F4上轉(zhuǎn)換納米粒子中，通過將核內(nèi)Yb3+濃度最大化來吸收近紅外光，通過調(diào)節(jié)中間殼層Er3+濃度實(shí)現(xiàn)高效的能量傳遞；同時，當(dāng)較高濃度Er3+占據(jù)中間殼層時，由激活劑離子向表面染料分子共振能量傳遞的效率提高[86]。

圖6 （a）通過核殼結(jié)構(gòu)分離Yb3+和Er3+增強(qiáng)上轉(zhuǎn)換及Er3+向表面染料分子的能量傳遞效率[86]；（b）不同功率密度下殼層Yb3+含量對上轉(zhuǎn)換發(fā)射強(qiáng)度的影響[87]；（c）不同核殼結(jié)構(gòu)在21.7 kW/cm2（上）和126 W/cm2（下）的上轉(zhuǎn)換強(qiáng)度[88]。Fig.6 （a）Yb3+ and Er3+ dopant separation realized by core/shell structure for enhanced upconversion efficiency and faster energy transfer toward dye molecules on the surface[86].（b）Upconversion intensity of UCNPs with different Yb3+ content in the shell at different power densities[87].（c）Upconversion intensities of different core-shell structures at 21.7 kW/cm2（top）and 126 W/cm2（bottom）[88].

Liu 等在單顆粒水平下對UCNPs 的核殼結(jié)構(gòu)開展了一系列研究工作，其一表明了低激發(fā)光功率密度下惰性殼層更有利于上轉(zhuǎn)換亮度增強(qiáng)而高激發(fā)光功率密度下Yb3+高摻的活性殼層能夠?qū)崿F(xiàn)更強(qiáng)的上轉(zhuǎn)換發(fā)射，如圖6（b）[87]；另一項(xiàng)工作分別對比了outside-in、inside-out 和local 三種激活劑、敏化劑分布情況不同的粒子，見圖6（c），實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明激活劑在核中、敏化劑在中間殼層、外殼層包覆惰性殼層的結(jié)構(gòu)最有利于上轉(zhuǎn)換，通過蒙特卡羅模擬推斷這是由于在這種結(jié)構(gòu)中敏化劑向激活劑離子遷移距離最短導(dǎo)致的[88]。雖然目前粒子設(shè)計(jì)方案不盡一致，但這些研究結(jié)果都表明結(jié)構(gòu)優(yōu)化是實(shí)現(xiàn)上轉(zhuǎn)換增強(qiáng)的有效方案。除此之外，通過配合其他材料能夠?qū)崿F(xiàn)單顆粒上轉(zhuǎn)換發(fā)光的進(jìn)一步增強(qiáng)。

4.2.4 單顆粒下表面等離子體共振局域場增強(qiáng)上轉(zhuǎn)換

貴金屬的表面等離子體共振局域場（LSPR）是增強(qiáng)UCNPs 上轉(zhuǎn)換量子效率的常見方法，這主要?dú)w因于表面等離子體共振產(chǎn)生的局部磁場具有強(qiáng)吸光性，并且可調(diào)的吸收特性使其很容易與上轉(zhuǎn)換吸收位置耦合[97]。

2010 年，Aichele 等首次報(bào)道了單顆粒下LSPR 增強(qiáng)上轉(zhuǎn)換的工作，如圖7（a），利用AFM 操控單個金納米球與單個上轉(zhuǎn)換納米粒子之間的距離，實(shí)現(xiàn)了上轉(zhuǎn)換2.7～4.8 倍的發(fā)光增強(qiáng)，同時證明了隨著距離的變化LSPR 的增強(qiáng)效果也會隨之變化[66]。2014 年，Greybush 等利用光刻技術(shù)一比一組裝了金納米棒和上轉(zhuǎn)換納米粒子，在不同方向的偏振光與激發(fā)光功率密度下對比了上轉(zhuǎn)換發(fā)光的增強(qiáng)系數(shù)[72]。

圖7 （a）AFM 操控單個金納米球增強(qiáng)單個納米粒子上轉(zhuǎn)換[66]；（b）單個金納米棒在不同角度偏振光下對上轉(zhuǎn)換的增強(qiáng)[72]；（c）單顆粒下金包覆的UCNPs 上轉(zhuǎn)換增強(qiáng)[71]；（d）金納米粒子負(fù)載增強(qiáng)單顆粒上轉(zhuǎn)換[78]。Fig.7 （a）AFM manipulated single gold nanoparticle for enhanced upconversion from single UCNP[66].（b）Enhancement effect of single gold nanorod-UCNP under different angle of polarized excitation[72].（c）Upconversion enhancement of gold layer coated single UCNP[71].（d）Enhanced upconversion realized by gold nanoparticle loading[78].

2017 年，Xue 等利用AFM 探針推動單個UCNPs 向金納米棒的軸向移動，討論了金納米棒對上轉(zhuǎn)換的極化增強(qiáng)效應(yīng)[90]。以生物成像應(yīng)用為目標(biāo)的等離子增強(qiáng)的上轉(zhuǎn)換對納米結(jié)構(gòu)的一體性存在基本要求，Lim 等設(shè)計(jì)了在包覆有SiO2墮性殼層的NaYF4∶Yb3+,Er3+外部增添Au 外殼層的結(jié)構(gòu)，通過調(diào)控金殼厚度將LSPR 共振峰調(diào)諧到近紅外區(qū)域，單顆粒測試證明了該結(jié)構(gòu)可以實(shí)現(xiàn)上轉(zhuǎn)換發(fā)光增強(qiáng)[71]，如圖7（c）。Clarke 等構(gòu)造了表面修飾有金納米粒子的核殼結(jié)構(gòu)UCNPs，在單顆粒測試下增強(qiáng)了上轉(zhuǎn)換發(fā)射強(qiáng)度5.5 倍，且最優(yōu)的惰性殼層厚度即金納米粒子與稀土離子間間距為10 nm[78]，如圖7（d）。目前，在貴金屬與上轉(zhuǎn)換的集成構(gòu)型下，等離子體局域場增強(qiáng)上轉(zhuǎn)換的效率較低，因此，實(shí)現(xiàn)高效的Au-UCNP 多光子探針優(yōu)化的組裝方案是未來研究的關(guān)鍵。

4.2.5 單顆粒上轉(zhuǎn)換納米粒子的極化發(fā)光

不僅金納米棒對上轉(zhuǎn)換發(fā)光具有極化增強(qiáng)效應(yīng)，對于非中心對稱的上轉(zhuǎn)換顆粒本身，其發(fā)光也具有偏振各向異性，即在特定的線偏振光激發(fā)下發(fā)射光譜線形隨之變化。這種上轉(zhuǎn)換發(fā)光的各向異性有利于創(chuàng)建偏振敏感的納米級光電探測器，可用于集成光子電路、光學(xué)開關(guān)和互連、近場成像和高分辨率探測器等[98]。

對上轉(zhuǎn)換偏振的研究主要集中在線偏振激發(fā)光對上轉(zhuǎn)換發(fā)射的極化作用。2013 年，Zhou 等在單顆粒水平下報(bào)道了β-NaYF4∶Yb3+,Tm3+上轉(zhuǎn)換發(fā)光的極化效應(yīng)。如圖8（a），通過對比不同長徑比的納米棒、納米盤的不同激發(fā)態(tài)躍遷在線偏振光激發(fā)下的偏振角-發(fā)射強(qiáng)度極坐標(biāo)圖，發(fā)現(xiàn)它們的偏振特性基本一致；但在摻雜30%的Gd3+后，其極坐標(biāo)圖發(fā)生了明顯變化，說明相比于外部形貌，晶格對稱性是影響上轉(zhuǎn)換發(fā)射極化性質(zhì)的主要因素[84]。

圖8 （a）Tm3+摻雜的單個亞微米柱狀上轉(zhuǎn)換晶體的躍遷偏振角-發(fā)射強(qiáng)度極坐標(biāo)圖[84]；（b）單個柱狀亞微米晶在不同入射方向下的上轉(zhuǎn)換極坐標(biāo)圖[80]；（c）單個柱狀亞微米晶在不同入射方向下的上轉(zhuǎn)換激發(fā)極化效應(yīng)機(jī)理[81];（d）正八面體上轉(zhuǎn)換微米晶在不同激發(fā)角度下的極坐標(biāo)圖[92].Fig.8 （a）Polar plots of Tm3+ doped single sub-microrod crystal[84].（b）Polar plots of single sub-microrod under different incident light directions[53].（c）Mechanism for different polar plot profiles of single sub-microrod under different incident light directions[81].（d）Polar plots of single sub-micro octahedra under different incident light directions[92].

隨后，如圖8（b），Chen 等在Er3+摻雜的NaYF4單個納米盤中對比了偏振光入射方向?qū)ι限D(zhuǎn)換極化發(fā)光的影響，提出當(dāng)入射光方向垂直于納米盤時才能產(chǎn)生明顯的極化作用，而當(dāng)入射光方向平行于納米盤時極化作用并不明顯[80]。Yang 等在β-NaYF4∶Yb3+,Pr3+六棱柱狀微米晶中進(jìn)一步研究了線偏振光對上轉(zhuǎn)換的極化作用原理，結(jié)合DFT 模擬揭示了垂直于激發(fā)光的電子云密度的對稱性是影響偏振效應(yīng)的關(guān)鍵因素，如圖8（c）[81]。Panov 等合成了LiYF4∶Yb3+,Er3+正八面體微米晶，通過光學(xué)陷阱實(shí)現(xiàn)對單個微米晶的空間方向進(jìn)行調(diào)控，如圖8（d）。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)正八面體空間方向與入射光軸夾角分別為56°和90°時，極化率常數(shù)分別為0.58 ±0.03 和0.71 ± 0.02，再一次證明了單顆粒上轉(zhuǎn)換發(fā)光的激發(fā)角度依賴特性[92]。

5 UCNPs 的單顆粒應(yīng)用

近年來，越來越多的單顆粒UCNPs 在溫度傳感、生物檢測、成像與示蹤等領(lǐng)域的優(yōu)秀研究成果被報(bào)道，說明單顆粒UCNPs擁有廣闊的應(yīng)用前景。

5.1 溫度測量

由于Er3+的2H11/2和4S3/2能級距離較近，位于較低的4S3/2能級的電子可被熱布居至2H11/2能級，因此2H11/2→4I15/2和4S3/2→4I15/2兩個綠光輻射躍遷的發(fā)射分支比與環(huán)境溫度存在特定的依賴關(guān)系。基于這一原理，如圖9（a），2016 年，Kilbane 等首次報(bào)道了單顆粒Er3+摻雜的UCNPs 在遠(yuǎn)場溫度傳感中的應(yīng)用[73]。在此基礎(chǔ)上，Pickel 等進(jìn)一步研究了單個NaYF4∶Yb3+,Er3+上轉(zhuǎn)換納米粒子中綠光發(fā)射分支比與激發(fā)光功率密度的關(guān)系，指出在高激發(fā)光功率密度下，Er3+的高能級布居增加，因此會影響4S3/2和2H11/2到4I15/2能級輻射躍遷強(qiáng)度分支比，進(jìn)而得出建立該分支比與環(huán)境溫度的依賴關(guān)系需以特定的激發(fā)光功率密度為前提的結(jié)論[74]。但由于水的吸收峰與980 nm 激發(fā)光位置重合，因此980 nm 激發(fā)光會導(dǎo)致水升溫，這會嚴(yán)重影響NaYF4∶Yb3+,Er3+單顆?；铙w溫度探測的準(zhǔn)確性。可用于生物介質(zhì)內(nèi)溫度傳感的單顆粒UCNPs 需基于其他具有熱布居能級的上轉(zhuǎn)換體系進(jìn)行設(shè)計(jì)開發(fā)[73]。

圖9 （a）單顆粒測溫[73]；（b）單顆粒計(jì)數(shù)用于PSA 濃度檢測[75]；（c）利用磁性小球修飾的上轉(zhuǎn)換探針及其通過單顆粒計(jì)數(shù)法對CEA 濃度的測定[77]；（d）活細(xì)胞內(nèi)長時間三維單顆粒UCNPs 追蹤[85]。Fig.9 （a）Single UCNPs for temperature measurement[73].（b）Single particle counting for PSA concentration detection[75].（c）Magnetic beads decorated UCNPs for CEA concentration detection using single particle counting technique[77].（d）In vivo long-term three-dimensional tracking of single UCNPs[85].

5.2 生物檢測、成像與示蹤

生物檢測方面，2018 年，Li 等利用抗原特異性結(jié)合原理，在抗原PSA 存在時能夠?qū)崿F(xiàn)UCNPPSA-金納米粒子的結(jié)構(gòu)、使游離的UCNPs 與金納米粒子相結(jié)合，由于UCNPs 與金納米粒子距離滿足FRET 共振能量傳遞距離，且金納米粒子吸收與UCNPs 的綠光發(fā)射位置相重合，因此該結(jié)構(gòu)中上轉(zhuǎn)換發(fā)光能夠被猝滅，如圖9（b）。在微流控通道中視野內(nèi)通過單顆粒計(jì)數(shù)法，實(shí)現(xiàn)了對低濃度PSA 的檢測，檢出限低至1.0 pmol·L-1，檢測濃度區(qū)間為0～500 pmol·L-1[75]。利用類似的原理，Wang 等設(shè)計(jì)了用于Cu2+檢測的Yb3+、Er3+摻雜UCNPs-BHQ1 探針，利用單顆粒測試技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了亞納摩爾-微摩爾超過三個數(shù)量級的檢測范圍，檢出限相對于集成檢測降低了7 個數(shù)量級，低至220 pmol·L-1[76]。Xu 等利用磁性篩選的原理構(gòu)造了檢測CEA 的UCNPs 探針，如圖9（c），通過互補(bǔ)的DNA 鏈將UCNPs 與磁性小球進(jìn)行組裝，CEA 的介入能夠打開DNA 雙鏈?zhǔn)苟叻蛛x，因此在磁場作用下游離的UCNPs 的數(shù)量與CEA 濃度成反比例關(guān)系；利用單顆粒計(jì)數(shù)的方法，CEA 的檢測范圍為0.1～30 pmol·L-1，檢出限為65 fmol·L-1[77]。Liu等設(shè)計(jì)了UCNPs-IR-798 探針，在全內(nèi)反射顯微鏡下通過單顆粒計(jì)數(shù)法測定NO2-濃度，并測試了該探針在Hela 細(xì)胞內(nèi)檢測NO2-濃度的可行性[89]。由于單個UCNPs 依賴于高度聚焦的激光（光斑直徑＜1 μm）、通過激光掃描進(jìn)行成像，這一技術(shù)需要樣品空間位置固定；目前大多數(shù)體外單顆粒檢測可以實(shí)現(xiàn)，而要實(shí)現(xiàn)對尺寸在微米及以上的細(xì)胞、組織甚至器官等活體內(nèi)運(yùn)動的單顆粒進(jìn)行實(shí)時追蹤，其難度較高。Wang 等通過透鏡調(diào)制激發(fā)光斑直徑至約5 μm 水平，成功實(shí)現(xiàn)了在A549 活細(xì)胞中對單個直徑約40 nm 的Tm3+摻雜UCNPs 的實(shí)時追蹤，如圖9（d）；通過對單顆粒遷移速度、擴(kuò)散系數(shù)等數(shù)據(jù)的分析，進(jìn)一步解析了顆粒所在的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)[85]。這一成果證實(shí)了單顆?；铙w示蹤的可行性。未來，基于UCNPs 探針發(fā)展單顆粒水平下的活體特異性檢測將為更高分辨率下乃至單分子水平生物醫(yī)學(xué)研究提供有力的技術(shù)支撐。

6 結(jié)論與展望

光學(xué)成像作為活體研究的重要手段存在著生物自發(fā)熒光背景干擾等問題，多光子成像由于特殊的發(fā)光物理過程，能夠有效避免背景噪聲的干擾；也正是由于多個光子的吸收實(shí)現(xiàn)一個光子的發(fā)射這一特殊物理過程，決定了多光子發(fā)光面臨量子效率低的關(guān)鍵問題，因此開發(fā)高效的多光子探針是發(fā)展多光子成像亟待解決的問題。能夠產(chǎn)生多光子發(fā)光的材料主要為部分能產(chǎn)生雙光子吸收或二次諧波的非線性光學(xué)材料，但是傳統(tǒng)有機(jī)熒光團(tuán)和半導(dǎo)體量子點(diǎn)在雙光子吸收或二次諧波所依賴的高激發(fā)光功率密度下化學(xué)穩(wěn)定性、光穩(wěn)定性較差，容易發(fā)生光漂白、光閃爍。上轉(zhuǎn)換納米粒子由于光、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定且稀土離子具有亞穩(wěn)態(tài)中間能級等特點(diǎn)，成為一種實(shí)現(xiàn)二階或高階非線性光學(xué)的理想材料。對UCNPs 的研究一般以粒子聚集體為對象，測試與研究條件與實(shí)際成像平臺在激發(fā)光功率密度等方面存在一定差別，而單顆粒成像平臺更接近于實(shí)際成像平臺。近年來對單顆粒研究的一系列成果表明，在這一研究水平下UCNPs 所表現(xiàn)出的光物理性質(zhì)與傳統(tǒng)聚集體測試所得出的一些結(jié)論不盡一致，因此在單顆粒水平下研究上轉(zhuǎn)換發(fā)光的激發(fā)光功率密度依賴、溫度依賴等特性，通過稀土離子摻雜濃度、核殼結(jié)構(gòu)、表面等離子局域場等提高上轉(zhuǎn)換量子效率，對實(shí)現(xiàn)高效上轉(zhuǎn)換多光子探針具有重要的理論意義。

目前，設(shè)計(jì)生物成像用上轉(zhuǎn)換納米探針仍對小尺寸下的高量子效率有著基本要求。這是因?yàn)樘岣呱限D(zhuǎn)換量子效率是解決因其效率低而衍生出來的一系列問題的鑰匙，比如因發(fā)射信號弱導(dǎo)致的探測器成本高的問題，因激發(fā)閾高導(dǎo)致的生物組織光損傷的問題，因聚焦激光光斑小導(dǎo)致的成像時間長、無法實(shí)現(xiàn)寬場成像的問題等。根據(jù)UCNPs 聚集體研究中積累的豐富經(jīng)驗(yàn)，通過核殼結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)、雜原子或空位引入、集成型等離子體增強(qiáng)、吸收天線引入等方法實(shí)現(xiàn)對能量傳遞、晶體場、局域場、激發(fā)光吸收等的有效調(diào)控，將為推動單顆粒下UCNPs 實(shí)現(xiàn)更高的量子效率奠定基礎(chǔ)。單顆粒UCNPs 在生物成像實(shí)際應(yīng)用中，雖然目前大部分工作主要局限于體外檢測，但是活體成像工作在調(diào)制的激發(fā)光斑下已經(jīng)實(shí)現(xiàn)。結(jié)合前期聚集體UCNPs 在成像、示蹤、藥物遞送、光熱治療等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用成果，設(shè)計(jì)開發(fā)具有多功能的異質(zhì)復(fù)合單顆粒UCNPs 將會助力其在生物應(yīng)用領(lǐng)域的飛速發(fā)展。

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